Summary
Este protocolo describe un método para el aislamiento del globo ocular del ratón con los segmentos del párpado, la superficie ocular, la anterior y la posterior en posición relativamente intacta.
Abstract
La superficie ocular (SA) consiste en una lámina epitelial con tres partes conectadas: conjuntiva palpebral, conjuntiva bulbar y epitelio corneal. La interrupción del sistema operativo conduciría a queratitis, conjuntivitis o ambos (queratoconjuntivitis). En modelos animales experimentales con ciertas modificaciones genéticas u operaciones artificiales, es útil examinar todas las partes de la hoja epitelial del sistema operativo para evaluar los cambios patogenéticos relativos de cada parte en paralelo. Sin embargo, la disección del tejido del sistema operativo en su conjunto sin distorsión o daño ha sido difícil, principalmente debido a la suavidad y delgadez del sistema operativo fijado para separar físicamente los párpados y el globo ocular. Además, la cavidad ocular profunda formada por el cráneo duro /huesos orbitales está completamente ocupada por el globo ocular dejando espacio limitado para operar disecciones. Como resultado, la disección directa del globo ocular con los tejidos asociados del sistema operativo desde el lado facial a menudo conduciría a daños tisulares, especialmente la conjuntiva palpebral y bulbar. En este protocolo, describimos un método para extraer el cráneo y los huesos orbitales secuencialmente de una cabeza de ratón biseced, dejando los párpados, la superficie ocular, la lente y la retina en una sola pieza. La integridad de la hoja del sistema operativo estaba bien preservada y podía ser examinada por histología o inmunomanchación en una sola sección.
Introduction
La superficie ocular consiste en una lámina continua de epitelio regionalizado incluyendo conjuntiva palpebral, conjuntiva bulbar y córnea1. Muchas estructuras glandulares están asociadas con el epitelio de la superficie ocular y juntos generan una capa de película lagrimal que protege la superficie de la córnea del secado y las invasiones ambientales2. La interrupción del sistema operativo conduciría a queratitis, conjuntivitis o ambos (queratoconjuntivitis). Tanto los factores genéticos como los irritantes ambientales o sus interacciones contribuyen a alteraciones patológicas del OS3,4. En consecuencia, una variedad de modelos animales genéticamente diseñados y inducidos física o químicamente se han utilizado para estudiar los procesos de enfermedad del sistema operativo humano.
La estructura y función del sistema operativo del ratón es similar a la de los seres humanos de muchas maneras. Los componentes de la película lagrimal secretados por las glándulas oculares también son similares entre ratones y humanos. Se han realizado una gran cantidad de estudios utilizando modelos de ratón para dilucidar mecanismos de enfermedades del sistema operativo humano5,6,7. En muchas ocasiones, es fundamental analizar los cambios moleculares globales en lugar de los cambios moleculares locales del sistema operativo para obtener información completa bajo el mismo tratamiento experimental. Por lo tanto, se necesita una preparación de la muestra con buena integridad para garantizar que cada parte del sistema operativo se analice simultáneamente.
El sistema operativo del ratón se asocia firmemente con el globo ocular que estaba incrustado en la cavidad del ojo / órbita (una taza ósea hecha de varios huesos del cráneo diferentes) y se conecta a él a través de los tejidos conectivos delgados. Existen enormes desafíos para disecar toda la superficie ocular sin dañar la conjuntiva palpebral o bulbar. Estos desafíos descienden de: (i) el sistema operativo es suave y delgado y se fija a los párpados y el globo ocular físicamente separados pero móviles, por lo tanto vulnerables a la distorsión y el daño; y (ii) el espacio limitado entre los huesos orbitales y el globo ocular restringen las operaciones de disección. Los desafíos son mucho mayores para el ratón adulto. En el ratón embrionario, la osificación ósea orbital no está completa y los tejidos circundantes son relativos sueltos8. La cabeza se puede quitar y bisecar, y luego directamente sometido a la fijación de paraformaldehído (PFA) e incrustar9. Por el contrario, los huesos orbitales postnatales y adultos del ratón están completamente osificados con tejidos circundantes gruesos, haciendo que la penetración de fijadores sea menos eficiente. Además, los huesos orbitales/cráneos son duros y quebradizos, fácilmente rotos al seccionarlos en los compuestos de incrustación suave como la parafina. Los trozos rotos de huesos desgarrarán unánimemente los tejidos cercanos, lo que resulta en una morfología de tejido inferior.
