Neuroscience

Lichtinduzierte molekulare Adsorption von Proteinen mit dem PRIMO-System für Mikro-Patterning zur Untersuchung von Zellreaktionen auf extrazelluläre Matrixproteine

Published: October 11, 2019 doi: 10.3791/60092

Cristina Melero*¹, Aljona Kolmogorova*¹, Paul Atherton¹, Brian Derby², Adam Reid^3,4, Karin Jansen⁵, Christoph Ballestrem¹

¹Faculty of Biology, Medicine and Health. Division of Cell Matrix, Biology and Regenerative Medicine, Wellcome Trust Centre for Cell-Matrix Research, The University of Manchester, ²School of Materials, The University of Manchester, ³Blond McIndoe Laboratories, School of Biological Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, Division of Cell Matrix Biology and Regenerative Medicine, The University of Manchester, Manchester Academic Health Science Centre, ⁴Department of Plastic Surgery & Burns, Wythenshawe Hospital, Manchester University NHS Foundation Trust, Manchester Academic Health Science Centre, ⁵Department of Pathology, UMC Utrecht

* These authors contributed equally

Summary

Unser übergeordnetes Ziel ist es zu verstehen, wie Zellen extrazelluläre Hinweise spüren, die zu einem gerichteten axonalen Wachstum führen. Hier beschreiben wir die Methodik der lichtinduzierten molekularen Adsorption von Proteinen, die verwendet wird, um definierte Mikromuster von extrazellulären Matrixkomponenten zu produzieren, um spezifische Ereignisse zu untersuchen, die das Axonwachstum und die Pfadfindung steuern.

Abstract

Die Zellen spüren eine Vielzahl von extrazellulären Cues, einschließlich der Zusammensetzung und Geometrie der extrazellulären Matrix, die von den Zellen selbst synthetisiert und umgestaltet wird. Hier stellen wir die Methode der lichtinduzierten molekularen Adsorption von Proteinen (LIMAP) unter Verwendung des PRIMO-Systems als Mustertechnik zur Herstellung mikrogemusterter extrazellulärer Matrixsubstrate (ECM) unter Verwendung einer einzigen oder Kombination von Proteinen vor. Das Verfahren ermöglicht das Drucken von ECM-Mustern in Mikron-Auflösung mit hervorragender Reproduzierbarkeit. Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verfügung und zeigen, wie dies angewendet werden kann, um die Prozesse der neuronalen Pfadfindung zu untersuchen. LIMAP hat erhebliche Vorteile gegenüber bestehenden Mikrodruckverfahren in Bezug auf die einfache Musterung von mehr als einer Komponente und die Möglichkeit, ein Muster mit einer beliebigen Geometrie oder einem Farbverlauf zu erzeugen. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um den Beitrag fast jeder chemischen Komponente zum Zellschicksal und Zellverhalten zu untersuchen. Schließlich diskutieren wir gemeinsame Fragen, die auftreten können und wie diese vermieden werden können.

Introduction

In den letzten Jahren haben die biologischen Wissenschaften zunehmend von den Fortschritten der Materialwissenschaften Gebrauch gemacht. Ein prominentes Beispiel ist die Mikro-Musterung von Substraten, die verwendet werden können, um zelluläre Reaktionen wie Zellproliferation zu untersuchen.¹^,²Differenzierung³^,⁴^,⁵^,⁶, Zellmigration⁷^,⁸^,⁹und Pathfinding¹⁰^,¹¹. Es gibt eine Reihe von Techniken, die die Mikro-Musterung von Substraten ermöglichen, wie z. B. Multiphotonen-aufgeregte Photochemie¹², AFM Dip-Pen-Nanolithographie¹³, Pin- und Inkjet-Direktdruck¹⁴, Elektronenstrahllithographie¹⁵oder Mikrofluidik¹⁶. Zwei Techniken, die im biologischen Bereich weit verbreitet sind, sind jedoch der Mikrokontaktdruck¹⁷^,¹⁸^,¹⁹oder laserunterstützte Musterung³(Abbildung 1). Laserunterstützte Musterung gilt als zuverlässigere Ergebnisse in Bezug auf Protein- und PEG-Stabilität und Zelleinschließung auf den Mustern im Vergleich zum Mikrokontaktdruck²⁰. Ein neuerer Ansatz für die Mikromusterung, der hier beschrieben wird, ist die Verwendung der lichtinduzierten molekularen Adsorption von Proteinen.²¹(LIMAP,Abbildung 1 D) mit einem handelsüblichen System (PRIMO,Materialtabelle). Jede der Methoden hat Vorteile und Einschränkungen, die im Folgenden kurz beschrieben werden. Microcontact-Druck verwendet PDMS-Formen (Stempel) mit gewünschten Mikro-Features, die von lithographierten Mastern generiert werden. Die Stempel werden mit einem ausgewählten Protein inkubiert, das dann auf das Zellkultursubstrat übertragen (gestempelt) wird.¹⁸(Abbildung 1 pro). Laserunterstützte Musterung verwendet UV-Licht, um einen Anti-Fouling-Film zu spalten²²^,²³^,²⁴^,²⁵, die Regionen freilegen, die anschließend mit dem Protein von Interesse beschichtet werden können (Abbildung 1 B). Während die mit Fotomusteransätzen erreichte Auflösung im Mikronbereich liegt,²⁵^,²⁶, erfordern die meisten dieser Techniken eine Fotomaske, entweder in Kontakt mit der Probe oder in der Objektebene des Mikroskopobjektivs²³^,²⁷^,²⁸. Die Anforderungen an Masken sowohl beim Mikrokontaktdruck als auch beim Fotomustern können eine Einschränkung sein; Für jedes geometrische Muster und jede Größe sind spezifische Masken erforderlich, die teuer und zeitaufwändig sein können. Im Gegensatz zu diesen Techniken benötigt LIMAP keine Maske (Abbildung 1 D). Die Verwendung des PRIMO-Systems für LIMAP kann von Anfang an kostenintensiv sein, da es den Kauf von Geräten erfordert. Open-Source-Software wird jedoch verwendet, um Muster jeder gewünschten Geometrie zu entwerfen, was viel mehr Freiheit bietet und komplexere Experimente ermöglicht, einschließlich der Verwendung von Proteinkonzentrationsgradienten. Der PRIMO-Laser wird von einem digital gesteuerten Mikrospiegelgerät (DMD) gesteuert und geleitet, um Muster in beschaffenen Geometrien zu erstellen. LIMAP erfordert, dass die Kulturoberfläche mit Molekülen beschichtet wird, die eine Zellanhaftung verhindern. Polyethylenglykol (PEG) wird am häufigsten als solches "Antifouling"-Reagenz verwendet; es bildet eine dichte Anti-Klebefolie auf der Glas- oder Kunststoffoberfläche²⁹. Anschließend wird ein Fotoinitiator hinzugefügt, der es ermöglicht, den PEG-Film mit hoher Präzision durch einen Photocissionsmechanismus zu entfernen.³⁰durch lokale Exposition gegenüber UV-Licht unter der Kontrolle des DMD. Diese PEG-freien Regionen können mit Proteinen beschichtet werden, die auf die lasergeätzte Oberfläche adsorbieren und ein Mikromuster erzeugen. Durch Variation der Laserleistung können verschiedene Mengen von PEG von der Oberfläche entfernt werden, so dass der Benutzer Proteingradienten erzeugen kann. PEG-Entfernung und das Beschichtungsverfahren können wiederholt werden, um Muster mit zwei oder mehr unterschiedlichen Proteinen im selben Mikrobrunnen zu erstellen²¹. Die erzeugten Mikromuster bieten Klebeflächen für Zellen, die die Untersuchung des Zellverhaltens ermöglichen. In unseren Studien verwenden wir Mikromuster, um die Neuriten- oder Axon-Pfadfindung einer neuronalen Zelllinie (CAD (Cad (Cathecholaminergic-a differentiated)³¹) bzw. primäre Mundrat-Dorsal-Wurzel-Ganglion (DRG)-Neuronen. Hier legen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für LIMAP (Abbildung 2) mit dem handelsüblichen PRIMO-System und der dazugehörigen Leonardo-Software. Wir zeigen, wie es für die Erzeugung von Mustern mit definierten Geometrien und mehreren Proteinen verwendet werden kann, die wir verwenden, um axonale Pathfindungen zu untersuchen. Wir diskutieren gemeinsame Fragen, die auftreten können und wie diese vermieden werden können.

Protocol

1. Gestaltung von Mustervorlagen

HINWEIS: Vorlagen für die Musterung werden mit digitaler Zeichensoftware (Tabelle der Materialien) generiert. Das Zeichnen in verschiedenen Graustufen bestimmt die Laserintensitäten. Die Verwendung von Software zum Entwerfen von Mustervorlagen ermöglicht die schnelle Generierung von Mustern mit jeder gewünschten Geometrie und Farbverläufen (Abbildung 3).

Zeichnen Sie die gewünschte Mustervorlage digital mit Derzeichnungssoftware. Wählen Sie eine Bildgröße von 1824 PixelLänge und 1140 Pixel Breite (was in dieser Studie 415 'm Länge und 260 'm Breite entspricht). Speichern Sie die Mustervorlage als 8-Bit-Tiff-Datei.
HINWEIS: Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zum Generieren von Vorlagen ist auf Anfrage für die Marke erhältlich, die die Mikro-Muster-Ausrüstung (Tabelle der Materialien) vermarktet.

2. Plasmareinigung

HINWEIS: Optimale Ergebnisse erfordern eine Plasmareinigung der Oberflächen vor dem Mustern, die alle organischen Stoffe entfernt und die Oberfläche aktiviert. Im vorliegenden Fall reicht die Umgebungsluft für die Oberflächenaktivierung aus. Ein Plasmareiniger (Materialtabelle) wurde mit einem Prozessdruck von 1000-1300 mTorr und einer Leistung von 29,6 W für 1-5 min verwendet.

Verwenden Sie Glasbodenschale/-es mit einer 20 mm innen well Größe und Glasdicke von 0,16-0,19 mm. Verwenden Sie zum Testen mehrerer Bedingungen eine 6-Well-Glas-Bodenschale. Andernfalls verwenden Sie eine einzige Gutglas-Bodenschale (Tisch der Materialien).
HINWEIS: Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Plasmareinigung ist auf Anfrage für die Marke erhältlich, die die Plasmareinigungsgeräte (Tabelle der Materialien) vermarktet.

3. Passivierung

HINWEIS: Dieser Schritt erzeugt einen Antifouling-Film, der eine Proteinadsorption auf die Glasoberfläche verhindert. PEG bietet eine hohe Resistenz gegen Proteinadsorption²⁹ als Antifouling-Mittel. LIMAP verwendet einen Fotoinitiator, um PEG lokal durch UV-Photoscission zu entfernen. Das/die von Interesse sind protein-/s adsorbieren dann auf diese PEG-freien Oberflächen²¹und erzeugen Mikromuster.

