Summary
نحن نصف بروتوكول جراحي للحث باستمرار قوية الأوعية الدموية الأبهرية الصدرية تنازلي في الفئران. ينطوي الإجراء على استئصال الصدر الأيسر، والتعرض للأبهر الصدري، ووضع اسفنجة غارقة في elastase البنكرياس البورسيني على الجدار الأبهري.
Abstract
وفقا لمركز مكافحة الأمراض، تعتبر تمدد الأوعية الدموية الأبهري (AAs) سببا رئيسيا للوفاة في جميع الأعراق وكلا الجنسين من 1999-2016. يتشكل تمدد الأوعية الدموية نتيجة للضعف التدريجي وتوسع الأبهر في نهاية المطاف، والتي يمكن أن تمزق أو تمزق بمجرد أن تصل إلى قطر حرج. تشكل تمددات الأوعية الدموية في الأبهر التنازلي النازل في الصدر، وتسمى تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري التنازلي (dTAA)، نسبة كبيرة من حالات تمدد الأوعية الدموية في الولايات المتحدة. وتمزق dTAA غير الوارد قاتل على نطاق عالمي تقريباً، كما أن الإصلاح الاختياري له معدل مرتفع من الاعتلال والوفيات. الغرض من نموذجنا هو دراسة dTAA على وجه التحديد، لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية من dTAA والبحث عن أهداف جزيئية لوقف النمو أو تقليل حجم dTAA. من خلال وجود نموذج المورين لدراسة الأمراض الصدرية على وجه التحديد، يمكن تطوير العلاجات المستهدفة لاختبار dTAA على وجه التحديد. وتستند هذه الطريقة على وضع elastase البنكرياس porcine (PPE) مباشرة على الجدار الأبهري المورين الخارجي بعد التعرض الجراحي. وهذا يخلق رد فعل مدمر وتحريضي، مما يضعف الجدار الأبهري ويسمح لتشكيل تمدد الأوعية الدموية على مدى أسابيع إلى أشهر. على الرغم من أن نماذج المورين تمتلك قيودًا، إلا أن نموذج dTAA الخاص بنا ينتج تمدد تمدد الأوعية الدموية القوي بحجم متوقع. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا النموذج لاختبار الأهداف الوراثية والصيدلانية التي قد توقف نمو dTAA أو منع التمزق. في المرضى البشر، يمكن أن تساعد مثل هذه التدخلات على تجنب تمزق تمدد الأوعية الدموية، والتدخل الجراحي الصعب.
Introduction
الغرض من هذه الطريقة هو دراسة التطور، والفيزيولوجيا المرضية، والتغيرات الهيكلية في الأبهر الصدري النقالة خلال تشكيل تمدد الأوعية الدموية الأبهري. يقدم نموذجنا طريقة قابلة للتكرار ومتسقة للحث على تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري (dTAA) في الفئران مما يسمح لاختبار مختلف مثبطات وراثية ودوائية. ويمكن أن يساعد هذا العمل في تحديد الأدوية والعلاجات الجينية التي يمكن ترجمتها إلى استراتيجية علاجية قابلة للتطبيق للبشر المصابين بمرض الديتا.
dTAAs شكل عندما يصبح جدار الأبهر الصدري ضعفووين وينقطع مع مرور الوقت حتى يصل إلى قطر حرج عندما يمكن أن يحدث تمزق أو تمزق. سريريا، dTAA يمكن أن تتقدم في صمت، وزيادة في الحجم حتى يتم تشويه هيكل الجدار الأبهري بحيث يفشل في نهاية المطاف، مع عواقب كارثية. وفيما يتعلق ، عادة ما تتطور الأعراض فقط عندما يصل تمدد الأوعية الدموية إلى حجم محفوف بالمخاطر (100-150٪ توسع) ويكون في خطر كبير للتشريح أو تمزق1،2. تمزق dTAA هو قاتل ة عالميا تقريبا3، وإصلاح الجراحية الاختيارية يحمل اعتلال كبير4،5. وعلاوة على ذلك، فإن معظم المرضى يحملون تشخيص تمدد الأوعية الدموية الأبهري لمدة 5 سنوات تقريبا قبل الإصلاح الجراحي6،7. هذه النافذة تمثل الوقت المناسب للتدخل غير الجراحية. وهكذا، هناك حاجة إلى العلاجات الطبية لعلاج أو بطء تطور dTAA، وسوف تمثل تقدما كبيرا في مجال بحوث تمدد الأوعية الدموية. لا توجد حاليًا أي علاجات طبية لـ dTAA المتاحة، ويرجع ذلك في الغالب إلى عدم اكتمال فهم مسببات الأمراض dTAA.
