Murine kirurgisk modell av aktuell Elastase indusert synkende bryst aorta-blødning

Summary

Vi beskriver en kirurgisk protokoll som konsekvent induserer robuste, nedadgående bryst aorta aneurismer hos mus. Prosedyren innebærer venstre toraktomi, bryst aorta eksponering, og plassering av en svamp dynket i svin bukspyttkjertelen elastase på aorta veggen.

Abstract

I henhold til senter for sykdomskontroll ble aorta aneurismer (AAs) betraktet som en ledende dødsårsak i alle raser og begge kjønn fra 1999-2016. En form for blødning som følge av progressiv svekkelse og eventuell utvidelse av aorta, som kan sprekke eller rive når den når en kritisk diameter. Aneurismer av den synkende aorta i brystet, kalt synkende bryst aorta aneurismer (dTAA), utgjør en stor andel av blødning tilfeller i USA. Uncontained dTAA brudd er nesten universelt dødelig, og valgfag reparasjon har en høy grad av sykelighet og dødelighet. Hensikten med vår modell er å studere dTAA spesielt, å belyse patofysiologi av dTAA og å søke etter molekylære mål å stanse veksten eller redusere størrelsen på dTAA. Ved å ha en murine modell for å studere bryst patologi presist, kan målrettede terapier utvikles til spesielt teste dTAA. Metoden er basert på plassering av svin bukspyttkjertel elastase (PPE) direkte på den ytre murine aorta veggen etter kirurgisk eksponering. Dette skaper en destruktiv og inflammatorisk reaksjon, som svekker aorta veggen og gir mulighet for blødning dannelse over uker til måneder. Selv om murine modeller har begrensninger, produserer vår dTAA-modell en robust aneurismer av forutsigbar størrelse. Videre kan denne modellen brukes til å teste genetiske og farmasøytiske mål som kan arrestere dTAA vekst eller hindre brudd. I menneskelige pasienter, intervensjoner som disse kan bidra til å unngå blødning brudd, og vanskelig kirurgisk inngrep.

Introduction

Formålet med denne metoden er å studere utviklingen, patofysiologi, og strukturelle endringer i murine synkende bryst aorta under dannelse av aorta-blødning. Vår modell tilbyr en reproduserbar og konsistent metode for å indusere bryst aorta aneurismer (dTAA) i mus og dermed muliggjør testing av ulike genetiske og Pharmacologic hemmere. Dette arbeidet kan bidra til å identifisere medikamenter og gen-terapier som kan oversettes til en levedyktig behandlings strategi for mennesker med dTAA sykdom.

dTAAs form når veggen av bryst aorta blir svekket og utvider over tid til å nå en kritisk diameter når rive eller brudd kan da forekomme. Klinisk, dTAA kan utvikle seg i stillhet, øker i størrelse til strukturen av aorta veggen er så forvrengt at det til slutt svikter, med katastrofale konsekvenser. Concerningly, symptomene utvikler seg vanligvis bare når det har nådd en farlig størrelse (100-150% utvidelse) og har høy risiko for disseksjon eller brudd^1,2. dTAA brudd er nesten universelt dødelig³, og valgfag kirurgisk reparasjon bærer betydelig sykelighet^4,5. Videre bærer de fleste pasientene diagnosen aorta-blødning i ca. 5 år før kirurgisk reparasjon^6,7. Dette vinduet representerer en beleilig tid til å gripe inn ikke-kirurgisk. Således, medisinsk behandling for å behandle eller langsom progresjon av dTAA er nødvendig og vil representere en betydelig fremgang til feltet av blødning forskning. Det er for tiden ingen medisinske behandlinger for dTAA tilgjengelig, hovedsakelig på grunn av en ufullstendig forståelse av dTAA patogenesen.

I løpet av de siste 20 årene har flere dTAA dyremodeller blitt utviklet, men hver av disse modellene var adskilt fra vår egen og produserte ikke robuste aneurismer. En murine dTAA-modell som er mest lik vår, ble utviklet av Ikonomidis et al.⁸, som inkluderer direkte anvendelse av CaCl₂ til adventitia av aorta. Selv om vår modell var tilpasset fra mange av teknikkene som er fremsatt av Ikonomidis, er vår modell unik på tre forskjellige måter. Først i vår modell aorta er eksponert for aktuell elastase i 3-5 minutter, sammenlignet med 15 minutter av CaCl₂ eksponering. For det andre oppstår aorta-utvidelse i 2 uker, sammenlignet med 16 uker i CaCl₂ -modellen. Sist, vår modell konsekvent produserer aneurismer på ca 100% dilatasjon, sammenlignet med aorta dilatations av 20-30% produsert av CaCl₂ søknad (som ikke kan virkelig betraktes aneurismer som de er definert som en økning i aorta diameter > 50%). Det er andre ikke-kirurgiske murine modeller av blødning, slik som Apo E knockout mus, som danner robuste aneurismer med infusjon av angiotensin II. Men disse musene utvikle Supra-nyre eller stigende bryst aorta aneurismer snarere enn aneurismer spesielt i synkende bryst aorta^9,10.