Passivierung mit PLL-PEG
1. Schneiden Sie unter sterilen Bedingungen die PDMS-Schablonen (siehe Abbildung 4A,B und Materialtabelle),um sicherzustellen, dass sie gut in den inneren Glasboden passen, und entfernen Sie die inneren Mikrobrunnenfüllungen mit sterilen Zangen. Kleben Sie Schablonen mit Zangen gut auf das Glas.
2. Stellen Sie sicher, dass die Schablonen fest auf dem Glasbrunnen kleben, wodurch die Bildung von Luftblasen verhindert wird, die leckagen während des Passivierungsprozesses verursachen können.
  HINWEIS: PDMS Schablonen können auch intern mit den veröffentlichten Protokollen¹⁸^,³²hergestellt werden.
3. Vorbereiten der PLL-PEG-Lösung (Materialtabelle, 0,1 mg/ml) in phosphatgepufferter Saline (PBS). Fügen Sie jedem Mikrobrunnen 20 l PLL-PEG-Lösung hinzu und brüten bei Raumtemperatur für 1 h.
4. Entfernen Sie 15 l PLL-PEG aus den Mikrobrunnen und waschen Sie sie fünfmal mit 20 l PBS (Materialtabelle), ohne sie trocknen zu lassen.
  HINWEIS: Lassen Sie immer ca. 5 l PBS zwischen den Wässen. Aufgrund ihres geringen Volumens sind die Mikrobrunnen besonders anfällig für Trocknung. Die Trocknung führt zu Mikromustern von schlechter Qualität.
5. Halten Sie das Kulturgericht entweder in PBS (3 ml pro Brunnen) bis zu 3 °C bei 4 °C oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort (Schritt 3.1.5).
6. Entfernen Sie 18 l PBS aus einem einzigen Mikrobrunnen (z. B. oben links Mikrobrunnen, siehe Abbildung 4D), fügen Sie 5 l Photo-Initiator (PLPP, Materialtabelle)hinzu und lassen Sie 20 L PBS in den verbleibenden Mikrobrunnen. Dieser Mikrobrunnen mit PLPP wird verwendet, um während des Systemkalibrierungsschritts (Schritt 4) ein Referenzmuster zu erstellen (siehe Abbildung 4D,E). Halten Sie PLPP vor Licht geschützt.
Passivierung mit langlebigem PEG-SVA
HINWEIS: Zur Erzeugung der Antiklebefläche kann man verwenden: 1) ein PEG, das mit Poly-L-Lysin (PLL-PEG, Schritt 3.1) oder 2) einem PEG-Succinat N-Hydroxisuccinimid (PEG-SVA) verbunden ist. Die Entscheidung, die eine oder andere Passivierungsoption zu wählen, hängt von den Speicheroptionen ab (siehe Schritt 10). Kulturgerichte, die mit PEG-SVA inkubiert werden, erfordern eine doppelte Passivierung und Fotomusterzeit.
1. Bereiten Sie Schablonen wie in Schritt 3.1.1 beschrieben vor.
2. Fügen Sie jedem Mikrobrunnen 20 l von 0,01 % Poly-L-Lysin (PLL, Materialtabelle) hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 30 min in vorschichten mit PLL.
3. Entfernen Sie 15 l PLL aus den Mikrobrunnen und waschen Sie sie dreimal mit 20 l von 1 m HEPES-Puffer(Materialtabelle), ohne die Brunnen austrocknen zu lassen.
  HINWEIS: Lassen Sie immer ca. 5 l HEPES oder PBS zwischen den Wässen. Aufgrund ihres geringen Volumens sind die Mikrobrunnen besonders anfällig für Trocknung. Die Trocknung führt zu Mikromustern von schlechter Qualität.
4. Bereiten Sie die PEG-SVA-Lösung vor. DIE PEG-SVA-Lösung (50 mg/ml im HEPES-Puffer 1M) sollte jedes Mal unmittelbar vor gebrauch frisch zubereitet werden. Bereiten Sie 20 l PEG-SVA pro Mikrobrunnen vor.
5. Der HEPES-Puffer muss einen pH-Wert zwischen 8-8,5 haben. Testen Sie DEN pH-Wert von HEPES vor der Vorbereitung der PEG-SVA-Lösung mit pH-Papier. Wiegen Sie PEG-SVA in einem Zentrifugenrohr mit einer Präzisionsskala. Fügen Sie HEPES Puffer und Wirbel 30 s, bis aufgelöst. PEG-SVA wird vollständig aufgelöst, wenn die Lösung transparent ist.
  HINWEIS: SVA ist der Ester, der die Bindung von PEG an die zuvor beschichtete PLL ermöglicht. Sobald der HEPES-Puffer dem PEG-SVA hinzugefügt wurde, hat die SVA eine Halbwertszeit von 15 min und sollte sofort verwendet werden.
6. Fügen Sie jedem Mikrobrunnen 20 L PEG-SVA-Lösung hinzu und brüten bei Raumtemperatur für 1 h. 15 l PEG-SVA aus den Mikrobrunnen entfernen und fünfmal mit 20 l PBS (Materialtabelle) waschen, ohne die Brunnen austrocknen zu lassen.
7. Bereiten Sie das Kulturgericht entweder für die Langzeitlagerung vor (bis zu 1 Monat, siehe Schritt 10.2) oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort (Schritt 3.2.8).
8. Entfernen Sie 18 l PBS aus einem einzigen Mikrobrunnen (z. B. oben links Mikrobrunnen, siehe Abbildung 4D), fügen Sie 5 l PLPP (Materialtabelle)hinzu und lassen Sie 20 L PBS in den verbleibenden Mikrobrunnen. Dieser Mikrobrunnen wird verwendet, um ein Referenzmuster zu erstellen (siehe Fi gure 4D, E). Stellen Sie sicher, dass PLPP auf der gesamten Oberfläche des Mikrobrunnens homogen ist. Halten Sie PLPP vor Licht geschützt.

4. Systemkalibrierung

HINWEIS: In diesen Schritten wird der Fokus des Lasers an die jeweilige Art der Kulturschale angepasst (Schritt 4.1). Ein Referenzmuster wird in nur einem Mikrobrunnen (Schritt 4.2) erzeugt, gefolgt von einer Inkubation mit einer Proteinlösung (Schritt 4.3), um die optimalen Fokusbedingungen des Lasers (Schritt 4.4) zu gewährleisten, die notwendig sind, um scharfe und definierte Muster zu erhalten.

Laserkalibrierung
ANMERKUNG: Während des Kalibrierungsprozesses wird ein Kalibrierlaserbild auf eine fluoreszierend hervorgehobene Glasoberfläche projiziert (Kalibrierbrunnen, gekennzeichnet mit einem fluoreszierenden Highlighter, Abbildung 4C), der in den Fokus auf die mikroskop.
1. Verwenden Sie einen fluoreszierenden Highlighter (Tabelle der Materialien), um einen leeren inneren Glasbrunnen zu markieren.
  HINWEIS: Der Kalibrierbrunnen muss die gleiche Glasdicke (0,16-0,19 mm) aufweisen wie die Kulturschale, auf der Mikromuster erzeugt werden. Wenn eine 6-Well-Glas-Bodenschale verwendet wird, kann ein leerer Brunnen für die Kalibrierung verwendet werden und sollte unter sterilen Bedingungen mit fluoreszierendem Highlighter gekennzeichnet werden.
2. Schalten Sie das Mikroskop, die Bühne und den Computer ein. Schalten Sie die PRIMO-Mikromustergeräte, die offene Micro-Manager- und Leonardo-Software ein. Leonardo Software wird über Micro-Manager unter Pluginsbetrieben. Überprüfen Sie die Marken/Katalognummern von Geräten und Software in Tabelle der Materialien.
3. Wählen Sie im Anfangsmenü von Leonardo Die Option Kalibrierenaus. Überprüfen Sie, ob sich der dedizierte PRIMO-Filterwürfel in der richtigen Position (optischer Pfad) im Filterrevolver befindet. wählen Sie das 20X Objektiv (0.75 DIC S Plan Fluor, kein Phasenring) sowohl auf dem Mikroskop als auch auf Leonardo Software.
  HINWEIS: Dieses Protokoll ist an Leonardo Version 4.4 angepasst. Das Protokoll muss möglicherweise für andere Versionen angepasst werden.
4. Positionieren Sie den zuvor hervorgehobenen Kalibrierbrunnen(Abbildung 4C) über dem Ziel. Wählen Sie den Kamerapfad aus. Passen Sie den Objektivfokus an, bis die Laserprojektion sowohl des PRIMO-Logos als auch der Tag-Linie Kümmern Sie sich um Ihre Zellen.
5. Lassen Sie die Standardbelichtungszeit der Kamera bei 25 ms. Passen Sie die Laserintensität an, um den Buchstaben I aus der PRIMO-Logoprojektion in grauer Farbe und den Rest der Buchstaben in Weiß zu sehen.
6. Zeichnen Sie die Z-Position der Brennebene (Höhe des Objektivs zur Probe) auf, die später als Z-Position der Kalibrierung bezeichnet wird. Dies ist eine Annäherung an den optimalen Fokus, der nach der Erstellung des Referenzmusters erreicht wird (siehe Schritt 4.2-4.4).
Referenzmuster
1. Positionieren Sie das Kulturgericht mit dem Mikrobrunnen, der den Photoinitiator enthält (Referenzmuster Mikrobrunnen, Abbildung 4D) über dem Ziel und wählen Sie Muster jetzt in der Leonardo-Software aus.
2. Visualisieren Sie den Rand des Mikrobrunnens mit Durchlicht durch die Kamera und wählen Sie das ROI-Symbol aus dem rechten Menü aus. Stellen Sie den Durchmesser des ROI-Kreises auf 4000 m ein und richten Sie den Rand des digitalen ROI an der Kante des aktuellen Mikrobrunnens aus.
3. Stellen Sie sicher, dass es eine genaue Überlappung zwischen dem digitalen ROI und dem aktuellen Mikrobrunnen gibt, indem Sie die Bühne um die Ränder des Mikrobrunnens bewegen. Die ROI-Position wird an die Bühnenbewegungen gekoppelt.
4. Wählen Sie In Leonardo-Software sperren aus, um den ROI an der gewünschten Position zu sperren. Schalten Sie das Durchlicht aus.
5. Wählen Sie PRIMO aus, um die gewünschte Mustervorlage hochzuladen, die als Konstruktionseinheit auf den ROI projiziert wird (siehe Abbildung 5). Muster werden in einer Dropdownliste angezeigt, die als Aktionen bezeichnet und im Menü Aktionen in der Software angezeigt wird.
  HINWEIS: Mustervorlagen müssen zuvor entworfen (siehe Schritt 1) und als 8-Bit-Tiff-Datei gespeichert werden, bevor die Vorlage in die Software geladen wird.
6. Für das Referenzmuster wird nur ein kleines Muster benötigt. z. B. 3 Zeilen, 1 Spalte (siehe Abbildung 4E und Abbildung 5B). Legen Sie im Menü Replikation die gewünschte Anzahl von Spalten und Zeilen fest(Zeilen in leonardo-Software). Klicken Sie auf Aktualisieren, um eine digitale Vorschau des Musterentwurfs zu beobachten.
7. Legen Sie die Laserdosis im Menü Replikation fest. Die optimale Laserdosis in dieser Einstellung und mit PLL-PEG beträgt 1390 mJ/mm².
  HINWEIS: Die Laserleistung kann zwischen 5-7,5 mW/mm²variieren. In diesem Fall ist es 7,5 mW/mm², die etwa 30 s benötigt, um jede Konstruktionseinheit zu mustern, mit einer Laserdosis von 1390 mJ/mm². Höhere Laserdosen können erforderlich sein, wenn die Kulturschalenoberfläche mit PEG-SVA passiviert wird (ungefähr doppelte Laserdosis im Vergleich zu PLL-PEG). Dies muss vorher getestet werden.
8. Navigieren Sie zu einem peripheren Bereich des Mikrobrunnens (z. B. Oberteil) weg vom Hauptbereich von Interesse für die Mustergenerierung (zentrale Region) des Mikrobrunnens (siehe Abbildung 4E) und wählen Sie Sperrenaus. Warten Sie, bis das Muster angezeigt wird.
9. Stellen Sie den Fokus auf die Z-Position der Kalibrierung ein (siehe Schritt 4.1.6).
  HINWEIS: Es wird empfohlen, einen zusätzlichen Systemkalibrierungsschritt zu machen, wenn ein anderer Benutzer das gleiche Mikroskop zwischen Fotomusterrunden verwendet.
10. Wählen Sie das Wiedergabesymbol aus, um mit dem Mustern zu beginnen. Stellen Sie sicher, dass der Laser in der Software eingeschaltet ist. Warten Sie, bis der Mustervorgang abgeschlossen ist. Die Musterdauer wird im Bedienfeld "Geschätzte Zeit" angezeigt. Bei Leonardo Software Version 4.4 wird die Musterung abgeschlossen, wenn alle Aktionen im Menü Visualisierungblau angezeigt werden.
Proteininkubation auf Referenzmuster
1. Waschen Sie das Referenzmuster unter sterilen Bedingungen dreimal mit 20 l PBS mikrogut, um das PLPP zu entfernen.
2. Fügen Sie dem Referenzmuster Mikrobrunnen 20 L fluoreszierend markiertes ECM-Protein (10 g/ml Laminin, Fibronectin oder Fibrinogen in PBS, siehe Materialtabelle und Schritt 6) hinzu. Bei Raumtemperatur für 10-20 min (je nach Protein) vor Licht geschützt inkubieren (die Schale in Aluminiumfolie wickeln).
3. Nach der Inkubation 18 l Proteinlösung entfernen und dreimal mit 20 l PBS waschen; halten Sie die Mikrobrunnen, die nicht verwendet werden, um ein Referenzmuster zu erstellen (siehe Abbildung 4D,E) in 20 L PBS.
Visualisierung und Einstellung optimaler Laserfokus
1. Visualisieren Sie das Referenzmuster mit einem Epifluoreszenzmikroskop, 20X Objektiv und geeigneter Software (Prüfsoftware, die in dieser Studie in Tabelle der Materialienverwendet wird). Das Referenzmuster sollte in der peripheren Region (z. B. Top-Gut-Region) sichtbar sein, in der das Referenzmuster generiert wurde (siehe Abbildung 4E).
2. Passen Sie den Fokus auf die Musterkanten durch den Kamerapfad an. Zeichnen Sie die Z-Position entsprechend dem besten Fokus auf das Referenzmuster auf. Diese angepasste Z-Position ist der optimale Laserfokus für die nachfolgende Musterung.

