Summary
Wir beschreiben ein chirurgisches Protokoll, um bei Mäusen konsequent robuste absteigende thorakale Aortenaneurysmen zu induzieren. Das Verfahren beinhaltet linke Thorakotomie, thorakale Aorta-Exposition und Platzierung eines Schwamms, der in schweinepankreasischer Elastase auf der Aortenwand getränkt ist.
Abstract
Nach Angaben des Center for Disease Control wurden Aortenaneurysmen (AAs) von 1999 bis 2016 in allen Rassen und beibeiden Geschlechtern als eine der Haupttodesursachen angesehen. Ein Aneurysmus bildet sich als Folge der fortschreitenden Schwächung und eventuellen Erweiterung der Aorta, die brechen oder reißen kann, sobald sie einen kritischen Durchmesser erreicht. Aneurysmen der absteigenden Aorta in der Brust, genannt absteigende thorakale Aortenaneurysmen (dTAA), machen einen großen Teil der Aneurysmenfälle in den Vereinigten Staaten aus. Der nicht enthaltene dTAA-Bruch ist fast überall tödlich, und die Wahlreparatur hat eine hohe Morbiditäts- und Sterblichkeitsrate. Der Zweck unseres Modells ist es, dTAA gezielt zu untersuchen, die Pathophysiologie von dTAA aufzuklären und nach molekularen Zielen zu suchen, um das Wachstum zu stoppen oder die Größe von dTAA zu reduzieren. Durch ein murines Modell, um die Thoraxpathologie genau zu untersuchen, können gezielte Therapien entwickelt werden, um dTAA gezielt zu testen. Das Verfahren basiert auf der Platzierung der Schweinepankrease (PPE) direkt auf der äußeren murinen Aortenwand nach chirurgischer Exposition. Dies erzeugt eine destruktive und entzündliche Reaktion, die die Aortenwand schwächt und eine Aneurysmusbildung über Wochen bis Monate ermöglicht. Obwohl murine Modelle Grenzen besitzen, erzeugt unser dTAA-Modell robuste Aneurysmen von vorhersehbarer Größe. Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden, um genetische und pharmazeutische Ziele zu testen, die das dTAA-Wachstum aufhalten oder einen Bruch verhindern können. Bei menschlichen Patienten könnten Interventionen wie diese dazu beitragen, Aneurysmusbrüche und schwierige chirurgische Eingriffe zu vermeiden.
Introduction
Der Zweck dieser Methode ist es, die Entwicklung, Pathophysiologie und strukturelle Veränderungen in der murinen absteigenden thorakalen Aorta während der Aortenaneurysmbildung zu untersuchen. Unser Modell bietet eine reproduzierbare und konsistente Methode zur Induzieren von thorakalen Aortenaneurysmen (dTAA) bei Mäusen und ermöglicht so die Prüfung verschiedener genetischer und pharmakologischer Inhibitoren. Diese Arbeit kann helfen, Medikamente und Gen-Therapien zu identifizieren, die in eine praktikable Behandlungsstrategie für Menschen mit dTAA-Krankheit übersetzt werden könnten.
dTAAs bilden sich, wenn die Wand der Thoraxaorta geschwächt wird und sich im Laufe der Zeit ausdimiert, bis ein kritischer Durchmesser erreicht wird, wenn dann reißen oder brechen kann. Klinisch kann dTAA im Stillen voranschreiten und an Größe zunehmen, bis die Struktur der Aortenwand so verzerrt ist, dass sie schließlich versagt, mit katastrophalen Folgen. In der Regel entwickeln sich die Symptome nur, wenn das Aneurysm eine gefährliche Größe erreicht hat (100-150% Dilatation) und ein hohes Risiko für Sezieren oder Brechen1,2ist. dTAA-Ruptur ist fast universell tödlich3, und elektive chirurgische Reparatur trägt erhebliche Morbidität4,5. Darüber hinaus tragen die meisten Patienten die Diagnose eines Aortenaneurysms für ca. 5 Jahre vor der chirurgischen Reparatur6,7. Dieses Fenster ist ein geeigneter Zeitpunkt, um nicht-chirurgisch einzugreifen. Daher sind medizinische Therapien zur Behandlung oder Verlangsamung des Fortschreitens von dTAA erforderlich und würden einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der Aneurysmenforschung darstellen. Derzeit gibt es keine medizinischen Behandlungen für dTAA, vor allem wegen eines unvollständigen Verständnisses der dTAA Pathogenese.