Muchos estudios publicados a menudo mostraron superficie ocular parcial, que puede ser suficiente para sus propósitos particulares de investigación10,11. Un examen bruto de las literaturas encontró sólo unos pocos estudios que muestran toda la superficie ocular intacta que se ha demostrado sin una descripción detallada de los protocolos de disección12,13. En este protocolo, detallamos un método de disección para obtener la superficie ocular postnatal integral, en la que los huesos orbitales y del cráneo fueron eliminados ordenadamente, dejando la superficie ocular intacta junto con el globo ocular y los párpados, minimizando los daños físicos. Examinamos más a fondo la histología del sistema operativo y realizamos inmunohistoquímica utilizando las secciones de tejido preparadas con este protocolo.
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Protocol
Todos los procedimientos relacionados con el uso de ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales, Centro Oftalmológico Zhongshan, y se adhirieron a la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftalmológica y de Visión.
1. Disección del globo ocular con superficie ocular intacta y párpados
- Disecciona la cabeza.
- Eutanasia ratones del día postnatal 10 (P10) y P28 (ver la Tabla de Materiales para las cepas de ratón) por luxación cervical, corta la cabeza del cuello con un par de tijeras afiladas.
- Cabezal de bisecta con un par de tijeras rectas a lo largo de la línea media sagital comenzando en el hueso interparietal rostrally a la nariz(Figura 1A,B).
NOTA: El hueso del cráneo se endurece con el envejecimiento del ratón, tenga cuidado de mantener las tijeras cortando a lo largo de la línea media tanto como sea posible. - Coloque cada mitad de la cabeza bisecada en un plato limpio de Petri, corte primero la mandíbula y la lengua usando tijeras afiladas. Libera el nervio óptico cortando el cerebro antes de la ubicación del quiasmo óptico, y elimina todos los tejidos cerebrales, incluyendo bulbo olfativo unido a la pared del cráneo.
- Ahora los tejidos restantes tendrán todos los huesos cráneo/orbital asociados con el globo ocular(Figura 1C,D). Lave la parte restante con PBS para limpiar la sangre y los desechos del cabello.
- Prefije los tejidos con 4% de paraformaldehído (PFA, en solución salina con fosfato almacenado en fosfato [PBS], pH 7.4) en un tubo cónico de 50 ml a temperatura ambiente (RT) con rotación. El tiempo aproximado de fijación es el siguiente: 10 min para P0 a P7; 20 min para P8 a P28; y 30 min para P29 y mayores.
NOTA: El prefijo ofrece rigidez tisular facilitando la disección subsiguiente. Además, la prefijo evita dejar el tejido fresco sin fijar demasiado tiempo antes de que se complete la disección.
ADVERTENCIA: La PFA es peligrosa y debe manipularse con cuidado.
- Retire el cráneo/huesos orbitales.
- Después de la prefijo, lave rápidamente la cabeza diseccionada en PBS tres veces para eliminar aún más los pelos rotos y fijadores con el fin de proceder con la disección adicional.
ADVERTENCIA: La exposición a fijadores durante la disección puede ser perjudicial para la salud. - Coloque el tejido en la placa Petri de 10 cm, corte el cráneo en tres partes a lo largo de los planos indicados en la Figura 1D,E. El globo ocular en la cavidad está oculto en la parte media del cráneo bajo huesos etodotidos, frontales y maxilares(Figura 1D,E).
- Utilice dos pares de fórceps rectos No. 4 para despegar el hueso etodoide para exponer completamente los huesos frontales y maxilares(Figura 1F).
- Divida geográficamente la superficie del cráneo (incluidos los huesos maxilares y frontales) en 4 áreas(Figura 1F). Inserte la punta de los fórceps curvos horizontalmente en cada área para eliminar secuencialmente los huesos maxilar y frontal(Figura 1F).