5. Software-Setup und Fotomusterung

ANMERKUNG: Sobald die Kalibrierung des Systems abgeschlossen ist (Schritt 4), lädt der Benutzer die gewünschten Mustervorlagen (Vorlagenkonfiguration, Abbildung 5) für die Fotomusterung hoch, mit der Option, Muster für ein oder mehrere Proteine in jedem Mikro-Gut. Der Mikromusterprozess umfasst Photomusterungs- und Proteininkubationsschritte (siehe Abbildung 2).

Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen 18 L PBS aus allen Mikrobrunnen und fügen Sie jedem Mikrobrunnen 5 l PLPP hinzu. Stellen Sie sicher, dass PLPP auf der gesamten Oberfläche der Mikrobrunnen homogen ist.
Positionieren Sie die Kulturschale mit dem Referenzmuster Micro-well (Abbildung 4D,E) über dem Ziel und wählen Sie Muster jetzt in der Leonardo-Software aus.
Visualisieren Sie den Mikrobrunnen mit durchgehendem Licht durch den Kamerapfad und wählen Sie das ROI-Symbol. Stellen Sie den Durchmesser des ROI auf 4.000 m ein und überlappen Sie den Rand des digitalen ROI mit dem Rand des aktuellen Mikrobrunnens. Wählen Sie Sperren.
HINWEIS: Form und Durchmesser des ROI hängen vom Design und der Größe der verwendeten PDMS-Schablone ab. Wenn Sie z. B. 5.000 x 5.000 mm PDMS-Quadratschablonen verwenden, verwenden Sie einen ROI mit 5.000 x 5.000 m im Quadrat.
Wiederholen Sie den überlappenden Schritt (Schritt 5.3) für jeden Mikrobrunnen der Schale. Schalten Sie nach Abschluss das Durchlicht aus.
Navigieren Sie zur Mitte des Referenzmusters Mikrobrunnen, weg vom Referenzmusterbereich, und wählen Sie PRIMO aus, um die gewünschte Mustervorlage hochzuladen, die als Konstruktionseinheit auf den ROI projiziert wird (siehe Abbildung 5). Muster werden in einer Dropdownliste angezeigt, die als Aktionen bezeichnet und im Menü Aktionen in der Software angezeigt wird.
HINWEIS: Mustervorlagen müssen vor dem Experiment entworfen und als 8-Bit-Tiff-Datei gespeichert werden, bevor die Vorlage in die Software geladen wird.
Um ein Muster über den gesamten Mikrobrunnen zu erstellen, muss die Konstruktionseinheit repliziert werden. Eine Konstruktionseinheit deckt etwa 0,1 mm² des Mikrobrunnenbereichs ab. Legen Sie im Menü Replikation die gewünschte Anzahl von Spalten und Zeilen fest (Zeilen in der Software) (siehe Abbildung 5).
Um ein kontinuierliches Muster zu generieren, passen Sie den Abstand zwischen Spalten und Linien an. In dieser Studie werden Muster kontinuierlicher Streifen mit einem Abstand von -20 bis -35 m (negativer Abstand) zwischen den Spalten ermittelt. Dieser negative Abstand erzeugt eine Überlappung zwischen Konstruktionseinheiten (Abbildung 5B,C).
Legen Sie die Laserdosis im Menü Replikation fest. Die optimale Laserdosis in dieser Einstellung und mit PLL-PEG beträgt 1390 mJ/mm². Die Musterdauer wird im Bedienfeld Geschätzte Zeit angezeigt.
HINWEIS: In diesem Fall ist die Laserleistung 7,5 mW/mm², wobei ca. 30 s dauert, um jede Konstruktionseinheit zu mustern, mit einer Dosis von 1390 mJ/mm². Beispielsweise würde eine Konstruktionseinheit (0,1 mm²), die in 4 Spalten und 4 Linien (ca. 1,6 mm²⁾repliziert wird, 8 min dauern, um gemustert zu werden. Höhere Laserdosen können erforderlich sein, wenn die Kulturschalenoberfläche mit PEG-SVA passiviert wird (ungefähr doppelte Laserdosis im Vergleich zu PLL-PEG).
Wählen Sie Sperren und warten Sie, bis das Muster virtuell angezeigt wird.
Um die Parameter eines Musters zu aktualisieren, klicken Sie auf die zugehörige Aktion, entsperren Sie dann die Parameter und aktualisieren Sie sie. Wählen Sie erneut Sperren aus, wenn die Musteraktualisierung abgeschlossen ist.
Die Musterung mehrerer Proteine im selben Mikrobrunnen (sequenzielle Mikromusterrunden) erfordert eine genaue Ausrichtung der Muster. Um eine solche Ausrichtung zu erreichen, laden Sie alle Sätze der gewünschten Mustervorlagen gleichzeitig hoch (Muster der ersten und zweiten Fotomusterrunden).
Legen Sie die Replikations- und Dosisparameter der Mustervorlagen fest. Nachdem Parameter festgelegt wurden, werden Muster als Aktionen in der Liste Aktionen angezeigt. Speichern Sie diese Vorlagenkonfiguration als Datei in software (siehe Abbildung 5D).
Wählen Sie in der Liste Aktionen nur die spezifischen Aktionen aus, die während der ersten Musterrunde gemustert werden sollen, und deaktivieren Sie die Aktionen, die während der zweiten Musterrunde gemustert werden (siehe Abbildung 5D).
Navigieren Sie zu dem Bereich, in dem das Referenzmuster in Schritt 4.2 erstellt wurde (z. B. oberer Bereich des Referenzmusters Mikrobrunnen, siehe Abbildung 4E). Stellen Sie den Fokus auf die optimale Z-Position ein (in Schritt 4.4 erhalten).
HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, ein perfektes Fokussystem auf dem verwendeten Mikroskop zu wählen (sofern verfügbar), wodurch sichergestellt wird, dass die optimale Z-Position für die Musterung während des gesamten Photomusterprozesses beibehalten wird.
Wählen Sie das Wiedergabesymbol aus, um mit dem Mustern zu beginnen. Die Musterdauer wird im Bedienfeld "Geschätzte Zeit" angezeigt. Bei Leonardo Software Version 4.4 wird die Musterung abgeschlossen, wenn alle Aktionen im Menü Visualisierung blau angezeigt werden.

6. Protein-Inkubation

HINWEIS: Mikrobrunnen werden mit ECM-Proteinen inkubiert (vorzugsweise fluoreszierend). Diese binden sich nur an die Bereiche, in denen PEG durch den in Schritt 5 beschriebenen Photomusterprozess gespaltet wurde. Jeder Brunnen enthält eine PDMS-Schablone mit 4 Mikrobrunnen, die es ermöglicht, 4 verschiedene Bedingungen gleichzeitig zu testen, z. B. die Inkubation eines anderen Proteins in jedem Mikrobrunnen (siehe Abbildung 4D).

Verwenden Sie fluoreszierend markierte Proteine (z. B. Laminin, Fibronectin oder Fibrinogen konjugiert zu roten oder grünen Fluorophoren), um die Mikromuster zu visualisieren (siehe Schritt 6.7 und 9.4). Alternativ können adsorbierte nicht beschriftete Proteine in späteren Stadien mit Immunfluoreszenz visualisiert werden.
ANMERKUNG: ECM-Proteine (z. B. Fibronectin) können mit den vorhandenen Protokollen³³ und handelsüblichen Fluoreszenz-Etikettierungskits (d. h. Alexa 488-Etikettierungskit) gekennzeichnet oder leicht beschriftet (z. B. konjugiertes Fibrinogen-488 oder lamininrote fluoreszierende Rhodamin, siehe Materialtabelle).
Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen die gewünschte Konzentration von ECM-Proteinen (10 g/ml Laminin, Fibronectin oder Fibrinogen in PBS vor, siehe Materialtabelle und Schritt 4.3).
HINWEIS: Fluoreszierend markierte ECM-Proteine sind lichtempfindlich und sollten vor Licht geschützt werden (Wrap-Schale in Aluminiumfolie) und sollten jederzeit auf Eis gehalten werden.
Waschen Sie die Mikrobrunnen unter sterilen Bedingungen dreimal mit 20 l PBS, um die PLPP zu entfernen.
Entfernen Sie 18 L PBS aus allen Mikrobrunnen und fügen Sie jedem Mikrobrunnen 20 L ECM-Proteinlösung hinzu. Bei Raumtemperatur inkubieren, 20-30 min lang beschützen und vor Licht schützen.
HINWEIS: Optimale Inkubationszeiten für Beschichtungen können je nach Art und Konzentration der Proteine variieren.
Nach der Inkubation 15 L ECM-Proteinlösung entfernen und die Mikrobrunnen dreimal mit 20 l PBS waschen.
HINWEIS: Lassen Sie immer ca. 5 l PBS zwischen den Wässen.
Wenn Sie mit nur einem Protein (eine Runde Mikromusterung) mustern, fahren Sie entweder mit der Lagerung der Kulturschale (Schritt 10) oder mit der Zellbeschichtung fort (Schritt 11, siehe Abbildung 2). Wenn Sie eine zweite Runde der Mikromusterung mit einem anderen Protein im selben Mikrobrunnen durchführen, gehen Sie entweder zur Lagerung der Kulturschale (Schritt 10) oder zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen (Schritt 7, siehe Abbildung 2).
Optionaler Qualitätskontrollschritt: Visualisieren und Abbildgedrucktes mustern mit einem Epifluoreszenzmikroskop vor der Beschichtung von Zellen. Wählen Sie die entsprechenden Fluoreszenzkanäle aus und passen Sie die Belichtungszeiten entsprechend an.
ANMERKUNG: Um die Fluoreszenzintensität von Mustern zwischen Experimenten zu vergleichen, ist es wichtig, die gleichen Expositionszeiten für dieselben Proteine zu verwenden.