على مدى السنوات ال 20 الماضية، تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية dTAA، ولكن كل من هذه النماذج كانت متميزة عن منطقتنا ولم تنتج تمدد الأوعية الدموية قوية. تم تطوير نموذج dTAA murine الأكثر مماثلة للنا من قبل Ikonomidis وآخرون8، والذي يتضمن التطبيق المباشر من CaCl2 إلى adventitia من الأبهر. على الرغم من أن نموذجنا تم تكييفه من العديد من التقنيات التي وضعتها Ikonomidis, نموذجنا فريد من نوعه في ثلاث طرق منفصلة. أولا، في نموذجنا يتعرض الأبهر إلى elastase الموضعية لمدة 3-5 دقائق، مقارنة مع 15 دقيقة من التعرض CaCl 2. ثانيا، يحدث توسع الأبهر في 2 أسابيع، مقارنة مع 16 أسبوعا في نموذج CaCl2. وأخيرا، لدينا نموذج تنتج باستمرار تمدد الأوعية الدموية من ما يقرب من 100٪ التمدد، مقارنة مع التمدد الأبهري من 20-30٪ التي تنتجها CaCl2 التطبيق (والتي لا يمكن أن تعتبر حقا تمدد الأوعية الدموية كما يتم تعريفها على أنها زيادة في الأبهر قطر > 50٪). هناك نماذج أخرى غير الجراحية من المورين تشكيل تمدد الأوعية الدموية، مثل Apo E الفئران بالضربة القاضية، والتي تشكل تمدد الأوعية الدموية قوية مع ضخ أنجيوتنسين الثاني. ومع ذلك، فإن هذه الفئران تطوير تمدد الأوعية الدموية الأبهري فوق الكلوي أو التصاعدي بدلا من تمدد الأوعية الدموية على وجه التحديد في الأبهر الصدري تنازلي9،10.
العقلانيل لهذا البروتوكول هو أن يكون بسيطة، غير مكلفة، والوقت وسيلة مناسبة لدراسة dTAA في نموذج murine. يوفر نموذج الماوس فرصة فريدة للاستفادة من العديد من الضربات القاضية الوراثية والخاصة بالخلايا التي تم العثور على أنها مؤثرة في أمراض الأوعية الدموية الأخرى. وقد تم استقبال استخدام نموذج TAA المحدد لدينا بشكل جيد والتجارب التي تستخدم ها تم نشرها في المجلات عالية التأثير11،12. إلى هذه النقطة, وقد استخدم النموذج للتحقيق في العلاجات الوراثية والدوائية المحتملة التي كان لها تأثير كبير في تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) نماذج المورين; ومع ذلك، كما توسع مختبرنا استخدام نموذج dTAA، ونحن نجد أهداف فريدة من نوعها لتشكيل dTAA التي يمكن استخدامها كعلاجات مستهدفة في البشر.
هذا النموذج هو الأنسب للمختبرات التي لديها قدرات الجراحة الدقيقة مورين. على الرغم من أنه من الصعب من الناحية الفنية، فإنه يمكن تنفيذها باستمرار حتى من قبل الباحثين مع عدم وجود خبرة جراحية سابقة. بالنسبة للباحث الذي ليس لديه خبرة جراحية في البول، يمكن إتقان النموذج في حوالي 20 جلسة عمل (أو حوالي 50 فأرة). بالنسبة للباحث الذي له خبرة جراحية سابقة، يمكن إتقان النموذج في 5 جلسات عملية (حوالي 20 فأرة). ونحن نعتقد مع الفيديو عالية الجودة، ويمكن زيادة تخفيض الوقت لإتقان. بعد تحقيق الكفاءة، يمكن إكمال الإجراء في 35 دقيقة للجراحة، و 20 دقيقة للحصاد النهائي. يمكن للجراحين في مختبرنا إكمال 10-12 عملية جراحية كاملة في اليوم الواحد، مع معدل وفيات العمليات من 5-10٪. السبب الأكثر شيوعا للوفيات هو إصابة الرئة عند الدخول إلى الصدر، والسمية المخدرة، أو المسيل للدموع من الأبهر أثناء تشريح. بالإضافة إلى أبحاث dTAA، هذا النموذج هو أيضا بمثابة دليل للوصول الآمن والسهل إلى الأبهر الصدري والرئة هيلوم للباحثين الذين يدرسون التدخلات الأخرى في الصدر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها المؤسسية في جامعة فرجينيا (رقم 3634).
1. تحريض التخدير والتنبيب
- ضع فأر C57BL/6 الذكور البالغ من العمر 8-10 أسابيع في غرفة مغلقة مع تدفق مستمر من 5٪ isoflurane وخليط الأكسجين لمدة 5 دقائق، حتى يتم إبطاء التنفس بشكل واضح.
ملاحظة: يمكن استخدام سلالات مختلفة وجنس وأعمار الفئران اعتماداً على البروتوكول التجريبي. قد تكون الفئران الإناث أكثر صعوبة في التنبيب بسبب حجم أصغر وبالتالي أصغر مجرى الهواء. - تنبيب الماوس كما وصفها فانديفورت وآخرون13.