NOTA: Los huesos maxilares no se pueden quitar todos a la vez. Diseccionarlos pacientemente pieza por pieza. El hueso frontal está conectado directamente al globo ocular a través de tejidos conectivos blandos. Tenga cuidado al extraerlo del globo ocular para evitar que se estire el globo ocular y dañe la conjuntiva. - Después de la eliminación del hueso maxilar parcial y todo el hueso frontal, los huesos lagrimales y yugales subyacentes estarían expuestos(Figura 1G). Retire los dos huesos y los músculos subcutáneos asociados y las grasas que rodean el globo ocular, recorte el globo ocular con los párpados unidos y la piel en un pequeño bloque de forma cuadrada para reducir el volumen del tejido y facilitar la orientación del tejido al incrustar(Figura 1 H).
- Coloque el globo ocular y los tejidos asociados de nuevo en 4% de PFA y continúe reparando durante la noche a 4 oC. El tejido fijo se puede conservar durante al menos un mes a 4 oC en PBS con adición de 0,02% NaN3. Alternativamente, proceda al análisis histológico inmediatamente.
NOTA: Si el tejido necesita ser almacenado durante períodos más largos, se puede almacenar fácilmente en 70% etanol.
- Después de la prefijo, lave rápidamente la cabeza diseccionada en PBS tres veces para eliminar aún más los pelos rotos y fijadores con el fin de proceder con la disección adicional.
2. Análisis histológico
- Sección de parafina y tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
- Siga el protocolo estándar descrito en otro lugar9 para realizar la incrustación y seccionamiento de parafina.
- Inmunohistoquímica (IHC)
- Dewax las secciones de parafina con xileno y rehidratar las secciones a través de series de alcohol (100%, 95%, 80%) en agua destilada (dH2O).
- Realizar la recuperación de antígenos mediante el tratamiento por microondas de los portaobjetos de tejido en un tampón de ácido cítrico de 0,01 M (3 g de citrato de trisódico, 0,4 g de ácido cítrico por 1 L de doble destilado H2O) en un frasco deslizante de vidrio con baja potencia (120 W). La energía debe entregarse intermitentemente durante un total de 5-10 minutos con cada intervalo que dura aproximadamente 2 min.
NOTA: El microondas de alta potencia o el calentamiento constante conducirían a la desprendimiento de secciones de tejido de la diapositiva. - Escoja los portaobjetos del frasco de vidrio, limpie cuidadosamente el líquido residual que rodea cada sección usando tejidos faciales y colóquelos en el portaobjetos en una caja de histología. Dibuja un cuadrado alrededor de cada sección con un bolígrafo histológico impermeable. Coloque 100 sL de tampón de bloqueo (0,1% triton X-100 y 10% de suero de burro en 1x PBS) en cada cuadrado, e incubar durante 30 minutos en RT.
- Retire cuidadosamente la solución de bloqueo con vacío, añada el anticuerpo primario (ver la Tabla de Materiales)con la dilución deseada en el tampón de bloqueo y continúe incubando las diapositivas a 4oC durante 24 h o más.
NOTA: La concentración de cada anticuerpo primario utilizado para IHC varía y debe probarse en experimentos piloto. - Lave los portaobjetos con PBST (0,1% Tritón en PBS) tres veces, durante 10 minutos cada uno. Repita el paso 2.2.4 utilizando el anticuerpo secundario (ver Tabla de Materiales)junto con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) reemplazando el tampón de bloqueo. Continúe incubando durante al menos 4 h o más a temperatura ambiente (RT).
- Retire el anticuerpo secundario, lave las secciones de tejido con la solución PBST tres veces, durante 10 minutos cada una, luego lave con PBS limpio durante otros 5 minutos.
- Limpie las secciones residuales de tejido circundante súbditos de PBS, monte los cubreobjetos en las secciones con el medio de montaje. Realizar microscopía fluorescente para obtener imágenes (ver la Tabla de Materiales).
