Summary
Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind dreidimensionale Strukturen, die durch stimulierte neutrophile Granulozyten erzeugt werden. In den letzten Jahren hat sich herabimsiert, dass NETs an einer Vielzahl von Krankheiten beteiligt sind. Der Nachweis von NETs im Gewebe kann diagnostische Relevanz haben, daher sind standardisierte Protokolle für die Kennzeichnung von NET-Komponenten erforderlich.
Abstract
Neutrophile Granulozyten, auch polymorphonukleare Leukozyten (PMN) genannt, sind aufgrund ihres lobulierten Kerns die am häufigsten vorkommende Art von Leukozyten. Sie reifen im Knochenmark und werden in das periphere Blut freigesetzt, wo sie etwa 6 x 8 h zirkulieren; im Gewebe können sie jedoch tagelang überleben. Durch Diapedese durch das Endothel verlassen sie den Blutkreislauf, gelangen in Gewebe und wandern nach chemotaktischen Gradienten zur Infektion. Neutrophile können eindringende Mikroorganismen durch Phagozytose, Degranulation und Die Generierung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) bekämpfen. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, NETs in paraffinintegriertem Gewebe zu erkennen. NETs sind das Ergebnis eines Prozesses namens NETosis, der zur Freisetzung von kerntechnischen, körnigen und zytoplasmatischen Komponenten entweder aus lebenden (lebenswichtigen NETosis) oder sterbenden (suizidgefährdeten NETosis) Neutrophilen führt. In vitro bilden NETs wolkenähnliche Strukturen, die einen Raum einnehmen, der um ein Vielfaches größer ist als der der Zellen, von denen sie abgestiegen sind. Das Rückgrat von NETs ist Chromatin, an das eine Auswahl von Proteinen und Peptiden aus Granulat und Zytoplasma gebunden ist. Dadurch wird eine hohe lokale Konzentration toxischer Verbindungen aufrechterhalten, so dass NETs eine Vielzahl von Krankheitserregern, einschließlich Bakterien, Pilzen, Viren und Parasiten, erfassen und inaktivieren können, während die Diffusion der hochaktiven NET-Komponenten zu Schäden in benachbartes Gewebe begrenzt ist. Dennoch hat sich in den letzten Jahren gezeigt, dass NETs, wenn sie in Hülle und Fülle erzeugt oder unzureichend gerodet werden, pathologisches Potenzial haben, das von Autoimmunerkrankungen bis hin zu Krebs reicht. So kann der Nachweis von NETs in Gewebeproben eine diagnostische Bedeutung haben, und der Nachweis von NETs in krankem Gewebe kann die Behandlung von Patienten beeinflussen. Da paraffineingebettete Gewebeproben die Standardprobe für die pathologische Analyse sind, wurde versucht, ein Protokoll für die fluoreszierende Färbung von NET-Komponenten in paraffin-eingebettetem Gewebe unter Verwendung kommerziell erhältlicher Antikörper zu erstellen.
Introduction
Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) haben eine komplexe dreidimensionale Struktur. Hochauflösende Rasterelektronen-Mikroskopische Analysen ergaben, dass sie aus glatten Fasern mit einem Durchmesser von 15 bis 20 nm (Chromatin) bestehen, die mit Kugeldomänen von >25 nm besetzt sind, die vermutlich aus einem Sortiment von etwa 30 körnigen und zytoplasmischen Proteine und Peptide1,2. Wenn in vitro aus isolierten Neutrophilen erzeugt, können NETs durch Färbung von zwei oder mehr ihrer Komponenten durch Immunfluoreszenz (z. B. Histonen und neutrophile Elastase [NE]) identifiziert werden. In nicht stimulierten polymorphonuklearen Leukozyten (PMN) befinden sich Histonen ausschließlich im Kern, während NE in Granulaten enthalten ist. Während der NETosis tritt NE in den Kern ein, wo es Histonen3,4verarbeitet. NETs zeichnen sich durch kolokalisierung von Komponenten aus, die in unstimulierten Neutrophilen klar getrennt sind. Da derzeit keine Antikörper existieren, die ausschließlich NET-spezifische Epitope detektieren (d. h. nicht mit naiven Neutrophilen reagieren), ist die Detektion der Kolokalisierung neutrophiler Proteine in NETs die einzige Möglichkeit, NETs zu identifizieren.