7. Blockieren unspezifischer Bindungsstellen (nur für mehrere Proteinmuster)

HINWEIS: Die Mikro-Musterung mit mehreren Proteinen im selben Mikrobrunnen umfasst sequenzielle Musterschritte (siehe Abbildung 2). Ein Blockiermittel (PLL-PEG oder BSA) wird den Mikrobrunnen zugesetzt, um eine Kreuzbindung zu verhindern, die auftritt, wenn das zweite inkubierte Protein (Schritt 9) an das erste inkubierte Protein (Schritt 6) bindet, wodurch eine Mischung von Proteinen innerhalb der Muster vermieden wird.

Fügen Sie unter sterilen Bedingungen 20 l PLL-PEG (0,1 mg/ml in PBS) oder BSA (1% BSA in PBS) als Sperrschritt hinzu, um eine Kreuzbindung zu verhindern.
HINWEIS: Die Blockiereffizienz kann je nach Art der verwendeten Proteine und der Affinität zwischen ihnen variieren. Es wird empfohlen, pLL-PEG und BSA vorher als Blockiermittel zu testen (Abbildung 10D-I).
Blockierungsmittel bei Raumtemperatur für 1 h inkubieren und vor Licht schützen. Entfernen Sie 15 L Blockiermittel und waschen Sie alle Mikrobrunnen dreimal mit 20 l PBS. Lassen Sie zwischen den Wässen immer ca. 5 l PBS.
Entfernen Sie 18 L PBS aus allen Mikrobrunnen und fügen Sie jedem Mikrobrunnen 5 l PLPP hinzu, um sicherzustellen, dass PLPP auf der gesamten Oberfläche der Mikrobrunnen homogen ist.

8. Zweite Fotomusterrunde (nur für mehrere Proteinmuster)

HINWEIS: Nach der ersten Runde der Photomusterung und Proteininkubation wird ein Mikromuster erzeugt. Während der zweiten Runde der Fotomusterung wird das Muster für das zweite Protein im selben Mikrobrunnen erzeugt (siehe Abbildung 2C und Abbildung 5D). Wählen Sie in der Software die richtigen Mustervorlagen (Aktionen) aus, die während dieser Runde gemustert werden (siehe Abbildung 5D).

Navigieren Sie zum ersten Mikrobrunnen (Abbildung 4D). Stellen Sie eine angemessene Überlappung zwischen dem digitalen ROI und dem Mikrobrunnen sicher.
Laden Sie die zuvor gespeicherte Vorlagenkonfiguration (Schritt 5.12), und wählen Sie die Aktionen aus, die während der zweiten Fotomusterrunde gemustert werden sollen (Aktionen aus der ersten Runde deaktivieren, siehe Abbildung 5D).
Wählen Sie das Wiedergabesymbol aus, um mit dem Mustern zu beginnen. Stellen Sie sicher, dass der Laser in der Software eingeschaltet ist.

9. Zweite Runde der Proteininkubation (nur für mehrere Proteinmuster)

HINWEIS: In diesem Teil des Protokolls werden fluoreszierend markierte Proteine/s nach der zweiten Fotomusterrunde auf der Kulturschale inkubiert.

Waschen Sie den Mikrobrunnen unter sterilen Bedingungen dreimal mit 20 l PBS, um das PLPP zu entfernen. Entfernen Sie 18 L PBS und fügen Sie jedem Mikrobrunnen 20 L ECM-Proteinlösung hinzu. Bei Raumtemperatur 20-30 min inkubieren und vor Licht schützen.
HINWEIS: Optimale Inkubationszeiten für Beschichtungen können je nach Art und Konzentration der Proteine variieren.
Nach der Inkubation 15 L ECM-Proteinlösung entfernen und die Mikrobrunnen dreimal mit 20 l PBS waschen. Lassen Sie zwischen den Wässen immer ca. 5 l PBS.
Gehen Sie entweder mit der Lagerung von Kulturschale (Schritt 10) oder mit der Zellbeschichtung (Schritt 11, siehe Abbildung 2).
Optionaler Qualitätskontrollschritt: Mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskops, Visualisieren und Abbilden gedruckter Muster vor der Beschichtung von Zellen. Wählen Sie die entsprechenden Fluoreszenzkanäle aus und passen Sie die Belichtungszeit an.
ANMERKUNG: Um die Fluoreszenzintensität von Mustern zwischen Experimenten zu vergleichen, ist es wichtig, die gleichen Expositionszeiten für dieselben Proteine zu verwenden.

10. Lagerung von Mikromustern

HINWEIS: Mikromuster mit adsorbten Proteinen können während verschiedener Schritte des Protokolls gespeichert werden (siehe Abbildung 2). Wenn Mikromusterung mit mehreren Proteinen erfolgt, können Mikromuster nach der ersten Runde der Mikromusterung oder nach Abschluss der beiden sequenziellen Runden der Mikromusterung gespeichert werden (siehe Abbildung 2B).

Bei Passivierung mit PLL-PEG die Mikromuster in PBS (3 ml pro Brunnen) bei 4 °C bis zu 3 Tage lagern.
Wenn das Kulturgericht mit PEG-SVA passiviert wurde, können Mikromuster bis zu 1 Monat gelagert werden. Dazu Mikromuster intensiv mit doppelt destilliertem entionisiertem Wasser abspülen und mit einer sterilen Luftpistole aus Argon oder Stickstoff trocknen, obwohl auch normale Luft verwendet werden kann. Nach dem Trocknen können Mikromuster bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden (PRIMO Systemsupport Team, persönliche Kommunikation).

11. Beschichtungszellen

HINWEIS: In den nächsten Schritten werden die Zellen auf die vorbereiteten mikrogemusterten Kulturgerichte/-es plattiert. In diesen Studien wird eine neuronale Zelllinie (CAD-Zellen)^{verwendet 31}. Dieses Protokoll kann jedoch angepasst werden, um andere Zellarten von Interesse zu untersuchen (Zellbeschichtungsprotokoll nach Bedarf anpassen).

Differenzieren Sie CAD-Zellen für 48 h mit Differenzierungsmedium (DMEM ergänzt mit 1% Glutamin, ohne Serum, und mit 1% Pen/Strep, siehe Materialtabelle).
Platte 1 ml Medium mit Zellen im Inneren Glas brunnen, decken alle Mikrobrunnen und legen Sie die Kulturschale in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator.

Representative Results

Nach dem obigen Protokoll führt zu mikrogemusterten Oberflächen, die mit ECM-Proteinen/s von Interesse beschichtet sind. Wir verwenden diese Muster, um neuronale Pfadfindung zu verfolgen.

Generierte Muster sollten eine präzise Darstellung der Vorlage sein. Ein Beispiel ist in Abbildung 6 dargestellt, in dem eine digitale Mustervorlage (Abbildung 6A), die eine Konstruktionseinheit darstellt (Abbildung 5B), zu definierten Mikromustern im Bereich von 20 bis 2 m Breite führte, die mit Fibrinogen (Abbildung 6B). Mit ImageJ wurden fluoreszenzintensitätsmessungen sowohl vertikal (Abbildung 6C) als auch horizontal (Abbildung 6E) entlang des Streifens und aus einem entsprechenden Hintergrundbereich 15 m über jedem Streifen ermittelt. Die Hintergrundmessungen wurden von den Mustermessungen für jede Streifenbreite subtrahiert.

Eine Einschränkung des Systems besteht darin, dass beim Drucken von Features von 20 m ein Kanteneffekt beobachtet werden kann(Abbildung 6B, Oberstreifen), wobei ein Signal mit höherer Intensität an den Musterkanten im Vergleich zur Mitte(Abbildung 6D, erste Spitze fluoreszierendes Intensitätsprofil). In unseren Experimenten lag die Auflösungsgrenze bei ca. 2 m; bei dieser Breite beobachteten wir einen signifikanten Rückgang (um ca. 50%) in Fibrinogenfluoreszenzintensität im Vergleich zur Intensität der breiteren Streifen (Abbildung 6F,G). Die Musterung mit dem PRIMO-System und dem hier skizzierten Protokoll ergaben reproduzierbare Muster mit der höchsten Standardabweichung der mittleren Fluoreszenzintensität, gemessen für die Breite von 2 m aus vier einzelnen replizierten Konstruktionseinheiten(Abbildung 6 G). Die Variation innerhalb der gemusterten Streifen wurde ebenfalls als gering befunden; der Variationskoeffizient lag zwischen 3 und 10 %, wobei die 20-m- und 2-mm-Streifen die größte interne Streuung aufweisen. Dies ist wahrscheinlich auf den Kanteneffekt bzw. die Auflösungsgrenze des Systems zurückzuführen. Beachten Sie, dass wir bei diesen Messungen nur die Intensität in der Mitte der Streifen gemessen haben, um die ungleichmäßige Beleuchtung zu vermeiden, die sich aus dem Objektiv ergibt, das zum Erfassen dieser Bilder verwendet wird (Vignetting, Abbildung 6E).

Bestimmte Experimente können Fragen beinhalten, die definierte Proteinkonzentrationen erfordern, die auf zwei Arten erreicht werden können: 1) Variation der Proteinkonzentration (Abbildung 7A,B). Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen von Laminin führt zu signifikant unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten, die mit höheren Proteinkonzentrationen zunehmen (Abbildung 7B). 2) Die Laserdosis, mit der der Antiklebefilm (PEG) spaltet, kann variiert werden. Höhere Laserdosen werden den Antifouling-Film in größerem Umfang entfernen, wodurch mehr Bindungsstellen für die Proteine von Interesse erzeugt werden (Abbildung 7C,D), was zu deutlich unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten führt, die mit höherem Laser erhöht werden. Dosen (Abbildung 7D).

Die Variation der Laserdosis ermöglicht die Erzeugung von Proteingradienten innerhalb desselben Musters. Dies wird in Abbildung 8Adargestellt, wo eine Farbverlaufsvorlage mit unterschiedlichen Graustufen entworfen wurde, von Schwarz (keine Laserleistung) bis weiß (maximale Laserleistung).

