हमारा समग्र उद्देश्य यह समझने के लिए है कि कोशिकाओं को कैसे अतिरिक्त कोशिकीय संकेतों को समझना है जो निर्देशित एक्सोनल विकास की ओर ले जाते हैं। यहाँ, हम प्रोटीन के प्रकाश-प्रेरित आण्विक अवशोषण की पद्धति का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग एक्सॉन आउटग्रोथ और पथखोज को नियंत्रित करने वाली विशिष्ट घटनाओं का अध्ययन करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स घटकों के परिभाषित सूक्ष्म-पैटर्नका उत्पादन करने के लिए किया जाता है।
कोशिकाओं को extracellular संकेतों की एक किस्म भावना, संरचना और extracellular मैट्रिक्स की ज्यामिति सहित, जो संश्लेषित और कोशिकाओं द्वारा खुद को remodeled है. यहाँ, हम प्रोटीन के एक या संयोजन का उपयोग कर सूक्ष्म-पैटर्नवाले एक्स्ट्राकोल्यूलर मैट्रिक्स (ईसीएम) substrates का उत्पादन करने के लिए एक पैटर्न तकनीक के रूप में PRIMO प्रणाली का उपयोग प्रोटीन के प्रकाश-प्रेरित आण्विक अवशोषण (LIMAP) की विधि प्रस्तुत करते हैं। विधि उत्कृष्ट reproducibility के साथ माइक्रोन संकल्प में ईसीएम पैटर्न के मुद्रण सक्षम बनाता है। हम एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और यह न्यूरॉन pathfinding की प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है. LIMAP एक से अधिक घटक पैटर्न की आसानी और किसी भी ज्यामिति या ढाल के साथ एक पैटर्न उत्पन्न करने की क्षमता के मामले में मौजूदा सूक्ष्म मुद्रण विधियों पर महत्वपूर्ण लाभ है. प्रोटोकॉल आसानी से सेल भाग्य और सेल व्यवहार की दिशा में लगभग किसी भी रासायनिक घटक के योगदान का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. अंत में, हम आम मुद्दों पर चर्चा करते हैं जो उत्पन्न हो सकते हैं और इनसे कैसे बचा जा सकता है।
हाल के वर्षों में, जैविक विज्ञान तेजी से सामग्री विज्ञान द्वारा प्रदान की अग्रिमों का उपयोग किया है. इसका एक प्रमुख उदाहरण सब्स्ट्राट्स का माइक्रो-पैटर्निंग है, जिसका उपयोग सेल प्रसार जैसी सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।1,2भेदभाव3,4,5,6, सेल प्रवास7,8,9और पथखोज10,11. वहाँ उपलब्ध तकनीकों की एक संख्या है कि इस तरह के multiphoton उत्साहित photochemistry के रूप में substrates के माइक्रो-पैटर्निंग सक्षम कर रहे हैं12, एएफएम डिप-पेन नैनोलिथोग्राफी13, पिन और इंकजेट प्रत्यक्ष मुद्रण14, इलेक्ट्रॉन किरणपुंज लिथोग्राफी15या माइक्रोफ्लूइडिक्स16. हालांकि, दो तकनीक है कि व्यापक रूप से जैविक क्षेत्र में उपयोग किया जाता है microcontact मुद्रण कर रहे हैं17,18,19या लेसर-सहायता पैटर्निंग3(चित्र 1). लेजर की मदद पैटर्न प्रोटीन और खूंटी स्थिरता और पैटर्न पर सेल कारावास के मामले में अधिक विश्वसनीय परिणाम देने के लिए माना जाता है, microcontact मुद्रण की तुलना में20. यहाँ वर्णित माइक्रो-पैटर्निंग के लिए एक अधिक उपन्यास दृष्टिकोण प्रोटीन के प्रकाश-प्रेरित आण्विक अवशोषण का उपयोग है21(LIMAP,चित्र 1 D) एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग कर (PRIMO,सामग्री की तालिका). तरीकों में से प्रत्येक लाभ और सीमाओं है कि संक्षेप में नीचे वर्णित हैं. माइक्रोसंपर्क प्रिंटिंग में लिथोग्राफी किए गए मास्टरों से उत्पन्न होने वाली वांछित सूक्ष्म-विशेषताओं के साथ पीडीएमएस मोल्ड (स्टाम्प) का उपयोग किया जाता है। टिकटों को एक चुने हुए प्रोटीन के साथ इनक्यूबेट किया जाता है जिसे सेल कल्चर सब्सट्रेट पर स्थानांतरित किया जाता है (स्टैम्प्ड)18(चित्र 1 एक). लेजर की मदद से पैटर्न एक विरोधी fouling फिल्म को छोड़ने के लिए यूवी प्रकाश का उपयोग करता है22,23,24,25, उन क्षेत्रों को उजागर करना जिन्हें बाद में ब्याज के प्रोटीन के साथ लेपित किया जा सकता है (चित्र 1 बी). जबकि फोटो-पैटर्निंग दृष्टिकोण के साथ प्राप्त संकल्प माइक्रोन रेंज में है25,26, इन तकनीकों में से अधिकांश एक फोटो मास्क की आवश्यकता होती है, या तो नमूने के साथ संपर्क में, या माइक्रोस्कोप उद्देश्य के वस्तु विमान में स्थित23,27,28. दोनों microcontact मुद्रण और फोटो-पैटर्निंग में मास्क के लिए आवश्यकताओं को एक सीमा हो सकती है; विशिष्ट मास्क हर ज्यामितीय पैटर्न और आकार है, जो महंगा हो सकता है और उत्पन्न करने के लिए समय लेने के लिए आवश्यक हैं। इन तकनीकों के विपरीत, LIMAP एक मुखौटा की आवश्यकता नहीं है (चित्र 1 D). LIMAP के लिए PRIMO प्रणाली का उपयोग शुरू में गहन लागत हो सकता है क्योंकि यह उपकरणों की खरीद की आवश्यकता है. हालांकि, खुला स्रोत सॉफ्टवेयर किसी भी वांछित ज्यामिति के पैटर्न डिजाइन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और अधिक स्वतंत्रता दे रही है और प्रोटीन एकाग्रता gradients के उपयोग सहित अधिक जटिल प्रयोगों की अनुमति. PRIMO लेजर नियंत्रित और एक डिजिटल नियंत्रित micromirror डिवाइस द्वारा निर्देशित है (DMD) उपयोगकर्ता परिभाषित geometries के किसी भी संख्या में पैटर्न बनाने के लिए. LIMAP की आवश्यकता है संस्कृति सतह अणुओं है कि सेल लगाव को रोकने के साथ लेपित किया जा करने के लिए. पॉलीथीन ग्लाइकोल (PEG) सबसे अधिक इस तरह के एक “antifouling” अभिकर्मक के रूप में प्रयोग किया जाता है; यह कांच या प्लास्टिक की सतह पर एक घने एंटी-चिपकने वाला फिल्म बनाता है29. बाद में, एक फोटो-इनेटर जोड़ा जाता है जो खूंटी फिल्म को फोटोसिस तंत्र के माध्यम से उच्च परिशुद्धता के साथ हटाया जा सकता है30DMD के नियंत्रण में यूवी प्रकाश के लिए स्थानीय जोखिम द्वारा. इन खूंटी मुक्त क्षेत्रों प्रोटीन है कि लेजर etched सतह के लिए adsorb के साथ लेपित किया जा सकता है, एक माइक्रो-पैटर्न पैदा. लेजर शक्ति अलग करके, खूंटी की विभिन्न मात्रा उपयोगकर्ता प्रोटीन gradients उत्पन्न करने के लिए अनुमति सतह से हटाया जा सकता है. खूंटी हटाने और कोटिंग प्रक्रिया एक ही माइक्रो अच्छी तरह से दो या दो से अधिक अलग प्रोटीन के साथ पैटर्न बनाने के लिए दोहराया जा सकता है21. उत्पन्न माइक्रो-पैटर्न कोशिकाओं के लिए चिपकने वाला सतहों प्रदान करते हैं, सेल व्यवहार के अध्ययन की अनुमति. हमारे अध्ययन में, हम एक न्यूरोनल सेल लाइन के न्यूराइट या एक्सॉन पाथफाइंडिंग का अध्ययन करने के लिए माइक्रो-पैटर्निंग का उपयोग करते हैं (सीएडी (कैथेकोलोमाइनर्जिक-एक विभेदित) कोशिकाओं31) या प्राथमिक चूहा पृष्ठीय जड़ गुच्छिका (DRG) न्यूरॉन्स, क्रमशः. यहाँ, हम LIMAP के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल रूपरेखा (चित्र 2) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध PRIMO प्रणाली और साथ लियोनार्डो सॉफ्टवेयर का उपयोग कर। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह कैसे परिभाषित geometries और कई प्रोटीन है, जो हम axonal pathfinding का अध्ययन करने के लिए उपयोग के साथ पैटर्न की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम आम मुद्दों पर चर्चा करते हैं जो उत्पन्न हो सकते हैं और इनसे कैसे बचा जा सकता है।
LIMAP (PRIMO) माइक्रो-पैटर्निंग लाभ और माइक्रो-संपर्क प्रिंटिंग के साथ तुलना
जबकि माइक्रोसंपर्क प्रिंटिंग संभवतः जैविक क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया माइक्रो-पैटर्निंग तकनीकहै 39, वहाँ LIMAP प्रौद्योगिकी का उपयोग कर शोधकर्ताओं की बढ़ती संख्या हो रहा है40,41,42 ,43,44. यहाँ, हम PRIMO, LIMAP के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया. नीचे हम संक्षेप में संभावित लाभ और microcontact मुद्रण और LIMAP फोटो-पैटर्निंग की सीमाओं पर चर्चा.
माइक्रोसंपर्क प्रिंटिंग के लिए स्पिन-कोटिंग द्वारा उत्पादित लिथोग्राफी किए गए मास्टरों की आवश्यकता होती है, जो एक ग्लास या सिलिकॉन वेफर पर एक फोटो-मास्क (आमतौर पर एसयू-8) का उत्पादन करता है, जो तब वांछित सूक्ष्म-सुविधाओं के साथ लेजर-एबिटड किया जाता है। इन मास्टरों का उपयोग पीडीएमएस स्टाम्प45बनाने के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जाता है . टिकट एक चुना प्रोटीन है कि यह करने के लिए adsorbs के साथ incubated है, और फिर सेल संस्कृति पकवान पर स्थानांतरित (स्टैम्प्ड) है. पीडीएमएस स्टाम्प को प्रोटीन के अधिशोषण की प्रक्रिया प्रोटीन एकाग्रता, बफर और ऊष्मायन समय पर निर्भर करती है। इष्टतमपरिणामोंके लिए इन पैरामीटरों का पहले से परीक्षण किए जाने की आवश्यकता है .
परास्नातक प्रयोगों की एक पर्याप्त संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है, महीनों या यहां तक कि साल के लिए स्थायी, अगर सही ढंग से संरक्षित. हालांकि, इस तकनीक का एक सीमित कारक हर वांछित संशोधन के लिए नए लिथोग्राफी स्वामी को फिर से डिजाइन करने की आवश्यकता है। प्रयोगात्मक डिजाइनों में परिवर्तन के परिणामस्वरूप नए स्वामी (कई सप्ताह तक) के समय लेने वाली उत्पादन में इस प्रकार के प्रयोगों में देरी हो सकती है। इसकी तुलना में, LIMAP photopaterning एक भौतिक मास्टर की आवश्यकता नहीं है; यह सॉफ्टवेयर जनित पैटर्न टेम्पलेट्स का उपयोग करता है जो अनुसंधान प्रश्नों को बदलने के लिए माइक्रो-पैटर्न ्सके वांछित geometries को अनुकूलित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। LIMAP का उपयोग उसी माइक्रो-पैटर्न में प्रोटीन ग्रेडिएंट उत्पन्न करने के लिए भी किया जा सकता है (चित्र 8) जो माइक्रो-संपर्क मुद्रण47का उपयोग करके पुन: उत्पादन योग्य तरीके से प्राप्त करना कठिन है.