Im Gewebe können NETs durch herkömmliche histologische Flecken kaum nachgewiesen werden (z.B. durch Färbung mit Hämatoxylin/Eosin [H&E], das NETs als diffuseblasse bläuliche Färbung darstellt). Nur wenn es reichlich vorhanden ist, können NETs deutlich mit H&E-Färbung unterschieden werden, wie z. B. in Thrombi5. Da NETs per se diffus sind, muss die Gewebestruktur optimal erhalten werden, so dass Kryopräparate, die anfällig für Gefrierartefakte sind, für die Analyse von NETs im Gewebe suboptimal sind. Stattdessen hat sich gezeigt, dass formaldehydfixierung und Paraffineinbettung die NET-Struktur im Gewebe gut2erhalten. (Immun-)histologische Untersuchung von Abschnitten des paraffineingebetteten Gewebes ist die Standardmethode für die pathologische Analyse. Da Gewebe in Paraffinblöcken auch bei Raumtemperatur (RT) konserviert wird, können Gewebeproben aus der täglichen diagnostischen Arbeit mit Proben verglichen werden, die vor Jahren vorbereitet wurden, mit Fragen und Techniken, die vor kurzem entstanden sind. NETs im Gewebe wurden bis vor kurzem nicht nachgewiesen, und eine detaillierte Analyse der NETZbildung und -entfernung im Verlauf von Krankheiten kann zu neuen Erkenntnissen über die Pathogenese führen. Die Verwendung von Paraffin-eingebettetem Gewebe hat den unschätzbaren Vorteil, die Analyse von Archivmaterial zu ermöglichen und retrospektive Studien durchzuführen6. Zweifellos haben diese Vorteile ihren Preis. Vor der Einbettung in Paraffin muss Gewebe formaldehydfixiert, dehydriert und über 50 °C erhitzt werden. Diese Verfahren induzieren Gewebe-Autofluoreszenz sowie Epitop-Maskierung.
Um Fixierungsartefakte zu begrenzen, sollte die Fixationszeit auf ein Minimum beschränkt werden, so dass die Größe von Gewebeproben eine Fläche von 20 mm x 30 mm mit einer Dicke von 3 mm nicht überschreiten sollte. Proben dieser Größe werden nach der nächtlichen Inkubation bei RT in Formaldehyd vollständig fixiert, idealerweise gefolgt von direkter Dehydrierung und Paraffineinbettung. Alternativ können feste Proben für 1 oder 2 Tage im Puffer gelagert werden. Für Immunfluoreszenzstudien sollte das Fixierungsmittel frisch aus Paraformaldehyd gelöst in einem geeigneten Puffer (z. B. phosphatgepufferter Salin [PBS] oder Tris-gepufferter Salin [TBS]) hergestellt werden. Während der fixativen Zubereitung muss die Temperatur unter 60 °C gehalten werden, um die Bildung von Ameisensäure zu verhindern. Formalin, ein Standardfixativ für Pathologie, sollte nicht verwendet werden, da es Methanol, andere Aldehyde, Ketone und Ameisensäure enthält. Diese Verunreinigungen führen zu erhöhter Epitopmaskierung und signifikanter Gewebe-Autofluoreszenz.