Den rasjonelle for denne protokollen er å ha en enkel, billig og tid egnet måte å studere dTAA i en murine modell. Musa modellen gir en unik mulighet til å utnytte mange genetiske og celle-spesifikke Knockouts som har blitt funnet å være slagkraftige i andre vaskulære sykdommer. Bruken av vår spesifikke TAA-modell har blitt godt mottatt og eksperimenter som bruker den har blitt publisert i High Impact tidsskrifter^11,12. Til dette punktet, har modellen blitt brukt til å undersøke mulige genetiske og Pharmacologic behandlinger som hadde en betydelig effekt i abdominal aorta (AAA) murine modeller; som vår Lab har utvidet bruken av dTAA-modellen, finner vi imidlertid mål som er unike for dTAA-formasjonen, som kan brukes som målrettede terapier hos mennesker.

Denne modellen er mest hensiktsmessig for laboratorier som har murine mikro-kirurgiske evner. Selv om det er teknisk utfordrende, kan det utføres konsekvent selv av forskere uten tidligere kirurgisk erfaring. For en forsker uten murine kirurgisk erfaring modellen kan bli mastret i ca 20 operative sesjoner (eller ca 50 mus). For forskeren med tidligere kirurgisk erfaring, kan modellen bli mastret i 5 operative sesjoner (ca 20 mus). Vi tror med en høy kvalitet video, kan tiden for å mestre bli ytterligere redusert. Etter at ferdigheter er oppnådd, kan prosedyren være ferdig i 35 minutter for kirurgi, og 20 minutter for terminalen innhøsting. Kirurger i laboratoriet vårt kan fullføre 10-12 fulle operasjoner per dag, med en operativ dødelighet på 5-10%. Den vanligste årsaken til dødelighet er lungeskade ved innreise til brystet, bedøvelse toksisitet, eller tåre av aorta under disseksjon. I tillegg til dTAA forskning, fungerer denne modellen også som en guide for sikker og enkel tilgang til bryst aorta og lunge hilum for forskere som studerer andre intervensjoner i brystet.

Protocol

Animal protokoller ble godkjent av University of Virginia institusjonelle Animal Care og use Committee (nr. 3634). 1. induksjon av anestesi og intubering Plasser en 8-10-uke gammel mannlig C57BL/6-mus i et lukket kammer med kontinuerlig strøm av 5% isoflurane og oksygen blanding i 5 minutter, til respirations er synlig redusert.Merk: ulike stammer, kjønn og alder av mus kan brukes avhengig av eksperimentell protokollen. Kvinnelige mus kan være vanskeligere å intubere på grun…

Representative Results

Anvendelsen av vår protokoll resulterer i robuste dTAA i mus sammenlignet med saltvann kontroller. TAAs utviklet er fusiform i form og forekommer bare i den behandlede delen av aorta (figur 1 og figur 2)11. Figur 2 viser et eksempel på en video micrometry måling ved vev innhøsting. Ved hjelp av ligning 1 er aorta-utvidelse 130% i dette eksempelet. Den opprinnelige studien av Jo…

Discussion

Bryst og abdominal aorta er cellularly og embryologically distinkte, som er relevant for aneurisme sykdom^14,15,16. Derfor er en bestemt dyr modell for å studere TAA nødvendig. Selv om andre murine dTAA modeller har blitt publisert⁸, er vår den eneste modellen for å skape synkende bryst aorta dilatasjon som kan betraktes som virkelig aneurisme (over 50% utvidelse). Videre er vår modell relativt rask ?…

Materials

Angiocatheter (22G)			Used for ET Tube
Dumont Tweezers; Pattern #7 x2	Roboz	RS-4982
Graefe Tissue Forceps	Roboz	RS-5158
Harms Forceps x2	Roboz	RS-5097
Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length	Roboz	RS-7800
KL 1500 LED Light Source	Leica	150-400
M205A Dissction Microscope	Leica	CH 94-35
Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide	World Precision Instruments	500216-G
Metal Clip board			Use with the Mouse Retractor Set
Mouse Retractor Set	Kent	SURGI-5001	Need 2 short and 1 tall fixators
Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector	Harvard Apparatus	73-0043	MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled
Sigma Aldrich	Elastase from porcine pancreas	E0258-50MG	Can be purchased in various size bottles
Small Vessel Cauterizer Kit	Fine Science Tools	18000-00	Recommend using rechargable AA batteries
Spring Scissors, 10.5cm	World Precision Instruments	14127
Steril Swabs (Sponges)	Sugi	31603	Can be cut to size
Surgi Suite Surgical Platform	Kent		Attach to clip board
Tech IV Isoflurane Vap	Jorgensen Laboratories	J0561A	Anesthesia vaporizer