इसके अलावा, हमारे मामले में, LIMAP के साथ प्राप्त माइक्रो-पैटर्न संकल्प 2 डिग्री उ है(चित्र 6ठ)।
इस संकल्प को आ रहा अंतर और अंतर पैटर्न परिवर्तनशीलता में वृद्धि हुई. 10 डिग्री मीटर चौड़ाई के आस-पास या उससे ऊपर के पैटर्न उत्पन्न करना अत्यधिक पुनरुत्पाद्य था (चित्र 6जी, एच)। इसके विपरीत, माइक्रो-संपर्क मुद्रण के साथ यह लगातार 10 डिग्री से नीचे संकल्प प्राप्त करने के लिए मुश्किल है और यह कलाकृतियों को खोजने के लिए जब छोटी सुविधाओं (डेटा नहीं दिखाया) मुद्रांकन करने के लिए आम है।
हमने दिखाया है कि LIMAP का उपयोग माइक्रो-पैटर्न एकाधिक प्रोटीनों (चित्र 9) के लिए एक ही सूक्ष्म कूप के भीतर किया जा सकता है, जिससे प्रयोगों में जटिलता के और स्तर को जोड़ा जा सकता है। हालांकि इस microcontact मुद्रण के साथ प्राप्त किया जा सकता है, परिशुद्धता के उच्च स्तर के साथ विभिन्न प्रोटीन aligning तकनीकी रूप से बल्कि मांग की जा सकती है. LIMAP का उपयोग कर कई प्रोटीन पैटर्न Whilst सीधे आगे लगता है, यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि अनुक्रमिक कोटिंग प्रक्रियाओं के माध्यम से प्रोटीन के पार बाध्यकारी अभिकर्मकों अवरुद्ध के माध्यम से कम किया जा सकता है लेकिन पूरी तरह से समाप्त नहीं (चित्र 9).
एक या अन्य तकनीक की लागत के बारे में, LIMAP यहाँ वर्णित के रूप में माइक्रो-पैटर्निंग उपकरण (PRIMO) है कि विभिन्न फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर स्थापित किया जा सकता है और एक motorized चरण की आवश्यकता है की खरीद की आवश्यकता है. हालांकि यह निवेश शुरू में गहन लागत है, वहाँ कोई अतिरिक्त खरीद कर रहे हैं के अलावा अन्य कोई उपभोग्य वस्तुओं (stencils, खूंटी और PLPP) लंबे समय LIMAP के साथ जुड़े पर. वैकल्पिक रूप से, प्रकाशित प्रोटोकॉल18,32के बाद स्वयं प्रयोगकर्ता द्वारा पीडीएमएस स्टेंसिल का भी प्रयोगशाला में उत्पादन किया जा सकता है। microcontact मुद्रण के लिए सबसे बड़ी लागत नए स्वामी के उत्पादन के साथ जुड़ा हो सकता है, जो पर्याप्त हो सकता है अगर प्रयोगों नए पैटर्न की आवश्यकता हो सकती है.
LIMAP का एक दोष इस तकनीक के अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट दृष्टिकोण है. माइक्रोसंपर्क प्रिंटिंग एक साथ स्टैंपिंग चरण में बड़ी संख्या में माइक्रो-पैटर्न्स का उत्पादन कर सकता है, जबकि LIMAP के साथ आवश्यक अनुक्रमिक लेजर माइक्रो-पैटर्निंग की तुलना में। उदाहरण के लिए, पीडीएमएस टिकटों (टिकट तैयार करने को छोड़कर) का उपयोग करके माइक्रो-संपर्क प्रिंटिंग के साथ लगभग 2 एच में 6 स्टाम्प ग्लास कवरलिप्स का उत्पादन करना संभव है; LIMAP के साथ एक समान क्षेत्र (6-वेल डिश) पैटर्न सतह passivation की प्रक्रिया को छोड़कर, चारों ओर ले जाएगा (चरण 5.12 में वर्णित पैटर्न टेम्पलेट विन्यास पर विचार और चित्र 5Bदेखें).
