Vores overordnede mål er at forstå, hvordan celler fornemmer ekstracellulære signaler, der fører til instrueret axonal vækst. Her beskriver vi metoden for lys-induceret Molekylær adsorption af proteiner, der anvendes til at producere definerede mikro-mønstre af ekstracellulære matrixkomponenter for at studere specifikke hændelser, der styrer Axon udvækst og Path Finding.
Celler fornemmer en række ekstracellulære signaler, herunder sammensætningen og geometrien af den ekstracellulære matrix, som er syntetiseret og ombygget af cellerne selv. Her præsenterer vi metoden for lys-induceret Molekylær adsorption af proteiner (LIMAP) ved hjælp af PRIMO-systemet som en mønster teknik til fremstilling af mikro-mønstrede ekstrellulære matrix (ECM) substrater ved hjælp af en enkelt eller en kombination af proteiner. Metoden gør det muligt at udskrive ECM-mønstre i micron-opløsning med fremragende reproducerbarhed. Vi leverer en trin-for-trin protokol og demonstrere, hvordan dette kan anvendes til at studere processerne i neuronal pathfinding. LIMAP har betydelige fordele i forhold til eksisterende mikro-print metoder med hensyn til lethed af mønstret mere end én komponent og evnen til at generere et mønster med enhver geometri eller gradient. Protokollen kan nemt tilpasses til at studere bidraget fra næsten enhver kemisk komponent mod celle skæbne og celle adfærd. Endelig drøfter vi fælles spørgsmål, der kan opstå, og hvordan disse kan undgås.
I de senere år har de biologiske videnskaber i stigende grad gjort brug af de fremskridt, som materiale videnskaberne har ydet. Et fremtrædende eksempel er mikromønstret af substrater, som kan bruges til at studere cellulære reaktioner såsom celle spredning1,2Differentiering3,4,5,6, celle overførsel7,8,9og patfinding10,11. Der er en række teknikker til rådighed, der muliggør mikro-mønstring af substrater, såsom multiphoton spændt fotokemi12, AFM dip-pen nanolithography13, PIN og inkjet direkte udskrivning14, elektronstråle litografi15eller microfluidics16. Men, to teknikker, der er meget udbredt i det biologiske område er microcontact Printing17,18,19eller laser assisteret mønster3(Figur 1). Laser-assisteret mønster anses for at levere mere pålidelige resultater i form af protein og PEG stabilitet og celle indeslutning på mønstrene, sammenlignet med microcontact Printing20. En mere ny tilgang til mikro-mønstret, der er beskrevet her, er brugen af let-induceret Molekylær adsorption af proteiner21(LIMAP,Figur 1 D) ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt system (PRIMO,Tabel over materialer). Hver af metoderne har fordele og begrænsninger, der er kort beskrevet nedenfor. Microcontact Printing bruger PDMS forme (frimærker) med ønskede mikro-funktioner, der genereres af litograferede mestre. Frimærkerne inkuberet med et valgt protein, som derefter overføres (stemplet) ind på cellekultur substratet18(Figur 1 A). Laser assisteret mønstning bruger UV-lys til at kløve en anti-fouling-film22,23,24,25, som udsætter regioner, der efterfølgende kan være belagt med det pågældende proteinFigur 1 B). Mens den opløsning, der er opnået med foto mønternes tilgange, er i micron-området25,26, de fleste af disse teknikker kræver en foto maske, enten i kontakt med prøven, eller beliggende i objekt planet af mikroskopet mål23,27,28. Kravene til masker i både mikrokontakt udskrivning og foto-mønster kan være en begrænsning; specifikke masker er nødvendige for hver geometrisk mønster og størrelse, som kan være dyrt og tidskrævende at generere. I modsætning til disse teknikker kræver LIMAP ikke en maske (Figur 1 D). Brug af PRIMO-systemet til LIMAP kan være omkostningskrævende i begyndelsen, fordi det kræver indkøb af udstyr. Men open source-software bruges til at designe mønstre af enhver ønsket geometri, hvilket giver meget mere frihed og tillader mere komplekse eksperimenter, herunder brugen af protein koncentrations gradienter. PRIMO laseren styres og ledes af en digitalt styret betegnelsen Micromirror Device-enhed (DMD) for at skabe mønstre i et vilkårligt antal brugerdefinerede geometrier. LIMAP kræver, at kultur overfladen er belagt med molekyler, der forhindrer celle fastgørelse. Polyethylenglycol (PEG) er mest almindeligt anvendt som sådan en “antifouling” reagens; det