Die Laserintensität ist proportional zum Graustufenniveau der Vorlage (von 0 bis 255 in einem 8-Bit-Bild), wodurch Gradienten der UV-Beleuchtung erzeugt werden. Die Messung des Fluoreszenzintensitätsprofils entlang des Gradientenstreifens ist linear in der Mustervorlage (Abbildung 8B) und im erzeugten Gradientenmuster (Abbildung 8C,D). Dies ist reproduzierbar unter allen Farbverlaufsstreifen innerhalb derselben Vorlage und des gleichen Farbverlaufsmusters (Abbildung 8B,D). Die Generierung solcher Gradienten ist äußerst nützlich und hilft, In-vivo-Umgebungen nachzuahmen, in denen Zellen oft auf Gradienten bioaktiver Proteine³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷reagieren.

Zellen spüren sich verändernde extrazelluläre Umgebungen, aber Assays, die die Untersuchung des Zellverhaltens ermöglichen, wenn Zellen auf solche Veränderungen stoßen, sind begrenzt. LIMAP kann verwendet werden, um Mikro-Muster mit mehreren Proteinen in der gleichen Mikro-Gut. Beispiele sind in Abbildung 9 dargestellt, wo Kreuzmuster mit Streifen von Fibronectin (horizontal) und Laminin (vertikal) erzeugt wurden. Bei der Erstellung von Mustern mit mehreren Proteinen ist es wichtig, einen Blockierenden Schritt zwischen der ersten und zweiten Proteininkubation zu verwenden, um kreuzgebundene Proteine zu verhindern (siehe Schritt 7). Die Blockiereffizienz kann abhängig von den biochemischen Eigenschaften der Proteine variieren, die für die Beschichtung verwendet werden, und wir empfehlen, mehrere Blockierpuffer zu testen, einschließlich PLL-PEG (0,1 mg/ml) und BSA (1%). Um diesen Kreuzbindungseffekt zu bewerten, führten wir Fluoreszenzintensitätsmessungen mit ImageJ (Abbildung 9) durch und zeigten, dass die Kreuzbindung mit PLL-PEG-Puffer (0,1 mg/ml) für Fibronectin und Laminin drastisch reduziert werden kann. Quermuster (Abbildung 9D,H).

Die erzeugten Kreuzmuster wurden für zelluläre Assays mit CAD-Zellen (Abbildung 10A,B) oder Ratten-Dorsal-Wurzel-Ganglion (DRG) Neuronen verwendet (Abbildung 10C). Ihre Neuriten (CAD) und Axone (DRG) wachsen auf unterschiedlichen Linien. CAD-Zellen werden als neuronales Modell verwendet, da sie ein ähnliches Integrin-Expressionsprofil im Vergleich zu primären Neuronen aufweisen und nach 48 h in der Kultur immer noch aktinreiche Wachstumskegel aufweisen (Abbildung 10B),was sie für die Pfadfindung geeignet macht. Studien.

Um die möglichen zytotoxischen Wirkungen der erzeugten Mikromuster auf primäre Neuronen zu untersuchen, wurden DRG-Neuronen nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll³⁸isoliert und auf Mikromustern kultiviert. Die Ergebnisse zeigen, dass primäre Neuronen die Mikromusterumgebung tolerieren (Abbildung 10C). Wir untersuchen derzeit, wie eine Vielzahl von ECM-Proteinen axonale (neuritische) Pathfindung beeinflussen. Der vorläufige Nachweis von Konzepten in CAD-Zellen wird mit DRG-Neuronen weiter untersucht. Um die Qualität der erzeugten Mikromuster zu validieren, ist es wünschenswert, Bildmuster durch Fluoreszenzmikroskopie abzubilden, um sicherzustellen, dass die Musterkanten gut definiert sind, bevor sie zur Zellbeschichtung übergehen. Während des Bildgebungsprozesses ist es wichtig, die optische Einstellung zwischen Dem Mikroskop und der Kamera sicherzustellen, um den peripheren Verdunkelungseffekt (Vignettierung) zu vermeiden, der sich auf die hintere Analyse und Interpretation von Daten auswirkt. Erfassen Sie außerdem ein Bild eines musterfreien Bereichs mit den gleichen Belichtungszeiten, die zum Abbilden der Muster verwendet werden, und subtrahieren Sie dieses Bild vom Musterbild.

Zusammenfassend ist es für eine qualitativ hochwertige Mikromustererzeugung ratsam, die Proteinkonzentration (Abbildung 7A,B), Laserdosen (Abbildung 7C,D), Proteinhintergrundwerte ( Abbildung6E,F,H) und effiziente Blockierungsschritt (Abbildung 9) bei Verwendung mehrerer Proteine. Letztendlich ist die Qualität der mit LIMAP erzeugten Mikromuster unerlässlich, um zuverlässige und reproduzierbare Daten aus zellulären Assays zu erhalten.