LIMAP प्रौद्योगिकी का एक और दर सीमित कारक लंबे समय से बड़े क्षेत्रों पैटर्न के लिए आवश्यक समय है (30 एक 7.5 mW/mm2 लेजर के साथ डिजाइन इकाई प्रति एस). इन मामलों में, microcontact मुद्रण एक पसंदीदा विकल्प हो सकता है. एक नए उपलब्ध फोटो-इनेटर (PLPP जेल, सामग्री की तालिका)काफी पैटर्न के लिए लिया समय कम करना चाहिए, बड़े क्षेत्रों में माइक्रो-पैटर्न के सैकड़ों की पीढ़ी की अनुमति (अप करने के लिए 8 मिमी2) बस कुछ ही मिनटों में.
एक अन्य महत्वपूर्ण कारक को ध्यान में रखना जब सेल संस्कृति के लिए माइक्रो-पैटर्निंग सतहों माइक्रो संपर्क मुद्रण के साथ प्राप्त परिवर्तनशीलता की तुलना में विभिन्न प्रयोगात्मक दोहराता के बीच माइक्रो-पैटर्न की प्रजनन क्षमता है। उदाहरण के लिए, चित्र 7B,D में दिखाए गए ग्राफ़ तीन स्वतंत्र प्रयोगात्मक दोहरावों के प्रतिनिधि डेटा होते हैं, जिनमें बहुत समान परिणाम होते हैं (डेटा नहीं दिखाया गया). हमारे अनुभव और पिछले प्रकाशनों के आधार पर , माइक्रो-संपर्क मुद्रण48,49, 50,51,52के साथ पुनरुत्पादनीयता का यह स्तर प्राप्त करना कठिन है .
अन्य फोटो-पैटर्निंग तकनीकों के विपरीत, जिनके लिए या तो फोटो-संवेदी सामग्री इंजीनियर के लिए समर्पित रसायन विज्ञान की आवश्यकता होती है या फोटो-संवेदनशील का उपयोग किया जाता है, जो आम तौर पर बहुत बायोसंगत3नहीं होते हैं, LIMAP (PLPP) के फोटोसंवेदी घटक ) जैव संगत और कोशिकाओं द्वारा अच्छी तरह से सहन किया जाता है21; हमारे हाथों में हम सीएडी, DRG न्यूरॉन्स (चित्र 10),फाइब्रोब्लास्ट, उपकला कोशिकाओं, और मेलेनोमा कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाया) सहित कोशिकाओं की एक किस्म भर में किसी भी cytotoxicity का अनुभव नहीं किया है। अन्य फोटो-पैटर्निंग तकनीकों की तुलना में PRIMO का उपयोग करLIMAP का एक अन्य लाभ यह है कि कोई photomask की आवश्यकता है. माइक्रोसंपर्क प्रिंटिंग की तरह ही, नए photomasks डिजाइन और हर वांछित पैटर्न के लिए उत्पन्न करने की आवश्यकता होगी.
माइक्रो-संपर्क मुद्रण के लिए ऊपर उल्लिखित सभी सीमाएं, तकनीक के मैनुअल दृष्टिकोण को देखें। हालांकि, स्टांप लोड और दबाव नियंत्रण53के साथ एक स्वचालित डिवाइस का उपयोग कर के माध्यम और माइक्रोसंपर्क मुद्रण की प्रजनन क्षमता को बढ़ाने के लिए संभव है।
प्रोटोकॉल के मुख्य कदम और LIMAP के लिए समस्याओं को सुलझाने PRIMO का उपयोग कर
इस प्रोटोकॉल के दौरान पाया सबसे आम समस्याओं में से एक माइक्रो-पैटर्न के भीतर पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट के उच्च स्तर रहा है। यह सूक्ष्म कुओं के सूखने के कारण हो सकता है जो अक्सर उनकी छोटी मात्रा के कारण होता है। जब ऐसा होता है, PBS क्रिस्टल अक्सर ECM पैटर्न के आसपास दिखाई देते हैं (चित्र 11ए).