danner en tæt anti-klæbende film på glas eller plastik overflade29. Efterfølgende tilføjes en foto initiator, der gør det muligt at fjerne PIND filmen med høj præcision gennem en fotoscission-mekanisme30ved lokal udsættelse for UV-lys under kontrol af DMD. Disse PEG-fri regioner kan være belagt med proteiner, der adsorberes til den laser-ætsede overflade, genererer et mikro-mønster. Ved at variere laser effekt, kan forskellige mængder af PIND fjernes fra overfladen, så brugeren til at generere protein gradienter. PEG fjernelse og belægningen procedure kan gentages for at skabe mønstre med to eller flere særskilte proteiner i samme mikro-brønd21. De genererede mikro-mønstre giver klæbende overflader til celler, hvilket gør det muligt at studere celle adfærd. I vores studier bruger vi mikro-mønstret til at studere neurit eller Axon pathfinding af en neuronal cellelinje (CAD (Cathecholaminerge-a differentierede) celler31) eller primære rotte dorsale-rodganglion (DRG) neuroner. Her skitserer vi en trin-for-trin protokol for LIMAP (Figur 2) ved hjælp af det kommercielt tilgængelige PRIMO-system og ledsagende Leonardo-software. Vi demonstrerer, hvordan det kan bruges til generering af mønstre med definerede geometrier og flere proteiner, som vi bruger til at studere axonal pathfinding. Vi diskuterer fælles spørgsmål, der kan opstå, og hvordan disse kan undgås.
LIMAP (PRIMO) mikro-mønster fordele og sammenligning med microcontact Printing
Mens mikrokontakt udskrivning er muligvis den mest almindeligt anvendte mikro-mønster teknik i det biologiske felt39, der synes at være et stigende antal forskere ved hjælp af limap teknologi40,41,42 ,43,44. Her præsenterede vi en protokol ved hjælp af PRIMO, et kommercielt tilgængeligt system til LIMAP. Nedenfor diskuterer vi kort mulige fordele og begrænsninger ved mikrokontaktudskrivning og LIMAP-foto mønster.
Mikrokontakt udskrivning kræver litograferede mestre produceret af spin-coating en foto maske (generelt SU-8) på et glas eller silicium wafer, som derefter laser-ætset med de ønskede mikro-funktioner. Disse mastere bruges som skabeloner til at oprette et PDMS-stempel45. Stemplet er inkuberet med et valgt protein, der Adsorber til det, og derefter overføres (stemplet) på cellen kultur parabol. Adsorptionsprocessen af proteinet til PDMS-stemplet er afhængig af proteinkoncentration, buffer og inkubationstiden. Disse parametre skal testes på forhånd for optimale resultater46.
Masters kan bruges i et stort antal eksperimenter, der varer i måneder eller endda år, hvis korrekt bevaret. Men, en begrænsende faktor for denne teknologi er nødvendigheden af at re-designe nye litograferede mestre for hver ønsket modifikation. Ændringer i eksperimentelle design kan resultere i tidskrævende produktion af nye mestre (op til flere uger) og dermed forsinke eksperimenter. Til sammenligning kræver LIMAP photopatterning ikke en fysisk Master; Det bruger software-genererede mønster skabeloner, der kan bruges til fleksibelt tilpasse ønskede geometrier af mikro-mønstre til at ændre forskningsspørgsmål. LIMAP kan også bruges til at generere protein gradienter inden for samme mikro-mønster (figur 8), som er sværere at opnå på en reproducerbar måde ved hjælp af microcontact Printing47.
Desuden er den mikro-mønster opløsning opnået med LIMAP, i vores tilfælde, er 2 μm (figur 6B).
Nærmer sig denne resolution øget intra-og Inter-mønster variabilitet. Generering af mønstre omkring eller over 10 μm bredde var meget reproducerbar (figur 6G, H). Tværtimod, med mikrokontakt udskrivning er det svært at konsekvent opnå opløsninger under 10 μm, og det er almindeligt at finde artefakter, når stempling små funktioner (data ikke vist).
Vi har vist, at LIMAP kan anvendes til mikro-mønster flere proteiner (figur 9) inden for samme mikro-brønd, så yderligere niveauer af kompleksitet, der skal føjes til eksperimenter. Selv om dette kunne opnås med mikrokontakt udskrivning, tilpasse forskellige proteiner med høj præcision kan være teknisk temmelig krævende. Mens mønstret flere proteiner ved hjælp af LIMAP synes ligetil, er det vigtigt at nævne, at krydsbinding af proteiner gennem sekventiel belægning procedurer kan reduceres gennem blokerende reagenser, men ikke helt elimineret (figur 9).