ملاحظة: خطوة التنبيب هو الجزء الأكثر صعوبة من هذا النموذج على حد سواء تعلم وأداء. يقوم المؤلفون المشار إليهما أعلاه بعمل ممتاز لشرح الخطوات في الفيديو الخاص بهم.
2. تأمين الماوس إلى المجلس الجراحي
- قم بتوصيل أنبوب الرغامى (ET)، وتأكيد ارتفاع الصدر، ووضع الماوس في وضع التكعيبالجانبي الأيمن. بدوره isoflurane إلى ما يقرب من 3٪ وتطبيق التشحيم لكلا العينين. وينبغي تعيين جهاز التنفس الصناعي لتوفير ما يقرب من 200 نفسا في الدقيقة الواحدة و 225 ميكرولتر من حجم المد والجزر.
ملاحظة: السمية سريعة إذا ترك الإيسوفلوران عند 5%. ومع ذلك، فإن الاستجابة للisoflurane متغير لذلك ينبغي أن يتم تصنيف معدل تدفق مخدر بحيث تقلصات الحجاب الحاجز التلقائي تحدث تقريبا كل 10-20 ق والأوكسجين يبدو كافيا عند فحص الأغشية المخاطية والأنسجة المكشوفة. - تأمين أنبوب ET إلى المجلس مع الشريط. تمديد الذراع اليمنى rostrally حتى مخلب الجبهة هو في خط مع الأنف وتأمينه مع الشريط.
- سحب الذيل caudally من أجل خلق خط من التوتر بين الذراع اليمنى والذيل، وإنتاج تمديد العمود الفقري.
ملاحظة: تأمين كل من الذيل ومخلب الحق في خط يمنع أكثر من الإدراج أو خلع أنبوب ET. - شريط الساق اليسرى في موقعها الطبيعي. رسم الذراع اليسرى ventrally على الشاش المدرفلة والشريط إلى أسفل.
3. التحضير للجراحة
- احمل الجناح الأيسر من الماوس مع المقصات الكهربائية من الكتف الأيسر إلى البطن الأيسر.
- استخدام قضيب القطن يميل لتنظيف محلول البيتادين على الموقع الجراحي. استخدام قضيب القطن يميل جديدة لتنظيف 70٪ محلول الإيثانول على الموقع الجراحي. السماح لتجف. ضع الستائر المعقمة.
- تحذير: تأكد من أن جميع الإيثانول يتم تجفيفها تماما قبل المضي قدما كما يتم استخدام الكي الكهربائي ويمكن أن تشعل الإيثانول.
4. الدخول في الصدر
- قم بعمل شق جانبي 1 سم في منتصف الهيميثوراكس باستخدام مقص جراحي. استخدام الكي الكهربائي المحمولة لتقسيم طبقات العضلات حتى تكون الأضلاع مرئية.
- الكي مباشرة جزء 2 ملم من الضلع.
ملاحظة: عند استخدام الكي الكهربائي على الضلع، لاحظ تردد التنفس التلقائي. إذا كان الماوس لديه تقلص الحجاب الحاجز أثناء الكي، قد يدخل الطرف الصدر وثقب الرئة، والتي عادة ما تكون قاتلة في هذا النموذج. - باستخدام قضيب مبتل، غرامة القطن يميل في مساحة الضلع متفوقة على الجزء الكي، تدوير غيض على الأنسجة لاقتحام الفضاء الجنبي. ضع 3 مم × 2 مم اسفنجة في الصدر للمساعدة في انهيار الرئة.
ملاحظة: فقط اسمحوا لينة، الرطب، والإسفنج الاتصال الرئة كما أنها حساسة للغاية. - استخدام مقص لقطع على طول الجانب العلوي من الضلع الكي، حتى الحجاب الحاجز مرئية.
5- التعرض الأبهري
- ضع الرهات الضلع واستخدمها لفتح شق الصدر. إزالة الاسفنج بعناية من سطح الرئة.
- مكان مبلل 6 مم × 4 مم الإسفنج بحيث يضع تغطي الرئة، مع نهايات مشيرا rostrally وcaudally. ضع مسحب الرئة (المسطح الواسع) على الاسفنجة ومرر بلطف الفينتالر الجرار حتى يتعرض الأبهر الصدري النازل.
- استخدم #7 ملقط لتشريح النسيج الضام والدهون من الأبهر لقسم 5 مم تقريباً.
ملاحظة: قد تكون الأوردة الصغيرة قيد التشغيل عرضيًا عبر الأبهر; تجنب تمزيقها أثناء تشريح (استخدام التكبير 14x على الأقل يمكن أن تساعد على تجنب هذه المضاعفات).
6- التعرض للإيلاستات
- تشبع 0.5 مم × 1 مم الإسفنج مع 12 ميكرولتر من elastase البنكرياس porcine ووضعها على السطح المكشوف من الأبهر.
ملاحظة: لا تدع الاسفنجة تلمس الرئة التعارضية. - بعد الوقت المحدد مسبقا (عادة 3-5 دقائق)، وإزالة الاسفنج elastase مع ملقط #7. إزالة مسحب الرئة. ري تجويف الصدر مع 1 مل من المالحة المعقمة.