प्रोटीन ऊष्मायन के बाद अपर्याप्त या अक्षम धोने के कदम भी पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट के उच्च स्तर में परिणाम कर सकते हैं। यह विशेष रूप से 10 g/mL (चित्र 11ठ) या अधिक प्रोटीन सांद्रता का उपयोग करने पर देखा जा सकता है। पृष्ठभूमि में प्रोटीन की अधिकता पीबीएस के साथ अतिरिक्त धोने के कदम सहित द्वारा कम किया जा सकता है.
प्रोटीन पृष्ठभूमि की उपस्थिति को मापा और प्रत्येक प्रयोग में विशेषता की आवश्यकता है, पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना (चित्र 6ई) और यह माइक्रो-पैटर्न्स तीव्रता से घटाना(चित्र 6F-H और चित्रा 7बी, डी) . उच्च प्रोटीन पृष्ठभूमि लगाव और सीएडी कोशिकाओं के अंकुरित में एक प्रभाव हो सकता है, परिणामों की व्याख्या समझौता.
डिजाइन इकाइयों के बीच अंतराल होना एक आम समस्या है जब उपयोगकर्ताओं के पास सीमित अनुभव होता है (चित्र 11B),जो पैटर्न के बीच अपर्याप्त ओवरलैप के परिणामस्वरूप होता है. लियोनार्डो सॉफ्टवेयर में दो मापदंडों को इस पर काबू पाने के लिए समायोजित किया जा सकता है: 1) स्तंभों के बीच एक नकारात्मक रिक्ति की आवश्यकता हो सकती है, पैटर्न के डिजाइन के आधार पर (चरण 5.7 और चित्र 5B,Cदेखें)। वैकल्पिक रूप से, 2) स्तंभ सिलाई करने के लिए विशेषज्ञ मेनू में ग्रेडिएंट विकल्प का उपयोग करें। इष्टतम रिक्ति मापदंडों को निर्धारित करने के लिए एक त्वरित परीक्षण यूवी चिपकने वाला(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर के लिए किया जा सकता है। इस चिपकने वाला की एक छोटी सी बूंद एक गिलास स्लाइड है, जो तो एक गिलास coverslip के साथ कवर किया जाता है, एक फिल्म बनाने के लिए लागू किया जाता है. एम्बेडेड यूवी चिपकने वाला एक कम लेजर खुराक का उपयोग कर ब्याज कीपैटर्न टेम्पलेट के साथ photopatterned है (30 mJ/ एम्बेडेड चिपकने वाले के यूवी उजागर क्षेत्रों ठीक हो जाएगा, उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत दिखाई बनने. परीक्षण परिणाम पैटर्न के भीतर प्राप्त रिक्ति का मूल्यांकन करने के लिए विज़ुअलाइज़ किए जाते हैं। हमारे न्यूरॉन प्रयोगों में, धारियों के बीच एक अंतर प्रतिकूल सेल व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं, विकास गतिशीलता में बदलाव का उत्पादन (या तो कम गति या पथ का परित्याग).
लियोनार्डो सॉफ्टवेयर के नवीनतम अद्यतन में (प्रकाशन के समय, लियोनार्डो 4.11), यह पहले से डिजाइन बड़ा पैटर्न टेम्पलेट्स कि एक बहुत बड़ा क्षेत्र को कवर अपलोड करने के लिए संभव है (अप करने के लिए 8 मिमी2 20X उद्देश्य का उपयोग कर) माइक्रो अच्छी तरह से सतह की डिजाइन इकाई प्रति वर्तमान 0.1 मिमी2 की तुलना में, छोटे डिजाइन इकाइयों के साथ सिलाई करने की आवश्यकता को नष्ट करने. अपरिभाषित किनारे पैटर्न पीढ़ी के दौरान लेजर फोकस समायोजन की कमी से परिणाम कर सकते हैं (चित्र 11ग)। इसलिए यह लेजर जांचना और संदर्भ पैटर्न कदम प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है (चरण 4 देखें) पैटर्न से पहले. खराब परिभाषित धारियों धारी चौड़ाई में बदलाव में परिणाम, एक्सॉन विकास गतिशीलता और धारी चौड़ाई मुश्किल के बीच संबंध बना रही है। Axons भी धारियों कि फैलाना किनारों है छोड़ देते हैं. इसके अतिरिक्त, किनारों में परिवर्तनशीलता भी पाया जा सकता है जब मुद्रण धारियों 10-20 डिग्री चौड़ाई या अधिक, पैटर्न के केंद्रीय क्षेत्रों की तुलना में किनारों पर एक उच्च प्रोटीन सामग्री में जिसके परिणामस्वरूप (चित्र 6B,D). इस बढ़त प्रभाव photopatterning प्रक्रिया के दौरान फोटो-इनिटेटर के एक गैर-समजातीय प्रसार द्वारा उत्पादित है। Photoscission प्रतिक्रिया ऑक्सीजन निर्भर है, जो किनारों पर अधिक diffuses है. इस बढ़त प्रभाव photopaterning प्रक्रिया के दौरान माइक्रो-वेल में एक पिपेट के साथ फोटो-इनेटर homogenizing कम से कम किया जा सकता है। इसके अलावा, एक नया commercialized फोटो-प्रारंभक (PLPP जेल), भी बढ़त प्रभाव को कम कर सकते हैं (PRIMO प्रणाली का समर्थन टीम, व्यक्तिगत संचार).