Abbildung 1: Schema der Mikromustertechniken: Mikrokontaktdruck und laserunterstützte Musterung. (A) Microcontact-Druck verwendet einen lithographierten Master mit definierten Mikro-Features, um einen PDMS-Stempel zu erzeugen, der mit dem Protein von Interesse inkubiert wird. Dieses Protein wird dann auf eine Glasoberfläche übertragen (gestempelt) und erzeugt Protein-Mikromuster. (B) Laserunterstützte Mustertechniken umfassen Fotomusterung und direkte Lasermusterung. (C) Die meisten Photomusteransätze verwenden eine UV-Lichtquelle und eine Fotomaske (entweder in Kontakt mit der Substratoberfläche oder in der Brennebene des Objektivs) mit gewünschten Geometrien, um die PEG-Antifouling-Oberfläche in bestimmten Positionen zu spalten, Erstellen eines definierten Musters. Ein nachfolgender Proteininkubationsschritt führt nur zu einer Proteinadsorption in den laserspaltenden Regionen. (D) LIMAP ist eine Fotomustertechnik, die keine Fotomaske in Kontakt mit dem Substrat erfordert (d. h. ein maskenloser und berührungsloser Ansatz). LIMAP verwendet einen Photo-Initiator, der durch niedrige Dosen eines Lasers aktiviert wird, der lichtexponierte Bereiche von PEG aufklammert. Dadurch werden Anbauflächen für die sequenzielle Proteinadsorption erstellt. (E) Die direkte Lasermusterung verwendet hochenergetisches Licht, um den PEG-Film direkt zu ätzen, wodurch Proteinbindungen in diesen geätzten Regionen möglich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schema mit einer Zusammenfassung der Schritte im Mikromusterprotokoll. (A) Die Mikro-Musterung mit einem Protein umfasst nur eine Runde Mikro-Musterung (Photomusterung und Proteininkubation) und kann in unter 8 h durchgeführt werden. (B) Die Mikro-Musterung mit mehreren Proteinen erfordert zwei sequenzielle Mikromusterung und kann in 1-2 Tagen abgeschlossen werden, abhängig von der Anzahl der Mikromuster, die vorbereitet werden. Es ist möglich, die B-Version des Protokolls in 1 Tag der Arbeit zu durchlaufen. Kontinuierliche Pfeile zeigen den direkten Fluss der Schritte im Protokoll an. Diskontinuierliche Pfeile zeigen an, dass zwischen einem Schritt und dem anderen ein erheblicher Zeitabstand besteht (siehe Schritt 6.6 und 9.3). (C) Schematische Ansicht von Beispielmustern, die nach einer Runde Mikromusterung (rote Streifen) oder zwei sequenziellen Runden der Mikromusterung (rote und grüne Streifen) erhalten wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Die Modellvorlagengenerierung ist mit LIMAP vielseitig. (A,B) Beispiele für Mustervorlagen, die mit ImageJ entworfen wurden (Eine Armbrust, B-Buchstaben). In weiß gezeichnete Formen wurden mit maximaler Laserleistung projiziert und in Schwarz gezeichnete Formen wurden nicht projiziert. (C,D) Mikromuster, die mit LIMAP aus Schablonen nach der Inkubation mit 10 g/ml Fibrinogen (grün) gewonnen wurden. (C) Die Armbrüste sind 50 m Breit und 50 m Höhe, horizontal und 50 m vertikal. (D) Die Buchstaben sind 80 m breit und 85 m hoch. Maßstabsbalken in C und D stellen 50 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Wesentliche Materialien für das LIMAP-Protokoll. (A) Schablonen, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind 20 mm Durchmesser, dünne kreisförmige PDMS-Stücke (250 m Dicke) mit 4 Mikrobrunnen (je 4 mm Durchmesser). Die in den Mikrobrunnen verwendeten Volumina reichen von 5 bis 20 l, wodurch die Menge an Reagenzien und Proteinen, die für jedes Experiment benötigt werden, erheblich reduziert wird. (B) 6 gut Glas Bodenschale, wo Schablonen bereits in jedem Brunnen platziert wurden. Mikrobrunnen enthalten 20 L PBS, um sie sichtbar zu machen. (C) Kalibrierschale, bei der der innere Glasbrunnen mit einem grünen Highlighter markiert wurde, mit dem der Laserfokus kalibriert wird. (D) Schematische Ansicht von oben links gut von der 6-Well-Glasbodenschale in B (mit gestricheltem roten Kreis umrandet). Der innere Glasboden ist weiß dargestellt und die Schablone ist grau dargestellt. Die Schablone enthält 4 Mikrobrunnen (nummeriert 1-4), zum Testen von 4 verschiedenen Versuchsbedingungen (z.B. unterschiedliche Proteinkonzentrationen, Mustergeometrien, Proteinkombinationen usw.). Das Sternchen stellt den Mikrobrunnen dar, der das Referenzmuster enthält. (E) Schematische Ansicht des Mikrobrunnens, bei dem im oberen Teil ein Referenzmuster erzeugt wurde (Pfeil mit gefüllter Pfeilspitze). Dieses Referenzmuster ist erforderlich, um den optimalen Laserfokus für die Musterung zu erhalten (siehe Schritt 4). Pfeil mit leerer Pfeilspitze zeigt den zentralen Bereich des Mikrobrunnens an, der nach der Systemkalibrierung für die nachfolgende Musterung verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Software-Setup für Mikro-Musterung. (A) Mustervorlage mit parallelen Streifen, die mit ImageJ entworfen und als 8-Bit-Tiff-Datei gespeichert wurden. (B-D) Schematische Ansicht digitaler ROIs (Interessengebiete), die sich mit den aktuellen Mikrobrunnen überlappen, in denen Mikromuster erzeugt werden. (B) Die zu verwendende Mustervorlage (Länge 1824 Pixel=415 m, Breite 1140 Pixel =260 m) ist auf Leonardo ausgewählt und wird auf den ROI als Konstruktionseinheit (rote Streifen im schwarzen gestrichelten Rechteck) projiziert, die etwa 0,1 mm² der Mikrobrunnenbereich. Die Entwurfseinheit wird in 4 Spalten und 4 Zeilen im Replikationsmenü (Vorlagenkonfiguration) repliziert, wodurch ein Muster über den Mikrobrunnen erstellt wird. BEACHTEN SIE den Abstand zwischen den Spalten. (C) Um kontinuierliche Streifen zu mustern, muss der Abstand zwischen den Spalten angepasst werden. Um eine Überlappung zwischen Konstruktionseinheiten zu erreichen, wird der Abstand zwischen den Spalten im Replikationsmenü als Negativer Abstand, -20 m festgelegt. (D) Um mehrere Proteine im selben Mikrobrunnen zu modellieren, wird eine genaue Ausrichtung der Muster Erforderlich. Laden Sie während des Software-Setup-Schritts (Schritt 5) alle gewünschten Mustervorlagen gleichzeitig hoch. Wählen Sie in der Liste Aktionen nur die spezifischen Aktionen aus, die während jeder Musterrunde gemustert werden sollen, und deaktivieren Sie die auswahl der übrigen Aktionen (Schritt 5.12, 5.13 und 8.2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Analyse der Mustervariabilität mit LIMAP. (A) Mustervorlage mit ImageJ entwickelt, um vier Streifen unterschiedlicher Breite (20, 10, 5, 2 m, von oben nach unten) mikromustern zu können. (B) Mikromuster, das nach der Inkubation mit 10 g/ml fluoreszierend markiertem Fibrinogen (grün) gewonnen wird. (C) Intensitätsmessungen entlang einer vertikalen Linie, die die Streifen des Mikromusters kreuzt. (D) Vertikales Fluoreszenzintensitätsprofil, das bei Messung in (C) gewonnen wird. BEACHTEN SIE, dass bei größeren Breiten (20 m) eine Variation des vertikalen Profils durch die Ansammlung von Protein an den Rändern des Streifens verursacht wird, was zu zwei unterschiedlichen Fluoreszenzintensitätsspitzen führt (Kanteneffekt). Dieser Effekt ist nur in Streifenbreiten von 20 m zu sehen. (E) Intensitätsmessungen entlang der dargestellten horizontalen Linien (Fluoreszenz und Hintergrund). ( F ) Horizontale Fluoreszenzintensitätsprofile, die aus Messungen in(E)gewonnen wurden. (G) Diagramm mit der mittleren Intensität für jede Streifenbreite, gemessen aus vier einzelnen replizierten Konstruktionseinheiten (Zwischenmustervariation). BEACHTEN SIE die reduzierte Proteinadsorption auf Muster von 2 m Streifenbreite. (H) Die Streuung innerhalb der gemusterten Streifen (Variationskoeffizient) war für alle Streifenbreiten niedrig und reichte von 3 bis 10 %. Die Daten in G und H wurden als Mittelwert SD dargestellt. Die statistische Analyse in G und H wurde mit einem einseitigen aNOVA (Kruskal-Wallis) nicht-parametrischen Test mit mehreren Vergleichen durchgeführt. Der P-Wert ist <0.001 für ** Signifikanz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Die Auswirkungen von Schwankungen der Laserleistung und der Proteinkonzentration für die Proteinadsorptionseffizienz. (A) Die PLL-PEG-Oberfläche wurde mit einer konstanten Laserdosis (1390 mJ/mm2 ) lasergespaltet und mit den angegebenen Konzentrationen von fluoreszierend markiertem Laminin (Magenta) inkubiert. (B) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität der Lamininstreifen in (A). (C) Die unterschiedlich angegebenen Laserdosen wurden anschließend mit der gleichen Konzentration (10 g/ml) fluoreszierend markiertem Fibronectin (grün) inkubiert. (D) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität der Fibronectinstreifen in (C), die zeigen, dass höhere Laserdosen mit höheren Konzentrationen adsorbierten Proteins korrelieren. Alle Messungen werden im Hintergrund subtrahiert. Beispielnummern werden am unteren Rand der Spalten angegeben; Die statistische Analyse wurde mit einem nicht-parametrischen Mann-Whitney-Test mit zweischwändernder Berechnung durchgeführt. Der P-Wert ist <0.0001 für **** Signifikanz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Erzeugung eines Proteinkonzentrationsgradienten innerhalb eines Mikromusters. (A) Gradientmustervorlage in Graustufen. (B) Fluoreszenzintensitätsprofil gemessen ab (A). (C) Muster, das mit LIMAP aus Musterschablone in (A) nach inkubationsweise mit 10 g/ml fluoreszierend markiertem Fibronectin (grün) erhalten wurde. (D) Fluoreszenzintensitätsprofil von n = 3 Streifen und Hintergrund als Mittelwert dargestellt, sem, zeigt die lineare Erhöhung der Intensität des Proteingradienten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Der Kreuzbindungseffekt beim sequenziellen Mustern mehrerer Proteine. (A-C, E-G) Kreuzmuster mit 10 m Streifen fluoreszierend markiertem Fibronectin (Cyan, horizontal) und fluoreszierend markiertem Laminin (Magenta, vertikal). (A-C) Mit BSA-Blockierpuffer behandelte Proben. (E-F) Mit PLL-PEG behandelte Proben zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen (Schritt 7). (A,E) Zusammengeführte Fluoreszenzkanäle, die sowohl Fibronectin als auch Laminin zeigen. (B,F) Bild zeigt nur Fibronectin. (C,G) Bild, das nur Laminin zeigt. Für C, beachten Sie das Vorhandensein von Laminin auch auf horizontalen Fibronectin-positiven Streifen, die auf die unwirksame Blockierung von unbesetzten Bindungsstellen mit BSA zurückzuführen ist. Beachten Sie für G, dass die Blockierung mit PLL-PEG eine effiziente Bindung von Laminin an die Fibronectinstreifen verhindert. (D,H) Fluoreszenzintensitätsprofile, die aus angegebenen Messungen (diagonale gelbe Linie) in A bzw. E gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: Kreuzmuster zur Untersuchung der Neuriten-/Axon-Pfadsuche. (A-C) Kreuzmuster mit 10 m Streifen fluoreszierend markiertem Fibronectin (Cyan, horizontal) und fluoreszierend markiertem Laminin (Magenta, vertikal). (A,B) Fluoreszierende Bilder von CAD-Zellen mit Neuriten, die entlang der Mikromuster wachsen. Um Neuriten zu visualisieren, wurden Zellen für 48 h kultiviert, mit 4% PFA fixiert und für Tubulin (A) oder Tubulin und Actin (B) gebeizt. (C) Ratten-Dorsal-Wurzel-Ganglion (DRG) Neuronen mit Axonen, die entlang der Mikromuster wachsen. Um Axone zu visualisieren, wurden DRG-Neuronen für 72 h kultiviert, mit 4% PFA fixiert und für Tubulin gebeizt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: Beispiele für häufige negative Ergebnisse, die bei der Erzeugung von Mikromustern mit LIMAP erzielt wurden. (A-C) Suboptimale gemusterte Streifen von 10 g/ml fluoreszierend markiertem Fibrinogen (grün), die unter verschiedenen Umständen erhalten werden. (A) Der Mikrobrunnen trocknete bei der Mustererzeugung aus. Beachten Sie die hohe Fluoreszenz im Hintergrund (Pfeil) und das Vorhandensein von PBS-Kristallen (Sternchen). (B) Die Nähte zwischen den Streifen wurden während der Softwareeinrichtung nicht richtig eingestellt, was zu diskontinuierlichen Streifen mit Lücken (Pfeil) zwischen den Konstruktionseinheiten führte (siehe Schritt 3.4.7). (C) Der Laserfokus war suboptimal und verursachte diffuse Streifen (Pfeile), die nicht die tatsächlichen Streifenbreiten der Musterschablone darstellen, die 20, 10, 5, 2 m von oben nach unten sein sollten, wie in (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

VORTEILE der LIMAP (PRIMO) Mikromusterung und Der Vergleich mit dem Mikrokontaktdruck
Während Der Mikrokontaktdruck möglicherweise die am häufigsten verwendete Mikromustertechnik im biologischen Bereich^{ist 39}, scheint es eine wachsende Zahl von Forschern zu geben, die die LIMAP-Technologie⁴⁰^,⁴¹^,^{42 verwenden.} ^,⁴³^,⁴⁴. Hier haben wir ein Protokoll mit PRIMO vorgestellt, einem kommerziell erhältlichen System für LIMAP. Im Folgenden werden die potenziellen Vorteile und Einschränkungen des Mikrokontaktdrucks und der LIMAP-Fotomusterung kurz erläutert.

Microcontact-Druck erfordert lithographierte Master, die durch Spin-Coating einer Fotomaske (in der Regel SU-8) auf ein Glas oder Silizium-Wafer hergestellt werden, die dann mit den gewünschten Mikro-Features lasergeätzt wird. Diese Master werden als Vorlagen verwendet, um einen PDMS-Stempel⁴⁵zu erstellen. Der Stempel wird mit einem ausgewählten Protein inkubiert, das darauf adsorbiert, und dann auf die Zellkulturschale übertragen (gestempelt). Der Prozess der Adsorption des Proteins auf den PDMS-Stempel ist abhängig von Proteinkonzentration, Puffer und Inkubationszeit. Diese Parameter müssen vorher auf optimale Ergebnisse⁴⁶getestet werden.

Meister können in einer beträchtlichen Anzahl von Experimenten verwendet werden, die Monate oder sogar Jahre dauern, wenn sie richtig konserviert werden. Ein begrenzender Faktor dieser Technologie ist jedoch die Notwendigkeit, neue lithographierte Master für jede gewünschte Modifikation neu zu gestalten. Änderungen in experimentellen Konstruktionen können zu einer zeitaufwändigen Produktion neuer Master (bis zu mehreren Wochen) führen und somit Experimente verzögern. Im Vergleich dazu erfordert LIMAP Photopatterning keinen physischen Master; Es verwendet softwaregenerierte Mustervorlagen, mit denen gewünschte Geometrien von Mikromustern flexibel an sich verändernde Forschungsfragen angepasst werden können. LIMAP kann auch verwendet werden, um Proteingradienten innerhalb desselben Mikromusters zu erzeugen (Abbildung 8), was schwieriger ist, in einer reproduzierbaren Weise mit Mikrokontaktdruck zu erhalten⁴⁷.

Darüber hinaus beträgt die mit LIMAP erreichte Mikromusterauflösung in unserem Fall 2 m (Abbildung 6B).

Die Annäherung an diese Auflösung erhöhte die Intra- und Inter-Mustervariabilität. Das Erzeugen von Mustern um oder über einer Breite von 10 m war sehr reproduzierbar (Abbildung 6G,H). Im Gegenteil, beim Mikrokontaktdruck ist es schwierig, konstant Auflösungen unter 10 m zu erhalten, und es ist üblich, Artefakte beim Stempeln kleiner Features zu finden (Daten nicht dargestellt).

Wir haben gezeigt, dass LIMAP verwendet werden kann, um mehrere Proteine(Abbildung 9) innerhalb desselben Mikrobrunnens mikromustern zu lassen, so dass Den Experimenten weitere Komplexitätsstufen hinzugefügt werden können. Obwohl dies mit Deminitätsdruck erreicht werden könnte, kann die Ausrichtung verschiedener Proteine mit hoher Präzision technisch recht anspruchsvoll sein. Während das Mustern mehrerer Proteine mit LIMAP geradeaus erscheint, ist es wichtig zu erwähnen, dass die Kreuzbindung von Proteinen durch sequenzielle Beschichtungsverfahren durch blockende Reagenzien reduziert, aber nicht vollständig beseitigt werden kann (Abbildung 9).

In Bezug auf die Kosten für die eine oder andere Technik erfordert LIMAP, wie hier beschrieben, den Kauf von Mikro-Mustergeräten (PRIMO), die auf verschiedenen Fluoreszenzmikroskopen installiert werden können und eine motorisierte Stufe erfordern. Obwohl diese Investition zunächst kostenintensiv ist, gibt es langfristig keine zusätzlichen Käufe außer Verbrauchsgütern (Schablonen, PEG und PLPP), die mit LIMAP verbunden sind. Alternativ können die PDMS-Schablonen auch im Labor von dem eigenen Experimentator nach den veröffentlichten Protokollen¹⁸^,³²hergestellt werden. Die größten Kosten für den Mikrokontaktdruck können mit der Herstellung neuer Master verbunden sein, die erheblich werden können, wenn Experimente neue Muster erfordern.