Med hensyn til omkostningerne ved den ene eller den anden teknik, LIMAP som beskrevet her kræver køb af mikro-mønstring udstyr (PRIMO), der kan installeres på forskellige fluorescens mikroskoper og kræver en motoriseret fase. Selv om denne investering i første omgang er omkostningsintensiv, er der ingen andre Køb end forbrugsvarer (stencils, PEG og PLPP) på det lange løb forbundet med LIMAP. Alternativt kan PDMS stencils også produceres i laboratoriet af egen eksperimententer efter offentliggjorte protokoller18,32. De største omkostninger til mikrokontakttrykning kan være forbundet med produktion af nye mestre, som kan blive betydelige, hvis eksperimenter kræver nye mønstre.
En ulempe ved LIMAP er den relativt lave gennemløb tilgang af denne teknik. Mikrokontakt udskrivning kan producere et stort antal mikro-mønstre hurtigt og effektivt i en samtidig stempling trin, sammenlignet med den krævede sekventielle laser mikro-mønstring med LIMAP. For eksempel er det muligt at producere 6 stemplet glas dæksedler i ca 2 h med mikrokontakt udskrivning ved hjælp af PDMS frimærker (undtagen stempel præparat); mønstret et lignende område (6-brønd skål) med LIMAP ville tage omkring 4 h, undtagen proceduren for overflade passivering (i betragtning af mønster skabelon konfigurationen beskrevet i trin 5,12 og se figur 5B).
En anden sats begrænsende faktor for LIMAP-teknologien er den lange belysnings tid, der kræves til at mønstret store områder (30 s pr. design enhed med en 7,5 mW/mm2 -laser). I disse tilfælde kan udskrivning af mikrokontakter være en foretrukken mulighed. En nyligt tilgængelig foto-initiator (PLPP gel, tabel over materialer) bør betydeligt reducere den tid, der tages for mønstret, så generation af hundredvis af mikro-mønstre i store områder (op til 8 mm2) på blot et par minutter.
En anden vigtig faktor at tage hensyn til, når mikro-mønstrende overflader for cellekultur er reproducerbarhed af mikro-mønstre blandt forskellige eksperimentelle gentagelser, i forhold til variabiliteten opnået med mikrokontakt trykning. For eksempel er de grafer, der er vist i figur 7B, D repræsentative data for tre uafhængige eksperimentelle gentagelser med meget ens resultater (data ikke vist). Baseret på vores erfaring og tidligere publikationer, er dette niveau af reproducerbarhed vanskeligt at opnå med microcontact Printing48,49,50,51,52.
I modsætning til andre foto mønster teknikker, der kræver enten dedikeret kemi til ingeniør fotosensitive materialer eller brug af fotosensibiliserende stoffer, som generelt ikke er meget biokompatible3, er den lysfølsomme bestanddel af limap (plpp ) er biokompatibelt og veltolereret af cellerne21; i vores hænder har vi ikke oplevet nogen cytotoksicitet på tværs af en række celler, herunder CAD, DRG neuroner (figur 10), fibroblaster, epiteliale celler og melanom celler (data ikke vist). En anden fordel ved limap ved hjælp af primo sammenlignet med andre foto-mønster teknikker er, at ingen Mask er påkrævet. Svarende til microcontact Printing, nye photomspørger skal designes og genereres for hver ønsket mønster.
Alle de begrænsninger, som er nævnt ovenfor for microcontact Printing, henvises til den manuelle fremgangsmåde af teknikken. Det er dog muligt at forbedre dataoverførselshastigheden og reproducerbarhed af mikrokontaktudskrivning ved hjælp af en automatiseret enhed med stempel belastning og tryk kontrol53.
Vigtige trin i protokollen og problemer med at løse for LIMAP ved hjælp af PRIMO
Et af de mest almindeligt forekommende problemer i denne protokol er at have høje niveauer af baggrunds fluorescens i mikro-mønstre. Dette kan skyldes udtørring af mikro-brønde, som ofte opstår på grund af deres lille volumen. Når dette sker, vises PBS-krystaller ofte omkring ECM-mønstrene (Figur 11A).