एक से अधिक प्रोटीन के सूक्ष्म मुद्रण के परिणामस्वरूप क्रॉस-बाध्यकारी होसकताहै ( चित्र 9ए-डी)। यह दो अलग प्रोटीन के लिए ऊष्मायन चरणों के बीच विशिष्ट बाध्यकारी साइटों पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि अवरुद्ध दक्षता बढ़ाने के द्वारा कम से कम किया जा सकता है. प्रोटीन के क्रॉस-बाइंडिंग प्रयोगात्मक परिणामों की पुनरावृत्ति कर सकते हैं और डेटा की गलत व्याख्या करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, क्योंकि यह एक्सॉन विकास गतिशीलता के लिए और अन्य सेल व्यवहार करने के लिए प्रत्येक प्रोटीन के योगदान का निर्धारण करने के लिए मुश्किल है.
निष्कर्ष
हमें उम्मीद है कि LIMAP का उपयोग कर प्रदान प्रोटोकॉल PRIMO प्रणाली के उपयोग के माध्यम से प्रोटीन माइक्रो-पैटर्न की पीढ़ी की सुविधा. Whilst हमारे प्रोटोकॉल कैसे मज़बूती से 2 डी कांच सतहों में माइक्रो-पैटर्न का उत्पादन करने पर केंद्रित है, दूसरों से पता चला है कि यह नरम substrates54के माइक्रो-पैटर्निंग के लिए LIMAP का उपयोग करने के लिए संभव है, और 3 डी संस्कृतियों के लिए microstructed सतहों42. इन माइक्रो-पैटर्न्स अपने सूक्ष्म पर्यावरण में परिवर्तन करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
यह काम BBSRC, EPSRC, एमआरसी और वेलकम ट्रस्ट द्वारा समर्थित है। सी.बी. प्रयोगशाला सेल-मैट्रिक्स अनुसंधान के लिए वेलकम ट्रस्ट सेंटर का हिस्सा है, मैनचेस्टर विश्वविद्यालय, जो वेलकम ट्रस्ट से कोर फंडिंग द्वारा समर्थित है (अनुदान संख्या 088785/ लेखक जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (बीबीएसआरसी) द्वारा सीएम, के.जे. (BB/M020630/1) और पी.ए. (BB/P000681/1) और इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (EPSRC) और चिकित्सा के लिए प्रदान की गई धन को स्वीकार करना चाहते हैं अनुसंधान परिषद (एमआरसी) अपक्षयी चिकित्सा में डॉक्टरेट प्रशिक्षण के लिए केंद्र ए.के. (ईपी/ लेखकों उनके पत्राचार और उनके बाद बिक्री समर्थन टीम के लिए Alvole धन्यवाद. लेखकों Bioimaging सुविधा, मैनचेस्टर विश्वविद्यालय से पीटर मार्च और रोजर Meadows माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी मदद के लिए धन्यवाद. इस अध्ययन में इस्तेमाल बायोइमेजिंग सुविधा माइक्रोस्कोप BBSRC, वेलकम ट्रस्ट और मैनचेस्टर सामरिक कोष के विश्वविद्यालय से अनुदान के साथ खरीदा गया था.