Ein Nachteil von LIMAP ist der relativ niedrige Durchsatzansatz dieser Technik. Microcontact-Druck kann eine große Anzahl von Mikromustern schnell und effizient in einem simultanen Stanzschritt erzeugen, verglichen mit der erforderlichen sequenziellen Laser-Mikro-Musterung mit LIMAP. Zum Beispiel ist es möglich, 6 gestanzte Glasabdeckungen in ca. 2 h mit Mikrokontaktdruck mit PDMS-Stempeln (ohne Stempelvorbereitung) herzustellen; Die Musterung eines ähnlichen Bereichs (6-Well-Schale) mit LIMAP würde etwa 4 h dauern, mit Ausnahme des Verfahrens der Oberflächenpassivierung (unter Berücksichtigung der Mustervorlagenkonfiguration, die in Schritt 5.12 beschrieben wird und siehe Abbildung 5B).

Ein weiterer Ratenbegrenzungsfaktor der LIMAP-Technologie ist die lange Beleuchtungszeit, die für die Musterung großer Flächen erforderlich ist (30 s pro Konstruktionseinheit mit einem 7,5 mW/mm² Laser). In diesen Fällen kann das Drucken von Mikrokontakten eine bevorzugte Option sein. Ein neu verfügbarer Fotoinitiator (PLPP-Gel, Materialtabelle) sollte die Zeit für die Musterung erheblich reduzieren und die Erzeugung von Hunderten von Mikromustern in großen Bereichen (bis zu 8 mm²) in nur wenigen Minuten ermöglichen.

Ein weiterer wichtiger Faktor, der bei der Mikromusterung von Oberflächen für die Zellkultur zu berücksichtigen ist, ist die Reproduzierbarkeit der Mikromuster zwischen verschiedenen experimentellen Wiederholungen im Vergleich zur Variabilität beim Mikrokontaktdruck. Beispielsweise sind die in Abbildung 7B,D dargestellten Diagramme repräsentative Daten von drei unabhängigen experimentellen Wiederholungen mit sehr ähnlichen Ergebnissen (Daten nicht dargestellt). Basierend auf unserer Erfahrung und früheren Veröffentlichungen ist dieser Grad an Reproduzierbarkeit mit Mikrokontaktdruck⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²schwer zu erreichen.

Im Gegensatz zu anderen Fotomustertechniken, die entweder eine spezielle Chemie erfordern, um lichtempfindliche Materialien zu entwickeln, oder die Verwendung von Photosensibilisatoren, die im Allgemeinen nicht sehr biokompatibel sind³, ist die lichtempfindliche Komponente von LIMAP (PLPP) ) ist biokompatibel und durch zellen²¹gut verträglich; in unseren Händen haben wir keine Zytotoxizität über eine Vielzahl von Zellen erfahren, einschließlich CAD, DRG-Neuronen (Abbildung 10), Fibroblasten, Epithelzellen und Melanomzellen (Daten nicht gezeigt). Ein weiterer Vorteil von LIMAP mit PRIMO im Vergleich zu anderen Fotomustertechniken ist, dass keine Fotomaske erforderlich ist. Ähnlich wie beim Mikrokontaktdruck müssten für jedes gewünschte Muster neue Fotomasken entworfen und erzeugt werden.

Alle oben genannten Einschränkungen für den Mikrokontaktdruck finden Sie im manuellen Ansatz der Technik. Es ist jedoch möglich, den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit des Mikrokontaktdrucks mit einem automatisierten Gerät mit Stempellast und Druckregelung⁵³zu verbessern.

Wichtige Schritte des Protokolls und Problemlösung für LIMAP mit PRIMO
Eines der häufigsten Probleme, die während dieses Protokolls gefunden werden, ist ein hohes Maß an Hintergrundfluoreszenz innerhalb der Mikromuster. Dies kann auf das Austrocknen von Mikrobrunnen zurückzuführen sein, das häufig aufgrund ihres geringen Volumens auftritt. In diesem Fall erscheinen häufig PBS-Kristalle, die die ECM-Muster umgeben (Abbildung 11A).

Unzureichende oder ineffiziente Waschschritte nach der Proteininkubation können auch zu einer hohen Hintergrundfluoreszenz führen. Dies kann insbesondere bei der Verwendung von Proteinkonzentrationen von 10 g/ml (Abbildung 11B) oder höher beobachtet werden. Der Proteinüberschuss im Hintergrund kann durch zusätzliche Waschschritte mit PBS reduziert werden.

Das Vorhandensein von Proteinhintergrund muss in jedem Experiment gemessen und charakterisiert werden, wobei die Hintergrundfluoreszenzintensität (Abbildung 6E) berechnet und von der Mikromusterintensität subtrahiert wird (Abbildung 6F-H und Abbildung 7B,D). Ein hoher Proteinhintergrund kann sich auf die Anhaftung und das Keimen von CAD-Zellen auswirken und die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen.

Lücken zwischen Konstruktionseinheiten sind ein häufiges Problem, wenn Benutzer nur über begrenzte Erfahrung verfügen (Abbildung 11B), was auf eine unzureichende Überlappung zwischen Mustern zurückzuführen ist. Zwei Parameter in der Leonardo-Software können angepasst werden, um dies zu überwinden: 1) je nach Design des Musters kann ein negativer Abstand zwischen den Spalten erforderlich sein (Schritt 5.7 und siehe Abbildung 5B,C). Alternativ können Sie die Farbverlaufsoption im Menü "Experte" verwenden, um die Spalten zu nähen. Ein Schnelltest zur Bestimmung der optimalen Abstandsparameter kann mit UV-Klebstoff (Materialtabelle )durchgeführt werden. Ein kleiner Tropfen dieses Klebstoffs wird auf eine Glasrutsche aufgetragen, die dann mit einem Glasdeckel bedeckt wird, wodurch eine Folie entsteht. Der eingebettete UV-Klebstoff wird mit der Musterschablone von Interesse mit einer niedrigen Laserdosis (30 mJ/mm²⁾fotomustert. Die UV-exponierten Bereiche des eingebetteten Klebstoffs werden ausgehärtet und werden unter der Hellfeldmikroskopie sichtbar. Die Testergebnisse werden visualisiert, um den erhaltenen Abstand innerhalb des Musters auszuwerten. In unseren neuronalen Experimenten kann eine Lücke zwischen den Streifen das Zellverhalten negativ beeinflussen und zu Schwankungen in der Wachstumsdynamik führen (entweder reduzierte Geschwindigkeit oder Aufgabe des Pfades).

In der neuesten Aktualisierung der Leonardo-Software (zum Zeitpunkt der Veröffentlichung, Leonardo 4.11), ist es möglich, zuvor entworfene größere Mustervorlagen hochzuladen, die eine viel größere Fläche (bis zu 8 mm² mit dem 20X-Objektiv) der Mikrobrunnenoberfläche abdecken im Vergleich zu den aktuellen 0,1 mm² pro Konstruktionseinheit, so dass die kleineren Konstruktionseinheiten nicht zusammengefügt werden müssen. Undefinierte Kanten können auf einen Mangel an Laserfokusanpassung während der Mustergenerierung zurückzuführen sein (Abbildung 11C). Daher ist es wichtig, den Laser zu kalibrieren und Referenzmusterschritte (siehe Schritt 4) vor der Musterung durchzuführen. Schlecht definierte Streifen führen zu Abweichungen in der Streifenbreite, was die Korrelation zwischen Axonwachstumsdynamik und Streifenbreite erschwert. Axone neigen auch dazu, Streifen aufzugeben, die diffuse Kanten haben. Darüber hinaus kann die Variabilität der Kanten auch beim Drucken von Streifen mit einer Breite von 10-20 m oder höher gefunden werden, was zu einem höheren Proteingehalt an den Rändern im Vergleich zu den zentralen Bereichen des Musters führt (Abbildung 6B,D). Dieser Kanteneffekt wird durch eine nicht homogene Diffusion des Fotoinitiators während des Photomusterprozesses erzeugt. Die Photoscissionsreaktion ist sauerstoffabhängig, die mehr an den Rändern diffundiert. Dieser Kanteneffekt kann minimiert werden, um den Photoinitiator während des Photomusterprozesses mit einer Pipette im Mikrobrunnen zu homogenisieren. Darüber hinaus kann ein neuer kommerzialisierter Fotoinitiator (PLPP-Gel) auch den Edge-Effekt reduzieren (PRIMO System Support Team, persönliche Kommunikation).

Der Mikrodruck von mehr als einem Protein kann zu einer Kreuzbindung führen (Abbildung 9A-D). Dies kann minimiert werden, indem die Blockiereffizienz erhöht wird, die verwendet wird, um unspezifische Bindungsstellen zwischen den Inkubationsschritten für die beiden verschiedenen Proteine zu besetzen. Die Kreuzbindung von Proteinen kann die Reproduzierbarkeit von experimentellen Ergebnissen stören und zu einer Fehlinterpretation von Daten führen, da es schwierig ist, den Beitrag jedes Proteins zur Axonwachstumsdynamik und zu anderen Zellverhalten zu bestimmen.