ملاحظة: إزالة الجرار الرئة قبل الري مع المالحة كما أنها سوف تسمح للاسفنج الرئة لتصبح مشبعة وناعمة، مما يجعل من الأسهل لإزالة من سطح الرئة. - استخدام المدرفلة 2 "× 2" الشاش لامتصاص الري المالحة المتبقية. بدوره isoflurane وصولا الى 2٪.
7. إغلاق الصدر
- إزالة اسفنجة الرئة. قم بإزالة مُسحب الرئة الصدغي. إزالة الجرار الرئة rostral.
- مكان 3 توقف 6-0 الغرز غير قابلة للامتصاص لمعارضة الأضلاع، وربط عقدة فضفاضة في كل ولكن لا تعادل أسفل. الحرص الشديد على عدم لمس الرئة مع إبرة خياطة.
- إعادة تضخيم الرئة عن طريق occluding أنبوب تدفق على جهاز التنفس الصناعي أو عن طريق تهب بسرعة 0.5-1.0 مل من الهواء من خلال أنبوب ET عن طريق الاستفادة من 3 طريقة وقف الديك.
ملاحظة: لتجنب الصدمات، تجنب الاستخدام المفرط للحقنة المملوءة بالهواء، واستخدام ما لا يزيد عن 1.0 مل من الهواء. - ربط الغرز غير قابلة للامتصاص. إعادة تقريب طبقات العضلات مع تشغيل 5-0 خياطة متعددة الخيوط قابلة للامتصاص. بدوره isoflurane وصولا الى 1٪.
- إغلاق الجلد مع 7-10 توقف 5-0 الغرز غير قابلة للامتصاص. بدوره isoflurane إلى 0٪.
8 - الاسترداد
- إدارة 6 ميكروغرام (0.02 مل من تعليق 0.3 ملغ / مل) من البوبرينورفين تحت الجلد. قم بإزالة الشريط من القدم اليمنى وذيله والذراع اليسرى متبوعاً بشريط الذراع الأيمن.
- عندما يتحرك الماوس الأطراف، extubate عن طريق سحبها من ذيله لتنزلق من أنبوب ET. ضعها في غرفة تسخين محتوى الأكسجين العالية في موضع السوبين.
ملاحظة: أنها آمنة لتحريك الماوس من غرفة الأكسجين إلى قفص عندما يمكن تسليم نفسها إلى وضع الوقوف العادي. وعلاوة على ذلك، ينبغي مراقبة الفئران لعلامات الألم، والضيق، أو الفشل في الازدهار في كثير من الأحيان لأول 24-48 ساعة بعد الجراحة، وقدمت التسكين إضافية أو الطعام اللين كما هو مبين.
9- تعرض تمدد الأوعية الدموية الأبهري (إجراء الحصاد النهائي)
ملاحظة: بشكل عام، يتم حصاد الأنسجة في 14 يوما، وهذا يمثل فترة التوسع القصوى. ومع ذلك، اعتمادا على التجربة، يمكن تنفيذ توقيت إجراء الحصاد في أي وقت بين 3 أيام و 4+ أسابيع، اعتمادا على التجربة.
- تنبيب والماوس آمنة إلى حقل المنطوق كما هو موضح أعلاه (الأقسام 1-3). استخدام مقص لقطع الجلد ميديالي من الجناح الأيسر إلى البطن الوسطى مع الحرص على عدم الدخول إلى الشهي.
- يُرفع الجلد عن الجناح الأيسر الظهري إلى مستوى الكتف الأيسر. ثم قطع في زاوية 90 درجة من خلال الإبط إلى القص.
ملاحظة: يجب أن يحيط هذا الشق تماما شق الجلد الأصلي. - باستخدام الكي، تشريح رفرف الجلد نحو الجانب البطني للماوس، وفضح hemithorax الأيسر. استخدام مقص لدخول البطن وincise على طول الهامش الساحلي الأيسر من البطين إلى الظهر لفضح الجانب السفلي من الحجاب الحاجز الأيسر. قد يتم فتح الحافة الجانبية الأكثر من الحجاب الحاجز الذي هو المطلوب.
- إذا لم يتم إنشاؤها مع الخطوة السابقة، وincise الحجاب الحاجز في أقصى الحافة الجانبية. وضع غيض من الكي في هذه الحفرة والكي الحجاب الحاجز قبالة الهامش التكلفة لعملية xyphoid. باستخدام قضيب رطب ناعم يميل إلى القطن، حرر الرئة بلطف من التصاقات إلى جدار الصدر ودفع الرئة بشكل ميدي.
ملاحظة: إذا التصاقات لا تأتي بسهولة من جدار الصدر، واستخدام الكي لإزالتها. يساعد القيام بذلك على تجنب تمزق الرئة التي يمكن أن تسبب نزيفًا شديدًا. - الكي داخل جدار الصدر من الضلع واحد إلى الهامش التكلفة، الظهرية إلى خط الإبط الأوسط ولكن على الأقل 2 ملم من الأبهر. قطع جدار الصدر على طول خط الكي.