In den letzten 20 Jahren wurden mehrere dTAA-Tiermodelle entwickelt, aber jedes dieser Modelle unterscheidet sich von unseren eigenen und hat keine robusten Aneurysmen produziert. Ein murines dTAA-Modell, das unserem am ähnlichsten ist, wurde von Ikonomidis et al.8entwickelt, das die direkte Anwendung von CaCl2 auf die Adventitia der Aorta beinhaltet. Obwohl unser Modell von vielen der von Ikonomidis festgelegten Techniken angepasst wurde, ist unser Modell auf drei verschiedene Arten einzigartig. Erstens ist die Aorta in unserem Modell 3-5 Minuten lang der topischen Elastase ausgesetzt, verglichen mit 15 Minuten CaCl2 Exposition. Zweitens tritt eine aortenhafte Dilatation in 2 Wochen auf, verglichen mit 16 Wochen im CaCl 2-Modell. Schließlich erzeugt unser Modell konsequent Aneurysmen von ca. 100% Dilatation, im Vergleich zu den aortenförmigen Dilatationen von 20-30% durch CaCl2 Anwendung produziert (die nicht wirklich als Aneurysmen betrachtet werden, da sie als eine Erhöhung der Aorten Durchmesser >50%). Es gibt andere nicht-chirurgische murinische Modelle der Aneurysmenbildung, wie die Apo E Knockout Maus, die robuste Aneurysmen mit Infusion von Angiotensin II bilden. Diese Mäuse entwickeln jedoch suprarenale oder aufsteigende thorakale Aortenaneurysmen anstelle von Aneurysmen speziell in der absteigenden Thoraxaorta9,10.
Der Grund für dieses Protokoll ist, eine einfache, kostengünstige und zeitgerechte Möglichkeit zu haben, dTAA in einem murinen Modell zu studieren. Das Mausmodell bietet eine einzigartige Gelegenheit, viele genetische und zellspezifische Knockouts zu nutzen, die bei anderen Gefäßerkrankungen wirkungsvoll sind. Die Verwendung unseres spezifischen TAA-Modells wurde gut aufgenommen und Experimente, die es verwenden, wurden in den Fachzeitschriften11,12veröffentlicht. Bis zu diesem Punkt wurde das Modell verwendet, um mögliche genetische und pharmakologische Behandlungen zu untersuchen, die eine signifikante Wirkung in der Bauchaortenaneurysm (AAA) murinen Modelle hatten; Da unser Labor jedoch den Einsatz des dTAA-Modells erweitert hat, finden wir Ziele, die für die dTAA-Bildung einzigartig sind und als gezielte Therapien beim Menschen eingesetzt werden könnten.
Dieses Modell eignet sich am besten für Labore mit murinen mikrochirurgischen Fähigkeiten. Obwohl es technisch anspruchsvoll ist, kann es auch von Forschern ohne vorherige chirurgische Erfahrung konsequent ausgeführt werden. Für einen Forscher ohne murine chirurgische Erfahrung kann das Modell in etwa 20 operativen Sitzungen (oder etwa 50 Mäusen) gemeistert werden. Für den Forscher mit vorheriger chirurgischer Erfahrung kann das Modell in 5 operativen Sitzungen (ca. 20 Mäuse) gemeistert werden. Wir glauben, dass mit einem hochwertigen Video die Zeit zur Beherrschung weiter reduziert werden kann. Nach Erreichen der Befähigung kann der Eingriff in 35 Minuten für die Operation und 20 Minuten für die Endernte abgeschlossen werden. Die Chirurgen in unserem Labor können 10-12 volle Operationen pro Tag durchführen, mit einer operativen Sterblichkeitsrate von 5-10%. Die häufigste Todesursache ist Lungenverletzung beim Eintritt in die Brust, Anästhesietoxizität oder Riss der Aorta während der Zerlegung. Neben der dTAA-Forschung dient dieses Modell auch als Leitfaden für einen sicheren und einfachen Zugang zur Thoraxaorta und zum Lungenhilum für Forscher, die andere Eingriffe in die Brust untersuchen.
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Protocol
Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia (Nr. 3634) genehmigt.
1. Induktion von Anästhesie und Intubation
- Legen Sie eine 8-10 Wochen alte männliche C57BL/6 Maus in eine geschlossene Kammer mit kontinuierlichem Fluss von 5% Isofluran und Sauerstoffgemisch für 5 min, bis die Atmung enden wird.