Utilstrækkelig eller ineffektiv vask trin efter protein inkubation kan også resultere i høje niveauer af baggrunds fluorescens. Dette kan især iagttages ved anvendelse af proteinkoncentrationer på 10 μg/mL (Figur 11B) eller derover. Det overskydende protein i baggrunden kan reduceres ved at medtage yderligere vaske trin med PBS.
Tilstedeværelsen af protein baggrund skal måles og karakteriseres i hvert eksperiment, beregning af baggrunden fluorescens intensitet (figur 6E) og trække det fra mikro-mønstre intensitet (figur 6F-H og figur 7B, D). Høj protein baggrund kan have en indvirkning på fastgørelse og spiring af CAD-celler, kompromittere fortolkningen af resultater.
Det er et almindeligt problem at have huller mellem design enheder, når brugerne har begrænset erfaring (Figur 11B), hvilket skyldes utilstrækkelig overlapning mellem mønstrene. To parametre i Leonardo software kan justeres for at overvinde dette: 1) en negativ afstand mellem kolonnerne kan være påkrævet, afhængigt af udformningen af mønsteret (trin 5,7 og se figur 5B, C). Alternativt, 2) Brug gradient option i ekspert menuen til at sy kolonnerne. En hurtig test til at bestemme de optimale afstands parametre kan udføres ved hjælp af UV-klæbemiddel (tabel over materialer). En lille dråbe af denne lim påføres en glas rutsjebane, som derefter dækkes med en glas dækseddel, der laver en film. Den indlejrede UV klæbemiddel er photopatterned med mønsteret skabelon af interesse ved hjælp af en lav laser dosis (30 mJ/mm2). De UV-udsatte områder af den indlejrede klæbemiddel vil blive helbredt, bliver synlige under lyse-felt mikroskopi. Testresultaterne visualiseres for at evaluere den opnåede afstand inden for mønsteret. I vores neuronal eksperimenter, en kløft mellem striber kan påvirke celle adfærd, der producerer variationer i vækstdynamik (enten reduceret hastighed eller nedlæggelse af stien).
I den seneste opdatering af Leonardo software (på tidspunktet for offentliggørelsen, Leonardo 4,11), er det muligt at uploade tidligere designede større mønster skabeloner, der dækker et meget større område (op til 8 mm2 ved hjælp af 20x mål) af mikro-brønd overflade sammenlignet med den nuværende 0,1 mm2 pr. design enhed, hvilket eliminerer behovet for at sy de mindre design enheder sammen. Udefineret kanter kan skyldes manglende justering af laser fokus under mønster generering (Figur 11C). Det er derfor afgørende at kalibrere laseren og udføre reference mønster trin (Se trin 4) før mønstret. Dårligt definerede striber resulterer i variationer i stribe bredde, hvilket gør korrelationen mellem Axon vækstdynamik og stribe bredde vanskelig. Axons har også tendens til at opgive striber, der har diffbrugte kanter. Desuden kan variabilitet i kanter også findes, når der udskrives striber på 10-20 μm bredde eller højere, hvilket resulterer i et højere proteinindhold i kanterne sammenlignet med de centrale områder af mønsteret (figur 6B, D). Denne Edge effekt er produceret af en ikke-homogen diffusion af foto-initiator under photopatterning proces. Photoscission reaktionen er iltafhængig, som spreder mere i kanterne. Denne kant effekt kan minimeres ved at homogenisere foto initiatoren med en pipette i mikro-brønden under fotopatterprocessen. Desuden, en ny kommercialiseret foto-initiator (PLPP gel), kan også reducere Edge effekt (PRIMO system support team, personlig kommunikation).
Mikroprintning af mere end ét protein kan resultere i krydsbinding (figur 9A-D). Dette kan minimeres ved at øge den blokerende effektivitet, der bruges til at besætte uspecifikke bindingssteder mellem inkubations trinene for de to forskellige proteiner. Krydsbinding af proteiner kan forstyrrer reproducerbarhed af eksperimentelle resultater og kan føre til fejlfortolkning af data, da det er vanskeligt at bestemme bidraget fra hvert protein til Axon vækstdynamik og til andre celle adfærd.