ملاحظة: هذه التقنية يتجنب النزيف من الشرايين الوربية. - قطع على طول هامش متفوقة من الضلع واحد ومن ثم caudally على طول الحافة الجانبية من القص، وإزالة القفص الصدري الأيسر. وضع المنافيز على الرئة وسحب medially. وضع الجرار على الحجاب الحاجز ورسم caudally لفضح قدر الأبهر ممكن.
- استخدم مُبصدًا جافًا برؤوس القطن لإزالة التصاقات من تمدد الأوعية الدموية الأبهري والجزء القاصي غير المتأثر. قياس قطر قطاع التحكم غير المتأثر وأوسع جزء من تمدد الأوعية الدموية المعالجة باستخدام قياس الميكروبات الفيديو.
ملاحظة: يتم استخدام قياسات القياس المجهري للفيديو لحساب توسع النسبة المئوية للجزء تمدد الأوعية الدموية مقارنة بمقطع عنصر تحكم مع المعادلة 1. يتم تحديد مقطع عنصر تحكم الذي هو 0.5 مم المسافة إلى الجزء تمدد الأوعية الدموية 1.
المعادلة 1
- فهم الأبهر مع الملقط الأضرار، مجرد البعد إلى الجزء المعالجة. استخدام مقص لقطع القاصي إلى ملقط، ثم تشريح الأبهر قبالة العمود الفقري. قطع الأبهر القريب إلى الجزء المعالج وإزالة الأبهر الأوعية الدموية.
- باستخدام حقنة درنة وإبرة، وغسل التجويف الأبهري مع المالحة وأنسجة العملية على النحو المطلوب.
المعادلة 1Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تطبيق بروتوكولنا يؤدي إلى dTAA قوية في الفئران مقارنة مع عناصر التحكم المالحة. ال [تا] يطوّر [فوسفورم] في شكل ويحدث فقط في المعالجة جزء من الأبهر (الشكل1 والشكل 2)11. ويبين الشكل 2 مثالاً على قياس القياس المجهري للفيديو عند حصاد الأنسجة. باستخدام المعادلة 1، التمدد الأبهري هو 130% في هذا المثال.
وأظهرت الدراسة الأصلية التي أجراها جونستون وآخرون11 التي تصف النموذج زيادة كبيرة في توسع الأبهر في الفئران المعالجة بالإيلاستات البرية (WT TAA) في 3 و7 و14 و21 يوماً مقارنة بالضوابط في الفئران من النوع البري (ضوابط WT). حدث توسع الأبهر الأقصى في اليوم 14 (WT TAA: 99.6 ± 24.7٪ مقابل التحكم في الوتد: 14.4± 8.2٪؛ p < 0.0001) (الشكل 3)11. وتظهر تجربة منفصلة أجراها البابا وآخرون12 توسعا مماثلا في 14 يوما.
عند فحص الأنسجة، TAAs لديها ألياف الإيلاستين التي هي رقيقة ومجزأة. وهناك أيضا أقل سلاسة الخلية العضلية (SMαA) تلطيخ، في حين يتم زيادة الضامة (Mac2) وinterleukin-1β (IL-1β) التعبير (الشكل4).
الشكل 1 عينة من الصور الفوتوغرافية لتمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري (TAA) نموذج وإعداد المعدات: من اليسار إلى اليمين، (1) التعرض الأولي للأبهر الصدري من خلال استئصال الصدر الأيسر، (2) تشريح الجنبة، (3) تطبيق اسفنجة غارقة في الاستازة، و (4) إزالة الإسفنج. للحصاد الأبهري (5)، أعيد فتح استئصال الصدر، وتم تشريح الأبهر الصدري مجانا وقياسها. (6) يبين التوضيح إلى اليمين الارتباط النسبي للأبهر مع المريء والرئة والوريد الهيميازيغوس. وقد تم تكييف هذا الرقم من جونستون وآخرون11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 نموذج قياس ميكرومتري الفيديو من TAA. C = قطاع التحكم غير المكشوف، A = elastase علاج تمدد الأوعية الدموية الجزء، RL = الرئة اليمنى، E = المريء، T = الذيل، H = الرأس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 قطر الأبهر مع مرور الوقت خلال تشكيل TAA. متوسط القطر الأبهري (مم ± SD) في الفئران WT المعرضة للelastase (WT TAA، رمادي) أو تتعرض للملح (التحكم WT، الأخضر) مع مرورالوقت. حدثت اختلافات كبيرة بين التحكم في TAA وWT في جميع النقاط الزمنية التي تم وضع علامة نجمية عليها (p < 0.05). يحدث توسع الأبهر الأقصى في اليوم 14 (WT TAA: 99.6 ± 24.7٪ مقابل التحكم WT: 14.4 ± 8.2٪؛ p < 0.0001). تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. وقد