HINWEIS: Je nach Experimentellem Protokoll können verschiedene Stämme, Geschlechter und Alter von Mäusen verwendet werden. Weibliche Mäuse können aufgrund ihrer kleineren Größe und damit kleinerer Atemwege schwieriger zu intubieren sein. - Intubieren Sie die Maus, wie von Vandivort et al.13beschrieben.
HINWEIS: Der Intubationsschritt ist der schwierigste Teil dieses Modells, um sowohl zu lernen als auch auszuführen. Die oben genannten Autoren leisten hervorragende Arbeit, um die Schritte in ihrem Video zu erklären.
2. Sicherung der Maus am Operationsbrett
- Verbinden Sie das Endotracheal (ET) Rohr, bestätigen Brustanstieg, und legen Sie die Maus in der rechten seitlichen Dekubitus-Position. Drehen Sie Isofluran auf ca. 3% und schmieren Sie auf beide Augen. Das Beatmungsgerät sollte auf ca. 200 Atemzüge pro Minute und 225 L Gezeitenvolumen eingestellt werden.
HINWEIS: Die Toxizität ist schnell, wenn Isofluran bei 5% bleibt. Die Reaktion auf Isofluran ist jedoch variabel, so dass die Anästhesiedurchflussrate so titriert werden sollte, dass spontane zwerchfhagene Kontraktionen etwa alle 10-20 s auftreten und die Sauerstoffversorgung bei der Inspektion von Schleimhäuten und freiliegendem Gewebe ausreichend erscheint. - Befestizieren Sie das ET-Rohr mit Klebeband an der Platine. Verlängern Sie den rechten Arm rostral, so dass die Vorderpfote in der Linie mit der Nase ist und sichern Sie es mit Klebeband.
- Ziehen Sie den Schwanz kauarisch, um eine Spannungslinie zwischen dem rechten Arm und dem Schwanz zu schaffen, wodurch eine Ausdehnung der Wirbelsäule entsteht.
HINWEIS: Das Sichern sowohl des Schwanzes als auch der rechten Pfote in der Linie verhindert ein Über- oder Abwurf des ET-Rohrs. - Bekleben Sie das linke Bein in seiner natürlichen Position. Ziehen Sie den linken Arm entlüftungswichtig über gerollte Gaze und Band nach unten.
3. Vorbereitung auf die Operation
- Rasieren Sie die linke Flanke der Maus mit elektrischen Clippers von der linken Schulter bis zum linken Bauch.
- Verwenden Sie einen Baumwoll-Applikator, um Betadin-Lösung über die chirurgische Stelle zu bürsten. Verwenden Sie einen neuen Baumwoll-Applikator, um 70% Ethanollösung über die chirurgische Stelle zu bürsten. Trocknen lassen. Legen Sie einen sterilen Vorhang.
- VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass das gesamte Ethanol vollständig getrocknet ist, bevor es als Elektrokauterie verwendet wird und das Ethanol entzünden kann.
4. Eintritt in Thorax
- Machen Sie einen 1 cm seitlichen Schnitt in der Mitte des Hemithorax mit chirurgischer Schere. Verwenden Sie Handelektrokautery, um Muskelschichten zu teilen, bis die Rippen sichtbar sind.
- Direkt einen 2 mm Abschnitt der Rippe kauterisieren.
HINWEIS: Beachten Sie bei Verwendung von Elektrokauterie auf der Rippe die spontane Atemfrequenz. Wenn die Maus während der Kautereine eine zwerchfellatische Kontraktion hat, kann die Spitze in den Thorax eindringen und die Lunge punktieren, was in diesem Modell in der Regel tödlich ist. - Drehen Sie die Spitze mit einem benetzten, feinen Baumwoll-Applikator im Rippenraum, der dem kauterisierten Teil überlegen ist, die Spitze auf das Gewebe, um in den Pleuraraum einzubrechen. Legen Sie benetzten 3 mm x 2 mm Schwamm in den Thorax, um die Lunge zu kollabieren.
HINWEIS: Nur weich, nass, Schwämme kontaktieren die Lunge, da es extrem empfindlich ist. - Verwenden Sie eine Schere, um entlang des oberen Aspekts der kauterisierten Rippe zu schneiden, bis Diemembran sichtbar ist.
5. Aortenexposition
- Rippenretraktoren aufstellen und mit ihnen den Thorakotomie-Einschnitt öffnen. Entfernen Sie den Schwamm vorsichtig von der Oberfläche der Lunge.
- 6 mm x 4 mm Schwamm so auflegen, dass er die Lunge bedeckt, mit Enden, die rostral und kauarisch zeigen. Legen Sie den (breiten flachen) Lungenretraktor auf den Schwamm und schieben Sie den Retraktor leicht ventral, bis die absteigende Thoraxaorta freigelegt wird.