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Representative Results
Los huesos principales del cráneo vistos desde diferentes perspectivas fueron ilustrados en la Figura 1A-E,con colores que denotan diferentes huesos. Usamos animales de cuatro semanas para la demostración de los procesos de disección. Siguiendo los pasos de disección 1.1.1-1.1.3 y una breve prefijoación (paso 1.1.4), el globo ocular con los huesos faciales asociados se muestran en la Figura 1E. Recorte adicional para eliminar anterior (nasal y premaxilar) y posterior (por ejemplo, parietal) así como huesos etmoide generados bloque de tejido con principalmente huesos maxilares y frontales en la parte superior del globo ocular(Figura 1F). Extirpación secuencial de estos huesos de acuerdo con las áreas designadas en la Figura 1F expuesto huesos lagrimales y yugales subyacentes, así como glándula Harderin (Figura 1G). La glándula Harderin unida al globo ocular sirvió como punto de referencia(Figura 1G),y debe mantenerse en su lugar en todo momento. El aislamiento del globo ocular se completó mediante la eliminación de todos los huesos y grasas circundantes y tejidos musculares(Figura 1H).
Después de la incrustación de parafina, el globo ocular fue seccionado y H&E-teñido. Las imágenes representativas se muestran en la Figura 2. Las posiciones relativas intactas de los párpados, la superficie corneal y conjuntival se visualizaron en una sección(Figura 2A),partes de las cuales se magnificaron en la Figura 2B,C. La morfología de la lente es difícil de mantener(Figura 2A)debido a su rigidez y fragilidad. Aplicamos este método de disección a otras edades posnatales y mostramos un ejemplo de histología de H&E de la sección de globo ocular P10(Figura 3). En general, cuanto más joven es el ratón, mejor se conserva la morfología del globo ocular. Las secciones de parafina inmunomancha de las edades postnatales en serie se muestran en la Figura 4,con queratina 12 (K12)(Figura 4A-F) y queratina 14 (K14)(Figura 4G-L) que tiñen la córnea y el epitelio completo del sistema operativo, Respectivamente.
Figura 1: Ilustración de la disección del globo ocular en ratón adulto de 4 semanas de edad. (A-D) El diagrama esquemático de la composición del cráneo vista desde la parte superior (A), inferior (B), lateral (C) y plano medio (D), respectivamente. Las líneas discontinuas en (A) y (B) indican planos bisectados. (E) Medio cráneo biseced a las 4 semanas de edad que coincide exactamente con (D). (F) Vista medial del plano de tejido diseccionado entre los dos planos transversales en (D) y (E). El globo ocular (círculo discontinuo) estaba incrustado principalmente debajo del frontal (Fron) y maxilar (Max). Las líneas discontinuas de colores dividen geográficamente el plano bisectado en 4 áreas, en las que los huesos se eliminaron aproximadamente según el orden o los números. Tenga en cuenta que se ha eliminado el hueso etodoide (Eth). (G) Después de la extirpación del hueso frontal y maxilar parcial, se expusieron la glándula Harderin (Har) y el yugal (Jug) y los huesos lagrimales (La). Las líneas discontinuas circulares indican la posición del globo ocular. (H) Globo ocular aislado visto desde el interior después de la disección completada. La flecha apunta al nervio óptico (On). E - Ojo, Na , Nasal, Pre- Premaxilar, Máximo, Maxilar, La - Lacrimal, Fron - Frontal, Ali - Alisphenoid, Jarra , Yugal, Pal - Palatino, Pterygoid, Squ - Escamoso, Par - Parietal, Et. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Histología H&E del tejido de la superficie ocular a 4 semanas de edad. (A) El párpado, la conjuntiva y la córnea se visualizan en una sección de tejido. Las áreas en caja de "b" y "c" se magnificaron en las (B) y (C), respectivamente. (B) El epitelio de la córnea, estroma y endotelio. (C) La conjuntiva con células de copa. ce á epitelio de córnea, st á estroma, ed á endotelio, gc - célula de golondor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Histología H&E del tejido de la superficie ocular en el día 10 postnatal. (A) Globo ocular intacto en P10. Las áreas en caja de "b" y "c" se magnificaron en las (B) y (C), respectivamente. (B) La córnea. C) La conjuntiva. Ce á epitelio de córnea, st á estroma, ed á endotelio, cj á conjuntiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Inmunostación de la superficie ocular de P5 a P15. El área en caja cuadrada en cada panel se magnificaba a su derecha. (A-F) La queratina 12 se expresa específicamente en el epitelio de la córnea (flechas). (G-L) La queratina 14 expresada en la superficie ocular. ac - cámara anterior, pc - conjuntiva palpebral. Esta cifra fue modificada de una publicación anterior Guo et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un recordatorio crítico para la preparación del globo ocular intacto es que todos los huesos orbitales deben ser eliminados por completo, especialmente los huesos juga y lagrimal, que son pequeños y se encuentran cerca de la parte inferior de la cavidad ocular. Cualquier hueso sobrante puede complicar la histología subsiguiente. En caso de que un pequeño trozo de hueso no se haya eliminado por completo de la disección por accidente, puede ser recogido del bloque de parafina de incrustación utilizando un par de pinzas afiladas. El agujero dejado atrás debe llenarse con parafina derretida después de esta operación.