تم تكييف هذا الرقم من جونستون وآخرون11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 الفحص النسيجي لأنسجة التحكم المالحة WT elastase TAA وWT. عينة من الأبهر عبر المقاطع من التحكم WT (الاسفنج المالحة) وWT TAAs (إسفنجة elastase) في اليوم 14. تلطيخ الإيلاستين، خلايا العضلات الملساء (SMαA)، الضامة (Mac2)، وinterleukin-1β (IL-1β). شريط مقياس = 50 درجة مئوية. وقد تم تكييف هذا الرقم من جونستون وآخرون11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 فحص الجرعة والاستجابة لزجاجة elastase الفردية. تمثل كل مجموعة من النقاط وقتًا محددًا مسبقًا عندما يُسمح للاسفنج ة النقع في الاستساح بالبقاء. وتستخدم هذه البيانات لتقدير وقت الهضم المثالي للتوسع 100-130٪. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأبهر الصدري والبطني متميز ة خلوية وجنينية، وهو ذو صلة بمرض تمدد الأوعية الدموية14و15و16. لذلك، هناك حاجة إلى نموذج حيواني محدد لدراسة TAA. على الرغم من أن نماذج dTAA murine الأخرى قد نشرت8، لنا هو النموذج الوحيد لخلق توسع الأبهر الصدري تنازلي التي يمكن اعتبارها حقا تمدد الأوعية الدموية (أكثر من 50٪ توسع). وعلاوة على ذلك، نموذجنا هو سريع نسبيا لتنفيذ والنتائج في التوسع القصوى في 14 يوما بدلا من 16 أسبوعا في نموذج CaCl2 8. وقد سهلت هذه الكفاءة دراسة التدخلات الدوائية المحددة التي يمكن أن تكون قابلة للترجمة إلى التجارب البشرية11،12. ومع ذلك، فإن لهذا البروتوكول عدة جوانب وقيود صعبة.
نموذجنا يستخدم elastase البنكرياس porcine تنقية، والتي تم استخدامها في العديد من نماذج AAA السابقة. ويعتقد أن آلية العمل هي انهيار الإيلاستين في وسائل الإعلام من الأبهر وخلق استجابة التهابية قوية، مما يؤدي إلى جدار أقل امتثالا وأضعف في نهاية المطاف. يختلف التأثير الهضمي للإيلاستاز من زجاجة إلى أخرى. لضمان تأثير هضمي متناسق، ينبغي إجراء منحنى الجرعة والاستجابة لكل زجاجة جديدة من elastase. وتتطابق الجرعة مع الوقت الذي يسمح فيه للشاش المنقوع بالإيلاست بالبقاء. ويرد مثال على هذا المنحنى في الشكل 5. يتم فحص أوقات التعرض الاسفنج elastase محددة بهدف العثور على مدة التعرض الذي يخلق تمدد الأوعية الدموية من 100-130٪ توسع في 14 يوما. في هذا المنحنى المثال، يتم تعيين وقت الهضم 4 دقائق لهذه الزجاجة من elastase (من الجدير بالذكر، أصغر كمية من elastase المتاحة في 10 مل، وهو ما يكفي لحوالي 830 الفئران الفردية). يمكن أن يسبب الهضم المفرط أثناء الجراحة نزيفًا أثناء الجراحة أو تمزقًا سابقًا، كما أن عدم كفاية التعرض يمكن أن يفشل في التسبب في الهضم الكافي وتمدد تمدد تمدد الأوعية الدموية.
لأن هذا النموذج ينطوي على فتح تجويف الصدر، واستخدام التهوية الضغط الإيجابي إلزامي. في البداية استخدمنا تشريح الرقبة الأمامي والتنبيب الرغامى تحت الرؤية المباشرة، ولكن هذه الطريقة كانت تستغرق وقتا طويلا لأنها تتطلب شق او إغلاق إضافي. نحن الآن نستخدم التنبيب الرغامى المباشر كما هو مفصل من قبل Vandivort وآخرون13. عند تدريب الجراحين الجدد على هذا النموذج، نوصي بممارسة تقنية التنبيب على نطاق واسع لإتقانه قبل الانتقال إلى الجراحة الفعلية. مرة واحدة يتم انبوب الماوس بنجاح، ينبغي توخي الحذر الشديد عدم خلع الأنبوب مع زيادة وذمة مع كل محاولة التنبيب، مما يقلل على التوالي من فرص النجاح وزيادة فرص الإصابة في مجرى الهواء القاتل. وينبغي أيضا توخي الحذر الشديد للحد من خطر التنبيب أثناء الجراحة لأن الوقت اللازم لتنبيب هو دائما تقريبا قاتلة. كما هو مفصل في بروتوكولنا، وتأمين الذراع اليمنى والذيل تحت كمية صغيرة من التوتر سوف يمنع تحول rostral أو caudal أثناء الجراحة، وبالتالي تقليل خطر التنبيب.