- Verwenden Sie #7 Zange, um das Bindegewebe und Fett aus der Aorta für einen etwa 5 mm Abschnitt zu sezieren.
HINWEIS: Kleine Venen können quer über die Aorta verlaufen; vermeiden Sie, sie während der Zerlegung zu reißen (mit mindestens 14-facher Vergrößerung kann helfen, diese Komplikation zu vermeiden).
6. Elastase-Exposition
- 0,5 mm x 1 mm Schwamm mit 12 l Pankrease assig mit 12 l sättigen und auf die freiliegende Oberfläche der Aorta legen.
HINWEIS: Lassen Sie den Schwamm die kontralaterale Lunge nicht berühren. - Nach der vorgegebenen Zeit (in der Regel 3-5 min), entfernen Sie den Elastaseschwamm mit #7 Zangen. Entfernen Sie den Lungenretraktor. Bewässern Sie die Brusthöhle mit 1 ml steriler Saline.
HINWEIS: Entfernen Sie den Lungenretraktor vor der Bewässerung mit Saline, da er es ermöglicht, dass der Lungenschwamm gesättigt und weich wird, was es einfacher macht, von der Oberfläche der Lunge zu entfernen. - Verwenden Sie gewalzte 2 "x 2" Gaze, um die verbleibende Saline-Bewässerung zu absorbieren. Drehen Sie Isoflurane auf 2%.
7. Verschluss der Brust
- Entfernen Sie den Lungenschwamm. Entfernen Sie den kaudalen Lungenretraktor. Entfernen Sie den rostralen Lungenretraktor.
- Platz 3 unterbrochen 6-0 nicht-resorbierbare Nähte, um die Rippen zu widersetzen, binden Sie einen lockeren Knoten in jedem, aber nicht zu binden. Achten Sie sehr darauf, die Lunge nicht mit der Nahtnadel zu berühren.
- Die Lunge wieder aufblasen, indem Sie das Abflussrohr auf dem Beatmungsgerät verschließen oder schnell 0,5-1,0 ml Luft durch das ET-Rohr blasen, indem Sie den 3-Wege-Stopphahn verwenden.
HINWEIS: Um Barotrauma zu vermeiden, vermeiden Sie übermäßigen Einsatz der luftgefüllten Spritze, und verwenden Sie nicht mehr als 1,0 ml Luft. - Binden Sie nicht resorbierbare Nähte. Die Muskelschichten mit einer laufenden 5-0 resorbierbaren Multifilament-Naht neu annähern. Drehen Sie Isoflurane auf 1%.
- Schließen Sie die Haut mit 7-10 unterbrochenen 5-0 nicht resorbierbaren Nähten. Drehen Sie Isoflurane auf 0%.
8. Wiederherstellung
- Subkutane Verabreichung von 6 g (0,02 ml einer 0,3 mg/ml Suspension) Buprenorphin. Entfernen Sie das Band vom rechten Fuß, Schwanz und linken Arm gefolgt vom rechten Armband.
- Wenn die Maus Extremitäten bewegt, extubieren Sie, indem Sie sie am Schwanz ziehen, um aus dem ET-Rohr zu gleiten. In der wärmeren Kammer mit hohem Sauerstoffgehalt in die Supine-Position geben.
HINWEIS: Es ist sicher, die Maus von der Sauerstoffkammer in den Käfig zu bewegen, wenn sie sich selbst in die normale Standposition drehen kann. Darüber hinaus sollten Mäuse in den ersten 24-48 Stunden nach der Operation auf Anzeichen von Schmerzen, Schmerzen oder misserfolgigen Symptomen überwacht werden und zusätzliche Analgesie oder weiche Nahrung zur Verfügung stellen, wie angegeben.
9. Exposition von Aortenaneurysmus (Terminal-Ernteverfahren)
HINWEIS: Im Allgemeinen wird die Gewebeernte nach 14 Tagen durchgeführt, da dies den Zeitraum der maximalen Dilatation darstellt. Je nach Experiment kann jedoch der Zeitpunkt des Ernteablaufs je nach Experiment jederzeit zwischen 3 Tagen und 4+ Wochen durchgeführt werden.
- Intubieren und sichere Maus zu operativem Feld wie oben beschrieben (Abschnitte 1-3). Verwenden Sie eine Schere, um die Haut medial von der linken Flanke bis zum zentralen Bauch zu schneiden, wobei darauf geachtet wird, nicht in das Peritoneum zu gelangen.