Schlussfolgerung
Wir hoffen, dass das mit LIMAP bereitgestellte Protokoll die Erzeugung von Protein-Mikromustern durch den Einsatz des PRIMO-Systems erleichtert. Während sich unser Protokoll darauf konzentriert, wie Mikromuster in 2D-Glasoberflächen zuverlässig hergestellt werden können, haben andere gezeigt, dass es möglich ist, LIMAP für die Mikro-Musterung weicher Substrate⁵⁴und mikrostrukturierte Oberflächen für 3D-Kulturen⁴²zu verwenden. Diese Mikromuster können ein vielseitiges Werkzeug sein, um zelluläre Reaktionen auf Veränderungen in ihrer Mikroumgebung zu untersuchen.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird von BBSRC, EPSRC, MRC und Wellcome Trust unterstützt. Das C.B.-Labor ist Teil des Wellcome Trust Centre for Cell-Matrix Research, University of Manchester, das durch eine Kernfinanzierung des Wellcome Trust (Grant-Nummer 088785/Z/09/Z) unterstützt wird. Die Autoren möchten die Finanzierung durch den Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) an C.M., K.J. (BB/M020630/1) und P.A. (BB/P000681/1) sowie durch den Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council (EPSRC) und Medical Sciences Research Council ( Forschungsrat (MRC) Zentrum für Doktorandenausbildung in Regenerativer Medizin an A.K. (EP/L014904/1). Die Autoren danken Alvéole für ihre Korrespondenz und ihr After-Sales-Support-Team. Die Autoren danken Peter March und Roger Meadows von der Bioimaging Facility, University of Manchester, für ihre Hilfe bei der Mikroskopie. Die in dieser Studie verwendeten Mikroskope der Bioimaging Facility wurden mit Zuschüssen von BBSRC, Wellcome Trust und dem University of Manchester Strategic Fund erworben.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 488 protein labeling kit	Invitrogen	A10235	Working concentration: N.A.
Alexa 647 protein labeling kit	Invitrogen	A20173	Working concentration: N.A.
CAD cells	ECACC	8100805	Working concentration: N.A.
Conjugated fibrinogen-488	Molecular Probes	F13191	Working concentration: 10 μg/ml
DMEM culture medium	Gibco	11320033	Working concentration: N.A.
Epifluorescence Microscope**	Nikon	Eclipse Ti inverted	Working concentration: N.A.
Fibronectin	Sigma	F4759	Working concentration: 10 μg/ml (after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) (diluted in PBS)
Fiji-Image J	www.imagej.nih.gov	Version 2.0.0-rc-54/1.51f	Working concentration: N.A.
Fluorescent highlighter	Stabilo	Stabilo Boss Original	Working concentration: N.A.
HEPES	Gibco	15630080	Working concentration: 1M
Inkscape software	Inkscape	Check last update	Working concentration: N.A.
Laminin-red fluorescent rhodamine	Cytoskeleton, Inc.	LMN01	Working concentration: 10 μg/ml (diluted in PBS)
Leonardo software	Alvéole	version 4.11	Working concentration: N.A.
L-Glutamine	Sigma	G7513	Working concentration: 1%
Micro-manager software	Open imaging	Check last update	Working concentration: N.A.
Motorized x/y stage	PRIOR Scientific	Proscan II	Working concentration: N.A.
NIS Elements Software	Nikon	NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs)	Working concentration: N.A.
PBS (without Ca²⁺, Mg²⁺)	Sigma	D8537	Working concentration: 1X
PDMS Stencils	Alvéole	visit www.alveolelab.com	Working concentration: N.A.
PEG-SVA	Laysan bio, Inc.	MPEG-SVA-5000-1g	Working concentration: 50 mg/ml
Phalloidin 405	Abcam	ab176752	Working concentration: 1:1000
Photo-initiator (PLPP)	Alvéole	Classic PLPP	Working concentration: 14.5 mg/ml
Photo-initiator (PLPP gel)	Alvéole	PLPP gel	Working concentration: 4.76% diluted in ethanol
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G (115V) \| PDC-32G-2 (230V)	Working concentration: N.A.
PLL-PEG	SuSoS (also distributed by Alvéole)	www.alveolelab.com	Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS)
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707	Working concentration: 0.01%
Primo equipment	Alvéole	www.alveolelab.com	Working concentration: N.A.
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Working concentration: 1%
Tubulin anti-alpha antibody	Abcam	DM1A	Working concentration: 1:1000 CAD cells
Tubulin anti-beta 3 antibody	Sigma	T8660	Working concentration: 1:500 DRG neurons
UV adhesive	Norland Products	NOA81	Working concentration: N.A.
1 well glass bottom dish	Cellvis	D35-20-1.5-N	Working concentration: N.A.
6 well glass bottom dish	Cellvis	P06-20-1.5-N	Working concentration: N.A.
20x objective**	Nikon	no phase ring (check updated catalogue)	Working concentration: N.A. **Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alvéole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Alamdari, O. G., Seyedjafari, E., Soleimani, M., Ghaemi, N. Micropatterning of ECM Proteins on Glass Substrates to Regulate Cell Attachment and Proliferation. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (4), 234-240 (2013).
Sunami, H., Yokota, I., Igarashi, Y. Influence of the pattern size of micropatterned scaffolds on cell morphology, proliferation, migration and F-actin expression. Biomaterials Science. 2 (3), 399-409 (2014).
Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
Marino, A., et al. Two-photon polymerization of sub-micrometric patterned surfaces: investigation of cell-substrate interactions and improved differentiation of neuron-like cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (24), 13012-13021 (2013).
Joo, S., et al. Effects of ECM protein micropatterns on the migration and differentiation of adult neural stem cells. Scientific Reports. 5, (2015).
Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. K. Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning. Elife. 7, (2018).
Javaherian, S., O'Donnell, K. A., McGuigan, A. P. A Fast and Accessible Methodology for Micro-Patterning Cells on Standard Culture Substrates Using Parafilm (TM) Inserts. Plos One. 6 (6), (2011).
Smirnov, M. S., Cabral, K. A., Geller, H. M., Urbach, J. S. The effects of confinement on neuronal growth cone morphology and velocity. Biomaterials. 35 (25), 6750-6757 (2014).
Albert, P. J., Schwarz, U. S. Dynamics of Cell Ensembles on Adhesive Micropatterns: Bridging the Gap between Single Cell Spreading and Collective Cell Migration. PLOS Computational Biology. 12 (4), (2016).
Evans, A. R., et al. Laminin and fibronectin modulate inner ear spiral ganglion neurite outgrowth in an in vitro alternate choice assay. Developmental Neurobiology. 67 (13), 1721-1730 (2007).
Nichol, R. H., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of Axons by Local Coupling of Retrograde Flow to Point Contact Adhesions. Journal of Neuroscience. 36 (7), 2267-2282 (2016).
Burdick, J. A., Khademhosseini, A., Langer, R. Fabrication of gradient hydrogels using a microfluidics/photopolymerization process. Langmuir. 20 (13), 5153-5156 (2004).
Schwartz, P. V. Molecular transport from an atomic force microscope tip: A comparative study of dip-pen nanolithography. Langmuir. 18 (10), 4041-4046 (2002).
Barbulovic-Nad, I., et al. Bio-microarray fabrication techniques--a review. Critical Reviews in Biotechnology. 26 (4), 237-259 (2006).
Shafagh, R. Z., Vastesson, A., Guo, W. J., van der Wijngaart, W., Haraldsson, T. E-Beam Nanostructuring and Direct Click Biofunctionalization of Thiol-Ene Resist. Acs Nano. 12 (10), 9940-9946 (2018).
Kobayashi, J., Yamato, M., Itoga, K., Kikuchi, A., Okano, T. Preparation of microfluidic devices using micropatterning of a photosensitive material by a maskless, liquid-crystal-display projection method. Advanced Materials. 16 (22), (2004).
Bernard, A., et al. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
Fink, J., et al. Comparative study and improvement of current cell micro-patterning techniques. Lab Chip. 7 (6), 672-680 (2007).
Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
Belisle, J. M., Correia, J. P., Wiseman, P. W., Kennedy, T. E., Costantino, S. Patterning protein concentration using laser-assisted adsorption by photobleaching, LAPAP. Lab Chip. 8 (12), 2164-2167 (2008).
Belisle, J. M., Kunik, D., Costantino, S. Rapid multicomponent optical protein patterning. Lab Chip. 9 (24), 3580-3585 (2009).
Heinz, W. F., Hoh, M., Hoh, J. H. Laser inactivation protein patterning of cell culture microenvironments. Lab Chip. 11 (19), 3336-3346 (2011).
Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Thery, M., Piel, M. Protein Micropatterns: A Direct Printing Protocol Using Deep UVs. Microtubules: In Vivo. 97, 133-146 (2010).
Vignaud, T., Ennomani, H., Thery, M. Polyacrylamide hydrogel micropatterning. Methods in Cell Biology. 120, 93-116 (2014).
Waldbaur, A., Waterkotte, B., Schmitz, K., Rapp, B. E. Maskless projection lithography for the fast and flexible generation of grayscale protein patterns. Small. 8 (10), 1570-1578 (2012).
Kang, J., Choi, J. C., Kim, M., Jung, H. R., Doh, J. Photopatterning with a printed transparency mask and a protein-friendly photoresist. Methods in Cell Biology. 119, 55-72 (2014).
Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
Morlat, S., Gardette, J. L. Phototransformation of water-soluble polymers. Part II: photooxidation of poly(ethylene oxide) in aqueous solution. Polymer. 44 (26), 7891-7897 (2003).
Qi, Y., Wang, J. K., McMillian, M., Chikaraishi, D. M. Characterization of a CNS cell line, CAD, in which morphological differentiation is initiated by serum deprivation. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1217-1225 (1997).
Shrirao, A. B., et al. A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
Pankov, R., Momchilova, A. Fluorescent labeling techniques for investigation of fibronectin fibrillogenesis (labeling fibronectin fibrillogenesis). Methods in Molecular Biology. 522, 261-274 (2009).
Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12542-12547 (2002).
Chelli, B., et al. Neural cell alignment by patterning gradients of the extracellular matrix protein laminin. Interface Focus. 4 (1), (2014).
Tang, Y., Qiu, Q. F., Zhang, F. L., Xie, M., Huang, W. H. Quantifying orientational regeneration of injured neurons by natural product concentration gradients in a 3D microfluidic device. Lab Chip. 18 (6), 971-978 (2018).
Srinivasan, P., Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R. Synergistic effects of 3D ECM and chemogradients on neurite outgrowth and guidance: a simple modeling and microfluidic framework. PLoS One. 9 (6), (2014).
de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. J. Dorsal root ganglia neurons and differentiated adipose-derived stem cells: an in vitro co-culture model to study peripheral nerve regeneration. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
Khadpekar, A. J., Khan, M., Sose, A., Majumder, A. Low Cost and Lithography-free Stamp fabrication for Microcontact Printing. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
Delepine, C., et al. Altered microtubule dynamics and vesicular transport in mouse and human MeCP2-deficient astrocytes. Human Molecular Genetics. 25 (1), 146-157 (2016).
Decock, J., Schlenk, M., Salmon, J. B. In situ photo-patterning of pressure-resistant hydrogel membranes with controlled permeabilities in PEGDA microfluidic channels. Lab Chip. 18 (7), 1075-1083 (2018).
Stoecklin, C., et al. A New Approach to Design Artificial 3D Microniches with Combined Chemical, Topographical, and Rheological Cues. Advanced Biosystems. 2 (7), (2018).
Toraille, L., et al. Optical Magnetometry of Single Biocompatible Micromagnets for Quantitative Magnetogenetic and Magnetomechanical Assays. Nano Letters. , (2018).
Theodoly, O., et al. Live nanoscopic to mesoscopic topography reconstruction with an optical microscope for chemical and biological samples. PLoS One. 13 (12), (2018).
Ermis, M., Antmen, E., Hasirci, V. Micro and Nanofabrication methods to control cell-substrate interactions and cell behavior: A review from the tissue engineering perspective. Bioactive Materials. 3 (3), 355-369 (2018).
von Philipsborn, A. C., et al. Microcontact printing of axon guidance molecules for generation of graded patterns. Nature Protocols. 1 (3), 1322-1328 (2006).
Ricoult, S. G., Kennedy, T. E., Juncker, D. Substrate-bound protein gradients to study haptotaxis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, (2015).
Bietsch, A., Michel, B. Conformal contact and pattern stability of stamps used for soft lithography. Journal of Applied Physics. 88 (7), 4310-4318 (2000).
Hui, C. Y., Jagota, A., Lin, Y. Y., Kramer, E. J. Constraints on microcontact printing imposed by stamp deformation. Langmuir. 18 (4), 1394-1407 (2002).
Sharp, K. G., Blackman, G. S., Glassmaker, N. J., Jagota, A., Hui, C. Y. Effect of stamp deformation on the quality of microcontact printing: theory and experiment. Langmuir. 20 (15), 6430-6438 (2004).
Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Biebuyck, H. Stability of molded polydimethylsiloxane microstructures. Advanced Materials. 9 (9), 741-746 (1997).
Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21 (22), 2257-2268 (2009).
Chakra, E. B., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, C. D., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
Pasturel, A., Strale, P., Studer, V. Tailoring 3D cell culture templates with common hydrogels. bioRxiv. , (2019).

Neuroscience

Lichtinduzierte molekulare Adsorption von Proteinen mit dem PRIMO-System für Mikro-Patterning zur Untersuchung von Zellreaktionen auf extrazelluläre Matrixproteine

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.