السيطرة على التخدير أمر حيوي في هذا النموذج. وكما نوقش فانديفورت وآخرونفي دراستهم عن التنبيب، من الضروري وجود مستوى عميق من التخدير. إذا كان الماوس واعياً أثناء إجراء التنبيب، فإن مقاومة إدخال أنبوب ET يمكن أن تسبب إصابة القصبة الهوائية وتنبيب المريء. للحد من خطر سمية الإيسوفلوران، بمجرد تأكيد وضع القصبة الهوائية من أنبوب ET، ينبغي خفض خليط النسبة المئوية من الإيسوفلوران بحوالي نصف ما يستخدم للحث. لتحقيق النسبة المئوية المثالية من الأيسوفلوران، يجب أن يكون الماوس تقلص الحجاب الحاجز التلقائي كل 10-20 ثانية. مع تقدم الجراحة، يجب خفض الأيسوفلوران تدريجيا وإيقاف تماما بعد وضع غرزة إغلاق الجلد الأخير. يجب إزالة قيود الشريط بينما لا يزال الماوس يتعافى من التخدير حيث يمكن أن تكون إزالة الماوس مستيقظاً صادماً. للمساعدة في الانتعاش وتبديد isoflurane المتبقية قمنا مؤخرا بتعديل الإجراء بحيث يتم استرداد الماوس في بيئة ارتفاع درجة حرارة الأكسجين مباشرة بعد التنبيب.
الرئة الماوس حساسة للغاية وإصابة من ثقب، والتعامل غير المناسب، أو التعرض elastase يؤدي دائما تقريبا في الموت. النقطة الأكثر شيوعا من إصابة الرئة هو الدخول الأولي في الجنبة. عند استخدام الكي على الأضلاع (الخطوة 4.2)، ننصح بإيلاء اهتمام وثيق لتردد التنفس التلقائي وتفعيل الكي لبضع ثوان فقط بعد التنفس مباشرة. وهذا يساعد على منع التوسع غير المتوقع للقفص الصدري الذي يمكن أن يدفع طرف الكي من خلال جدار الصدر وإلى الرئة. كما ساعد استخدام قضيب القطن المبلل ذو الرؤوس القطنية في الخطوة التالية لكسر الأنسجة بلطف والغشاء الجنبي على تقليل معدل إصابة الرئة لدينا لأن الأدوات الحادة لا تلبي سطح الرئة. وأخيرا، إذا كان الاسفنج المنقوع elastase اتصالات إما الرئة مباشرة، يمكن أن يحدث ضرر شديد. ويمكن تجنب ذلك عن طريق عدم دخول الفضاء الجنبي المعكوس أثناء تشريح الأبهر واستعداد الاسفنجة بحيث يمكن وضعها مباشرة على الأبهر مع تغيير موضع قليلا. في نهاية الجراحة ، يجب القيام بمحاولة لإعادة تضخيم الرئة اليسرى عن طريق الانسداد أنبوب تدفق من جهاز التنفس الصناعي. إذا كان ذلك غير ناجح، الحقن المباشر من 0.5 إلى 1.0 مل من الهواء من خلال stopcock 3-طريقة يمكن إعادة توسيع الرئة. وإذا لم تنجح هاتان الطريقتان، ينبغي أن يستمر الإغلاق على النحو المعتاد. لقد وجدنا أنه إذا لم يكن هناك إصابة كبيرة في الرئة، والفئران تحمل الرئة تضخم جزئيا بشكل جيد نسبيا والرئة هو دائما تقريبا تضخم في حصاد الأنسجة.
يحتوي هذا النموذج على العديد من القيود. النماذج التجريبية لا نموذج تماما مرض الأبهر البشري. dTAA يحدث في 14 يوما بعد تطبيق واحد من elastase في نموذجنا في حين أن تكوين TAA الإنسان هو متعدد العوامل ويحدث على مر السنين إن لم يكن عقود. ومع ذلك، نموذج الماوس الذي يستغرق من أشهر إلى سنوات لتطوير تمدد الأوعية الدموية غير مفيد في قدرة التحقيق. على عكس المرض البشري، تبدأ تمدد اتوماية اللاستات المستحثة في نموذجنا في الانخفاض في الحجم عندما تصل إلى التوسع الأقصى في أسبوعين بعد الجراحة. ويمكن التغلب على هذا الانحدار مع استخدام β-أمينوبروبروبيونيتريل (BAPN) تستكمل في النظام الغذائي للماوس بعد الجراحة. عندما يقترن مع نموذج التعرض elastase, مكملات BAPN يسمح النمو المستمر وتمزق في نهاية المطاف, تقليد أفضل المزمنة من الأمراض البشرية. وقد درس مختبرنا سابقا BAPN في AAA17 ونحن نستخدمه حاليا في نموذج dTAA لمواصلة صقل بروتوكولنا. وقد أظهرت التجارب الأولية مع نموذج dTAA معدلات تمزق ما يقرب من 30٪ في 28 يوما.