- Incise Haut von dorsalen linken Flanke rostral auf das Niveau der linken Schulter. Dann in einem 90°-Winkel durch die Axilla zum Brustbein einknicken.
HINWEIS: Dieser Schnitt sollte den ursprünglichen Hautschnitt vollständig umschließen. - Mit Kauterie, dissektieren Hautklappe in Richtung der ventralen Aspekt der Maus, die linke Hemithorax aussetzen. Verwenden Sie eine Schere, um den Bauch und Dieris entlang der linken Kostenrand von ventral zu dorsal zu betreten, um die Unterseite der linken Membran zu belichten. Die seitliche meiste Kante der Membran kann sich öffnen, was gewünscht wird.
- Wenn nicht mit dem vorherigen Schritt erstellt, schneiden Sie die Membran an seiner seitlichsten Kante. Legen Sie die Spitze der Kautery in dieses Loch und kauterisieren Sie die Membran von der Kostenmarge zum Xyphoidenprozess. Mit einem feuchten, fein gekippten Baumwoll-Applikator, befreien Sie die Lunge sanft von Verklebungen an der Brustwand und drücken Sie die Lunge medial.
HINWEIS: Wenn Adhäsionen nicht leicht von der Brustwand kommen, verwenden Sie Kautery, um sie zu entfernen; dies hilft zu vermeiden, die Lunge zu reißen, die schwere Blutungen verursachen kann. - Kauterisieren Sie die Innenseite der Brustwand von Rippe eins bis zum Costalrand, dorsal bis zur mittleren Achsellinie, aber mindestens 2 mm von der Aorta entfernt. Schneiden Sie die Brustwand entlang der kauterisierten Linie.
HINWEIS: Diese Technik vermeidet Blutungen aus den interkostalen Arterien. - Schneiden Sie entlang der oberen Rand der Rippe ein und dann kauadt entlang der seitlichen Kante des Brustbeins, entfernen Sie den linken Rippenkäfig. Retraktoren auf die Lunge legen und medial ziehen. Retraktor auf Membran legen und kauen, um so viel Aorta wie möglich zu belichten.
- Verwenden Sie einen trockenen Baumwoll-Applikator, um Adhäsionen aus Aortenaneurysm und einem unbeeinflussten distalen Segment zu entfernen. Messen Sie den Durchmesser des nicht betroffenen Kontrollsegments und den breitesten Teil des elastase behandelten Aneurysmus mittels Videomikrometrie.
HINWEIS: Die Messungen der Videomikrometrie werden verwendet, um die prozentuale Dilatation des aneurysmalen Segments im Vergleich zu einem Steuersegment mit Gleichung 1 zu berechnen. Es wird ein Steuersegment ausgewählt, das 0,5 mm distal zum aneurysmalen Segment 1 ist.
Gleichung 1
- Greifen Sie Aorta mit Harms Zange, nur distal zu dem behandelten Segment. Verwenden Sie eine Schere, um distale Zuzangen zu schneiden, und sezieren Sie dann die Aorta von der Wirbelsäule. Aorta proximal schneiden, um das Segment zu behandeln, und aneurysmale Aorta entfernen.
- Mit einer Tuberkulinspritze und -nadel das Aortenlumen mit Saline und Prozessgewebe nach Belieben waschen.
Gleichung 1Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Anwendung unseres Protokolls führt zu robusten dTAA bei Mäusen im Vergleich zu Saline-Kontrollen. Die entwickelten TAAs sind fusiformförmig und kommen nur im behandelten Teil der Aorta vor (Abbildung 1 und Abbildung 2)11. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für eine Videomikrometriemessung bei der Gewebeernte. Bei Verwendung von Gleichung 1 beträgt die Aortendilatation in diesem Beispiel 130 %.
Die ursprüngliche Studie von Johnston et al.11, die das Modell beschreibt, zeigte eine signifikante Zunahme der aortendilatation bei wild lebenden Elastase behandelten Mäusen (WT TAA) an 3, 7, 14 und 21 Tagen im Vergleich zu Kontrollen bei Wildtypmäusen (WT-Kontrollen). Die maximale aortendilatation trat am 14. Tag auf (WT TAA: 99,6 x 24,7 % im Vergleich zur WT-Kontrolle: 14,4 x 8,2 %; p < 0,0001) (Abbildung 3)11. Ein separates Experiment von Pope et al.12 zeigt eine ähnliche Dilatation nach 14 Tagen.