Alexa 488 protein labeling kit | Invitrogen | A10235 | Working concentration: N.A. |
Alexa 647 protein labeling kit | Invitrogen | A20173 | Working concentration: N.A. |
CAD cells | ECACC | 8100805 | Working concentration: N.A. |
Conjugated fibrinogen-488 | Molecular Probes | F13191 | Working concentration: 10 μg/ml |
DMEM culture medium | Gibco | 11320033 | Working concentration: N.A. |
Epifluorescence Microscope** | Nikon | Eclipse Ti inverted | Working concentration: N.A. |
Fibronectin | Sigma | F4759 | Working concentration: 10 μg/ml (after labelling with Alexa 488 protein labeling kit, see above) (diluted in PBS) |
Fiji-Image J | www.imagej.nih.gov | Version 2.0.0-rc-54/1.51f | Working concentration: N.A. |
Fluorescent highlighter | Stabilo | Stabilo Boss Original | Working concentration: N.A. |
HEPES | Gibco | 15630080 | Working concentration: 1M |
Inkscape software | Inkscape | Check last update | Working concentration: N.A. |
Laminin-red fluorescent rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | LMN01 | Working concentration: 10 μg/ml (diluted in PBS) |
Leonardo software | Alvéole | version 4.11 | Working concentration: N.A. |
L-Glutamine | Sigma | G7513 | Working concentration: 1% |
Micro-manager software | Open imaging | Check last update | Working concentration: N.A. |
Motorized x/y stage | PRIOR Scientific | Proscan II | Working concentration: N.A. |
NIS Elements Software | Nikon | NIS Elements AR 4.60.00 64-bit (With Nikon jobs) | Working concentration: N.A. |
PBS (without Ca2+, Mg2+) | Sigma | D8537 | Working concentration: 1X |
PDMS Stencils | Alvéole | visit www.alveolelab.com | Working concentration: N.A. |
PEG-SVA | Laysan bio, Inc. | MPEG-SVA-5000-1g | Working concentration: 50 mg/ml |
Phalloidin 405 | Abcam | ab176752 | Working concentration: 1:1000 |
Photo-initiator (PLPP) | Alvéole | Classic PLPP | Working concentration: 14.5 mg/ml |
Photo-initiator (PLPP gel) | Alvéole | PLPP gel | Working concentration: 4.76% diluted in ethanol |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G (115V) | PDC-32G-2 (230V) | Working concentration: N.A. |
PLL-PEG | SuSoS (also distributed by Alvéole) | www.alveolelab.com | Working concentration: 0.1 mg/ml (diluted in PBS) |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | Working concentration: 0.01% |
Primo equipment | Alvéole | www.alveolelab.com | Working concentration: N.A. |
Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Working concentration: 1% |
Tubulin anti-alpha antibody | Abcam | DM1A | Working concentration: 1:1000 CAD cells |
Tubulin anti-beta 3 antibody | Sigma | T8660 | Working concentration: 1:500 DRG neurons |
UV adhesive | Norland Products | NOA81 | Working concentration: N.A. |
1 well glass bottom dish | Cellvis | D35-20-1.5-N | Working concentration: N.A. |
6 well glass bottom dish | Cellvis | P06-20-1.5-N | Working concentration: N.A. |
20x objective** | Nikon | no phase ring (check updated catalogue) | Working concentration: N.A. **Epifluorescence microscope: images were acquired and patterns were generated on an Eclipse Ti inverted microscope (Nikon), coupled to PRIMO micro-patterning equipment (Alvéole), using a 20x objective (0.75 S Plan Fluor (nophasering, Nikon). Nikon specific filter sets for GFP, mCherry and Cy5 were used and fluorescent light source was LED (Lumencor) although other fluorescence sources and filter sets can be used. The microscope has an automated x/y stage (PRIOR Scientific) for the printing of multi-field patterning and Nikon Perfect Focus to prevent focus drift. The images were collected using a Retiga R6 (Q-Imaging) camera. |