في المستقبل، ونحن نخطط لاستخدام هذا النموذج لتقييم العلاجات الوراثية والدوائية الأخرى التي قد تكون قابلة للترجمة إلى علاج تمدد الأوعية الدموية في البشر. لأن هذا البروتوكول يصف طريقة سهلة وآمنة للوصول إلى الأبهر الصدري، فإنه يمكن استخدامه من قبل مختبرات أخرى ترغب في اختبار التدخلات على الأبهر الصدري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة تطوير العلماء AHA 14SDG18730000 (M.S.) وNIH K08 HL098560 (G.A.) وRO1 HL081629 (G.R.U.) المنح. وقد تم دعم هذا المشروع من قبل مؤسسة جراحة الصدر للبحوث والتعليم (TSFRE) منحة البحوث (PI: G. Ailawadi). المحتوى هو فقط من مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات نظر NHLBI أو TSFRE. نشكر أنتوني هيرينغ وسيندي دودسون على معرفتهما وخبرتهما التقنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiocatheter (22G) | Used for ET Tube | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 | Roboz | RS-4982 | |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz | RS-5158 | |
| Harms Forceps x2 | Roboz | RS-5097 | |
| Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length | Roboz | RS-7800 | |
| KL 1500 LED Light Source | Leica | 150-400 | |
| M205A Dissction Microscope | Leica | CH 94-35 | |
| Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 500216-G | |
| Metal Clip board | Use with the Mouse Retractor Set | ||
| Mouse Retractor Set | Kent | SURGI-5001 | Need 2 short and 1 tall fixators |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector | Harvard Apparatus | 73-0043 | MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled |
| Sigma Aldrich | Elastase from porcine pancreas | E0258-50MG | Can be purchased in various size bottles |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | Recommend using rechargable AA batteries |
| Spring Scissors, 10.5cm | World Precision Instruments | 14127 | |
| Steril Swabs (Sponges) | Sugi | 31603 | Can be cut to size |
| Surgi Suite Surgical Platform | Kent | Attach to clip board | |
| Tech IV Isoflurane Vap | Jorgensen Laboratories | J0561A | Anesthesia vaporizer |
References
- Coady, M. A., et al. What is the appropriate size criterion for resection of thoracic aortic aneurysms. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 113 (3), 489-491 (1997).
- Aggarwal, S., Qamar, A., Sharma, V., Sharma, A. Abdominal aortic aneurysm: A comprehensive review. Experimental and Clinical Cardiology. 16 (1), 11-15 (2011).
- Bickerstaff, L. K., et al. Thoracic aortic aneurysms: a population-based study. Surgery. 92 (6), 1103-1108 (1982).
- Cheng, D., et al. Endovascular aortic repair versus open surgical repair for descending thoracic aortic disease a systematic review and meta-analysis of comparative studies. Journal of the American College of Cardiology. 55 (10), 986-1001 (2010).
- Walsh, S. R., et al. Endovascular stenting versus open surgery for thoracic aortic disease: systematic review and meta-analysis of perioperative results. Journal of Vascular Surgery. 47 (5), 1094-1098 (2008).
- Absi, T. S., et al. Altered patterns of gene expression distinguishing ascending aortic aneurysms from abdominal aortic aneurysms: complementary DNA expression profiling in the molecular characterization of aortic disease. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126 (2), 344-357 (2003).
- Ailawadi, G., Eliason, J. L., Upchurch, G. R. Current concepts in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm. Journal of Vascular Surgery. 38 (3), 584-588 (2003).
- Ikonomidis, J. S., et al. A murine model of thoracic aortic aneurysms. Journal of Surgical Research. 115 (1), 157-163 (2003).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Trachet, B., et al. Ascending Aortic Aneurysm in Angiotensin II-Infused Mice: Formation, Progression, and the Role of Focal Dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 673-681 (2016).
- Johnston, W. F., et al. Inhibition of interleukin-1beta decreases aneurysm formation and progression in a novel model of thoracic aortic aneurysms. Circulation. 130 (11), Suppl 1 51-59 (2014).
- Pope, N. H., et al. Interleukin-6 Receptor Inhibition Prevents Descending Thoracic Aortic Aneurysm Formation. Annals of Thoracic Surgery. 100 (5), 1620-1626 (2015).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Ailawadi, G., et al. A nonintrinsic regional basis for increased infrarenal aortic MMP-9 expression and activity. Journal of Vascular Surgery. 37 (5), 1059-1066 (2003).
- Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta: relevance to aneurysm disease. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (5), 1123-1130 (2008).
- Trigueros-Motos, L., et al. Embryological-origin-dependent differences in homeobox expression in adult aorta: role in regional phenotypic variability and regulation of NF-kappaB activity. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1248-1256 (2013).
- Lu, G. S. G., Davis, J. P., Schaheen, B., Downs, E., Roy, R. J., Ailawadi, G., Upchurch, G. R. A novel chronic advanced staged abdominal aortic aneurysm murine model. Journal of Vascular Surgery. 66 (1), 232-242 (2017).