Bei der Untersuchung der Histologie haben WT TAAs Elastinfasern, die ausgedünnt und fragmentiert sind. Es gibt auch weniger glatte Muskelzellfärbung (SM-A), während Makrophagen (Mac2) und Interleukin-1-(IL-1)-Expression erhöht werden (Abbildung 4).
Abbildung 1 : Beispielaufnahmen des Thoraxaortenaneurysms (TAA) Modell und AusrüstungSaufbau. Von links nach rechts, (1) Erstexposition der thorakakalen Aorta durch eine linke Thorakotomie, (2) Zerlegung der Pleura, (3) Anwendung eines elastasegetränkten Schwamms und (4) Schwammentfernung. Für die Aortenernte (5) wurde die Thorakotomie wieder geöffnet und thorakale Aorta frei seziert und gemessen. (6) Die Abbildung rechts zeigt die relative Assoziation von Aorta mit Speiseröhre, Lunge und Hämiazygos Vene. Diese Figur wurde von Johnston et al.11adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Beispielvideo-Mikrometriemessung von TAA. C = unbelichtetes Kontrollsegment, A = elastase behandeltes aneurysmales Segment, RL = rechte Lunge, E = Speiseröhre, T = Schwanz, H = Kopf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Aortendurchmesser im Laufe der Zeit während der TAA-Bildung. Mittlerer Aortendurchmesser (mm sD) bei WT-Mäusen, die Elastase ausgesetzt sind (WT TAA, grau) oder im Laufe der Zeit einer Saline (WT-Kontrolle, grün) ausgesetztsind. Zu allen mit Sternchen markierten Zeitpunkten traten signifikante Unterschiede zwischen WT TAA und WT-Steuerung auf (p < 0,05). Die maximale aortendilatation tritt am 14. Tag auf (WT TAA: 99,6 x 24,7 % im Vergleich zur WT-Kontrolle: 14,4 x 8,2 %; p < 0,0001). Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung dar. Diese Figur wurde von Johnston et al.11adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Histologische Untersuchung von WT-Elastase TAA und WT-Saline-Kontrollgewebe. Probe-Aortenquerschnitte der WT-Kontrolle (Saline-Schwamm) und WT TAAs (Elastase-Schwamm) am 14. Tag. Färbung für Elastin, glatte Muskelzellen (SM-A), Makrophagen (Mac2) und Interleukin-1(IL-1"). Skalenbalken = 50 m. Diese Figur wurde von Johnston et al.11adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Dosis-Wirkungs-Untersuchung der einzelnen Elastase-Flasche. Jede Gruppe von Punkten stellt einen vorgegebenen Zeitpunkt dar, an dem der elastasegetränkte Schwamm wohnen darf. Diese Daten werden verwendet, um die ideale Verdauungszeit für 100-130% Dilatation zu schätzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Thorax- und Bauchaorta sind zellulär und embryologisch verschieden, was für die aneurysmale Erkrankung14,15,16relevant ist. Daher ist ein spezifisches Tiermodell zur Untersuchung von TAA erforderlich. Obwohl andere murine dTAA-Modelle veröffentlicht wurden8, ist unser Modell das einzige Modell, um absteigende thorakale aortenhafte Dilatation zu schaffen, die wirklich aneurysmal angesehen werden kann (über 50% Dilatation). Darüber hinaus ist unser Modell relativ schnell auszuführen und führt zu einer maximalen Dilatation bei 14 Tagen im Gegensatz zu 16 Wochen im CaCl2 Modell8. Diese Effizienz hat die Untersuchung spezifischer pharmakologischer Interventionen erleichtert, die potenziell auf Studien am Menschen übertragen werden könnten11,12. Dieses Protokoll weist jedoch mehrere herausfordernde Aspekte und Einschränkungen auf.
Unser Modell verwendet gereinigte Pankreas-Elastase, die in mehreren früheren AAA-Modellen verwendet wurde. Der Wirkmechanismus wird geglaubt, um Abbau von Elastin in den Medien der Aorta und die Schaffung einer robusten Entzündungsreaktion, die zu einer weniger konformen und schließlich schwächeren Wand führt. Die Verdauungswirkung der Elastase variiert von Flasche zu Flasche. Um eine konsistente Verdauungswirkung zu gewährleisten, sollte für jede neue Flasche Elastase eine Dosis-Wirkungs-Kurve durchgeführt werden. Die Dosis entspricht der Zeit, in der die elastasegetränkte Gaze verweilen darf. Ein Beispiel für eine solche Kurve ist in Abbildung 5dargestellt. Spezifische Elastase-Schwamm-Expositionszeiten werden mit dem Ziel untersucht, eine Expositionsdauer zu finden, die Aneurysmen von 100-130% Dilatation nach 14 Tagen erzeugt. In dieser Beispielkurve ist eine 4-minuten-Verdauungszeit für diese Flasche Elastase vorgesehen (die kleinste verfügbare Menge elastase ist in 10 ml, was für ca. 830 einzelne Mäuse ausreicht). Übermäßige Elastase-Verdauung kann intraoperative Blutungen oder vorzeitigen Bruch verursachen und eine unzureichende Exposition kann nicht zu einer ausreichenden Verdauung und aneurysmalen Dilatation führen.