Se debe tener precaución adicional al manipular la lente. Los trozos rotos de la lente generalmente se dispersan por toda la sección. Esto afectará considerablemente al examen por microscopía y al análisis de imágenes. Los intentos de quitar la lente dañarían la superficie ocular (si la operación se llevó a cabo desde el lado facial) o la retina (si la operación fue desde el lado del disco óptico de la retina). Una forma alternativa de reducir el impacto negativo de la presencia de tejido de la lente sin disección es cambiar las direcciones de seccionamiento. Por ejemplo, para salvar la morfología de la superficie ocular, la sección del bloque de parafina debe realizarse desde la anterior del globo ocular hasta la posterior, de lo contrario, desde la dirección opuesta.
Una nota útil para la sección de parafina fija con PFA es que la recuperación de antígenos suele ser necesaria para la inmunomancha, como el uso de anticuerpos K12 y K14. Sin embargo, hay muchas excepciones que la recuperación de antígenos generaría señales no específicas que aumentan la tinción de fondo. Por lo tanto, uno debe tener cuidado al usar la tecnología de recuperación de antígenos, y debe probar anticuerpos en experimentos piloto si es posible, de antemano.
En general, hay dos métodos para el aislamiento del globo ocular del cráneo/huesos orbitales: (i) diseccionar directamente el globo ocular del lado facial; y (ii) extraer el interior del cráneo/huesos orbitales para liberar el globo ocular. El desafío para el primer método es que el globo ocular se hunde profundamente en la cavidad orbital con un espacio estrecho en el medio para la disección. Además, el globo ocular móvil estiraría el epitelio conjuntiva en un momento dado cuando las herramientas de disección lo tocaran, creando daños no intencionales. Por el contrario, el segundo método comienza con la disección de los huesos del cráneo/orbital, que están más lejos del globo ocular y del tejido de la superficie ocular asociado, reduciendo así el riesgo de dañar la conjuntiva. Además, no hay constricciones espaciales para realizar disecciones. A pesar de que el primer método puede funcionar si se tomaron grandes precauciones, el segundo es definitivamente más fácil y mejor.
En resumen, hemos descrito un método para el aislamiento del globo ocular del ratón con el párpado intacto y la superficie ocular asociada de los ratones postnatales. El protocolo descrito es adecuado para el aislamiento del globo ocular con párpados intactos y tejidos oculares asociados en ratones postnatales. El protocolo es especialmente útil cuando se requiere la integridad del sistema operativo o de tejidos oculares enteros. Hemos utilizado este método para preparar muestras de tejido para el examen de marcadores de queratina en el sistema operativo en condiciones normales y patológicas. Concluimos que los tejidos oculares de tales preparaciones son particularmente útiles para examinar las regulaciones diferenciales de una proteína en diferentes partes del sistema operativo en una sola sección.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al profesor Rong Ju por la lectura crítica del manuscrito, y a todos los miembros del laboratorio por la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Beijing, China), el Proyecto de Innovación en Ciencias y Tecnologías de Guangzhou (201707020009; Guangzhou, provincia de Guangdong, China), "100 People Plan" de la Universidad Sun Yat-sen (8300-18821104; Guangzhou, provincia de Guangdong, China), y financiación de investigación del Laboratorio Estatal Clave de Oftalmología en el Centro Oftalmológico Zhongshan (303060202400339; Guangzhou, Provincia de Guangdong, China).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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