Konklusion
Vi håber, at den medfølgende protokol ved hjælp af LIMAP letter genereringen af protein mikro-mønstre gennem brug af PRIMO-systemet. Mens vores protokol fokuserer på, hvordan man pålideligt producerer mikro-mønstre i 2D glasoverflader, andre har vist, at det er muligt at bruge LIMAP til mikro-mønstring af bløde substrater54, og mikrostrukturerede overflader til 3D-kulturer42. Disse mikro-mønstre kan være et alsidigt værktøj til at studere cellulære reaktioner på ændringer i deres mikro-miljø.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde understøttes af BBSRC, EPSRC, MRC og Wellcome Trust. C.B. laboratoriet er en del af Wellcome Trust Center for Cell-matrix Research, University of Manchester, som understøttes af kernefinansiering fra Wellcome Trust (tilskudsnummer 088785/Z/09/Z). Forfatterne ønsker at anerkende de midler, der er ydet af Forskningsrådet for bioteknologi og biologisk videnskab (BBSRC) til C.M., K.J. (BB/M020630/1) og P.A. (BB/P000681/1) og af Forskningsrådet for Ingeniørvidenskab og fysik (EPSRC) og medicinsk Forskningsråd (MRC) Center for ph. d.-uddannelse i regenerativ medicin til A.K. (EP/L014904/1). Forfatterne takker Alvéole for deres korrespondance og deres eftersalgssupport team. Forfatterne takker Peter march og Roger Meadows fra bioimaging Facility, University of Manchester for deres hjælp med mikroskopi. Bioimaging Facility mikroskoper, der anvendes i denne undersøgelse blev købt med tilskud fra BBSRC, Wellcome Trust og University of Manchester Strategic fund.
Alexa 488 protein labeling kit | Invitrogen | A10235 | Working concentration: N.A. |
Alexa 647 protein labeling kit | Invitrogen | A20173 | Working concentration: N.A. |
CAD cells | ECACC | 8100805 | Working concentration: N.A. |
Conjugated fibrinogen-488 | Molecular Probes | F13191 | Working concentration: 10 μg/ml |
DMEM culture medium | Gibco | 11320033 | Working concentration: N.A. |
Epifluorescence Microscope** | Nikon | Eclipse Ti inverted | Working concentration: N.A. |
Fibronectin | Sigma | F4759 | Working concentration: 10 μg/ml (after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) (diluted in PBS) |
Fiji-Image J | www.imagej.nih.gov | Version 2.0.0-rc-54/1.51f | Working concentration: N.A. |
Fluorescent highlighter | Stabilo | Stabilo Boss Original | Working concentration: N.A. |
HEPES | Gibco | 15630080 | Working concentration: 1M |
Inkscape software | Inkscape | Check last update | Working concentration: N.A. |
Laminin-red fluorescent rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | LMN01 | Working concentration: 10 μg/ml (diluted in PBS) |
Leonardo software | Alvéole | version 4.11 | Working concentration: N.A. |
L-Glutamine | Sigma | G7513 | Working concentration: 1% |
Micro-manager software | Open imaging | Check last update | Working concentration: N.A. |
Motorized x/y stage | PRIOR Scientific | Proscan II | Working concentration: N.A. |
NIS Elements Software | Nikon | NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs) | Working concentration: N.A. |
PBS (without Ca2+, Mg2+) | Sigma | D8537 | Working concentration: 1X |
PDMS Stencils | Alvéole | visit www.alveolelab.com | Working concentration: N.A. |
PEG-SVA | Laysan bio, Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | Working concentration: 50 mg/ml |
Phalloidin 405 | Abcam | ab176752 | Working concentration: 1:1000 |
Photo-initiator (PLPP) | Alvéole | Classic PLPP | Working concentration: 14.5 mg/ml |
Photo-initiator (PLPP gel) | Alvéole | PLPP gel | Working concentration: 4.76% diluted in ethanol |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V) | Working concentration: N.A. |
PLL-PEG | SuSoS (also distributed by Alvéole) | www.alveolelab.com | Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS) |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | Working concentration: 0.01% |
Primo equipment | Alvéole | www.alveolelab.com | Working concentration: N.A. |
Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Working concentration: 1% |
Tubulin anti-alpha antibody | Abcam | DM1A | Working concentration: 1:1000 CAD cells |
Tubulin anti-beta 3 antibody | Sigma | T8660 | Working concentration: 1:500 DRG neurons |
UV adhesive | Norland Products | NOA81 | Working concentration: N.A. |
1 well glass bottom dish | Cellvis | D35-20-1.5-N | Working concentration: N.A. |
6 well glass bottom dish | Cellvis | P06-20-1.5-N | Working concentration: N.A. |
20x objective** | Nikon | no phase ring (check updated catalogue) | Working concentration: N.A. **Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alvéole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera. |