Da dieses Modell das Öffnen der Brusthöhle beinhaltet, ist die Verwendung von Überdruckbelüftung obligatorisch. Anfangs verwendeten wir eine vordere Halssektion und orotracheale Intubation unter direkter Sicht, aber diese Methode war zeitaufwändig, da sie einen zusätzlichen Schnitt und Verschluss erforderte. Wir verwenden jetzt eine direkte orotracheale Intubation, wie von Vandivort et al.13beschrieben. Bei der Ausbildung neuer Chirurgen an diesem Modell empfehlen wir, die Intubationstechnik ausgiebig zu üben, um sie zu meistern, bevor sie zur eigentlichen Operation übergeht. Sobald die Maus erfolgreich intubiert ist, sollte große Sorgfalt darauf geachtet werden, die Röhre nicht zu vertreiben, da ödeme mit jedem Intubationsversuch zunimmt, was die Erfolgschancen sukzessive verringert und die Wahrscheinlichkeit einer tödlichen Atemwegsverletzung erhöht. Es sollte auch sehr darauf geachtet werden, das Risiko einer Extubation während der Operation zu minimieren, da die Zeit, die für die Retubation benötigt wird, fast ausnahmslos tödlich ist. Wie in unserem Protokoll beschrieben, verhindert die Sicherung des rechten Arms und Schwanzes unter einer geringen Spannung rostrale oder kaudale Verschiebung während der Operation und minimiert somit das Risiko einer Extubation.
Die Kontrolle der Anästhesie ist in diesem Modell von entscheidender Bedeutung. Wie Vandivort et al.13 in ihrer Studie über intubation diskutierten, ist ein tiefes Maß an Sedierung notwendig. Wenn die Maus während des Intubationsvorgangs bewusst ist, kann die Resistenz gegen ET-Rohreinfügung zu Trachealverletzungen und Ösophaalintubation führen. Um das Risiko einer Isofluran-Toxizität zu verringern, sollte nach Derrachealplatzierung des ET-Rohrs das prozentische Mischung aus Isofluran um etwa die Hälfte des zur Induktion verwendeten Anteilsgeminden reduziert werden. Um den idealen Prozentsatz von Isofluran zu erreichen, sollte die Maus alle 10-20 Sekunden eine spontane zwerchfellatische Kontraktion haben. Im Verlauf der Operation sollte das Isofluran nach dem letzten Hautverschlussstich schrittweise abgesenkt und vollständig ausgeschaltet werden. Die Bandstützen sollten entfernt werden, während die Maus sich noch von der Anästhesie erholt, da die Entfernung, während die Maus wach ist, traumatisch sein kann. Um bei der Rückgewinnung und Ableitung von Restisofluran zu helfen, haben wir vor kurzem das Verfahren so modifiziert, dass die Maus in einer hochsauerstofferwärmenden Umgebung unmittelbar nach der Extubation zurückgewonnen wird.
Die Mauslunge ist extrem empfindlich und Verletzungen durch Punktion, unsachgemäße Handhabung oder Elastase-Exposition führen fast immer zum Tod. Der häufigste Punkt der Lungenverletzung ist der erste Eintritt in die Pleura. Bei der Verwendung von Kauterien an den Rippen (Schritt 4.2) empfehlen wir, genau auf die spontane Atemfrequenz zu achten und die Kauterie erst für ein paar Sekunden unmittelbar nach einem Atemzug zu aktivieren. Dies hilft, eine unerwartete Ausdehnung des Brustkorbs zu verhindern, die die Kauterspitze durch die Brustwand in die Lunge treiben kann. Die Verwendung des benetzten Baumwoll-Applikators im nächsten Schritt, um das Gewebe sanft zu brechen und die Pleuramembran half auch, unsere Rate der Lungenverletzungen zu minimieren, da scharfe Instrumente nicht der Lungenoberfläche entsprechen. Schließlich kann es zu schweren Schäden kommen, wenn der mit Elastase getränkte Schwamm eine der beiden Lungen direkt kontaktiert. Dies kann vermieden werden, indem man während der Aortensektion nicht in den kontralateralen Pleuraraum eintritt und den Schwamm so vorbereitet, dass er mit wenig Neupositionierung direkt auf die Aorta gelegt werden kann. Am Ende der Operation sollte versucht werden, die linke Lunge wieder aufzublasen, indem das Abflussrohr des Beatmungsgeräts verdeckt wird. Wenn dies nicht gelingt, kann eine Direkteinspritzung von 0,5 bis 1,0 ml Luft durch den 3-Wege-Stopphahn die Lunge wieder erweitern. Wenn beide Methoden nicht funktionieren, sollte die Schließung normal verlaufen. Wir haben festgestellt, dass Mäuse, wenn keine größeren Lungenverletzungen vorliegen, eine teilweise aufgeblasene Lunge relativ gut vertragen und die Lunge bei der Gewebeernte fast immer aufgeblasen wird.
Dieses Modell hat mehrere Einschränkungen. Experimentelle Modelle modellieren menschliche Aortenerkrankungen nicht vollständig. dTAA tritt in 14 Tagen nach einer Anwendung der Elastase in unserem Modell auf, während die menschliche TAA-Bildung multifaktoriell ist und über Jahre, wenn nicht Jahrzehnte auftritt. Ein Mausmodell, das Monate bis Jahre braucht, um Aneurysmen zu entwickeln, ist jedoch in einer Untersuchungsfunktion nicht nützlich. Im Gegensatz zu menschlichen Erkrankungen beginnen Elastase-induzierte Aneurysmen in unserem Modell zu verkleinern, wenn sie nach zwei Wochen nach der Operation die maximale Dilatation erreichen. Diese Regression kann mit der Verwendung von ,-Aminopropionitril (BAPN) in der Maus Ernährung postoperativ ergänzt überwunden werden. In Kombination mit dem Elastase-Expositionsmodell, BAPN-Supplementierung ermöglicht kontinuierliches Wachstum und schließlich Bruch, besser imitieren die Chronik der menschlichen Krankheit. Unser Labor hat BAPN bereits in AAA17 untersucht und wir verwenden es derzeit im dTAA-Modell, um unser Protokoll weiter zu verfeinern. Primäre Experimente mit dem dTAA-Modell haben Bruchraten von etwa 30% an 28 Tagen gezeigt.
In Zukunft planen wir, dieses Modell zu verwenden, um andere genetische und pharmakologische Behandlungen zu bewerten, die auf Aneurysmenbehandlungen beim Menschen übertragbar sein können. Da dieses Protokoll einen einfachen und sicheren Weg beschreibt, um auf die Thoraxaorta zuzugreifen, kann es von anderen Labors verwendet werden, die Eingriffe an der Thoraxaorta testen möchten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch AHA Scientist Development Grant 14SDG18730000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) und RO1 HL081629 (G.R.U.) Stipendien unterstützt. Dieses Projekt wurde von der Thoracic Surgery Foundation for Research and Education (TSFRE) Research Grant (PI: G. Ailawadi) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die Ansichten des NHLBI oder des TSFRE dar. Wir danken Anthony Herring und Cindy Dodson für ihr Wissen und ihr technisches Know-how.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiocatheter (22G) | Used for ET Tube | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 | Roboz | RS-4982 | |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz | RS-5158 | |
| Harms Forceps x2 | Roboz | RS-5097 | |
| Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length | Roboz | RS-7800 | |
| KL 1500 LED Light Source | Leica | 150-400 | |
| M205A Dissction Microscope | Leica | CH 94-35 | |
| Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 500216-G | |
| Metal Clip board | Use with the Mouse Retractor Set | ||
| Mouse Retractor Set | Kent | SURGI-5001 | Need 2 short and 1 tall fixators |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector | Harvard Apparatus | 73-0043 | MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled |
| Sigma Aldrich | Elastase from porcine pancreas | E0258-50MG | Can be purchased in various size bottles |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | Recommend using rechargable AA batteries |
| Spring Scissors, 10.5cm | World Precision Instruments | 14127 | |
| Steril Swabs (Sponges) | Sugi | 31603 | Can be cut to size |
| Surgi Suite Surgical Platform | Kent | Attach to clip board | |
| Tech IV Isoflurane Vap | Jorgensen Laboratories | J0561A | Anesthesia vaporizer |
References
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