Für eine erfolgreiche Immunetikettierung muss die Epitopmaskierung in einem Prozess, der als Antigenabruf bezeichnet wird, rückgängig gemacht werden. Gewebeabschnitte werden in einem geeigneten Puffer erhitzt, der Methylenbrücken brechen soll, so dass Epitope für die Antikörper zugänglich werden7. Für den Nachweis von NETs wird der wärmeinduzierte Epitopabruf (HIER) anderen Methoden wie der Verwendung proteolytischer Enzyme vorgezogen. Routinemäßig wird die Immunkennzeichnung von Paraffinabschnitten mit einem einzigen Antikörper durchgeführt, gefolgt von einem peroxidase-markierten Sekundärantikörper, der mit einem ausfällenden Substrat nachgewiesen wird. Im Vergleich zur Immunfluoreszenz weisen enzymbasierte Detektionsmethoden aufgrund der Diffusion des Substrats eine geringere räumliche Auflösung auf, und im Allgemeinen ist der gleichzeitige Nachweis von mehr als einem Antigen begrenzt6.
Da derzeit keine Antikörper existieren, die ausschließlich an NETs binden, wird dieses Protokoll verwendet, um zwei Proteine zu kennzeichnen, Histon 2B, das kernnukleare, und neutrophile Elastase, die in Granulat lokalisiert ist. Bei nicht stimulierten Neutrophilen werden diese Proteine getrennt, aber sie werden in Neutrophilen, die sich einer NETosis unterziehen, und in NETs kolokalisiert. Der gleichzeitige Nachweis von zwei Antigenen kann mit zwei primären Antikörpern erreicht werden, die in verschiedenen Wirten und zwei artspezifischen sekundären Antikörpern mit unterschiedlichen Fluorchromen aufgezogen werden. Dieser Bericht ist eine Standardisierung unseres zuvor veröffentlichten Protokolls8 und verwendet eine Kombination von zwei kommerziell erhältlichen Antikörpern, die NET-Komponenten in paraffinintegriertem Gewebe, sowohl frisch als auch archivalisch, menschlichen und murinen Ursprungs zuverlässig färben.
Protocol
Gewebeprotokolle wurden vom Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, genehmigt (G0121/16). Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit der europäischen Richtlinie 2010/63/EU über Pflege, Tierschutz und Behandlung von Tieren durchgeführt.
1. Fixierung, Dehydrierung, Paraffineinbettung, Schnitt, Montage von Abschnitten
- Bereiten Sie 2% Formaldehydlösung vor, indem Sie Paraformaldehyd in TBS (pH 7.4) auflösen. Vermeiden Sie eine Erwärmung über 60 °C. Formaldehydlösung bei -20 °C abkühlen lassen.
- Frisches Gewebe (hier: Mauslunge) in eine gläserne Petrischale mit TBS geben. Mit einem Skalpell in Stücke sezieren, die 20 mm x 30 mm x 3 mm groß sind. Tauchen Sie die Probe in 2% Formaldehydlösung in TBS ein.
HINWEIS: Das Volumen des Fixativs sollte mindestens 20-fach so groß sein wie das des Gewebes. - Fix bei RT für 8-20 h. Proben auf TBS übertragen. In Kassetten geben.
- Dehydrieren Sie mit einer Reihe von Ethanol (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), mit jedem Schritt dauert 1 h.
- Klare Proben 2x in 100% Xylol (Dimethylbenzol), jeder Schritt 1 h.
- Paraffin 2x bei 60 °C (Schmelztemperatur 54 bis 56 °C) einweichen, jeden Schritt 1 h.
- Montieren Sie Proben mit Einbettformen, verwenden Sie den Kassettenboden als Abdeckung.
- Lassen Sie Paraffin verfestigen und entfernen Sie einbettende Formen.
- Bereiten Sie 3 m Gewebeabschnitte vor und lassen Sie sie auf 37 °C Wasserbad schwimmen.
- Schwimmerabschnitte auf der Wasseroberfläche auf Klebeglasgleiter(Materialtabelle).
- Inkubieren Sie Abschnitte auf Glasrutschen über Nacht bei 40 °C, um das Gewebe mit dem Glas zu verbinden.
2. Rehydrierung, wärmeinduzierte Epitop-Retrieval, Färbung, Montage, mikroskopische Analyse
- Legen Sie Abschnitte auf Glasscheiben in Regalen und tauchen Sie sie in die Medien, die für Dehydrierung und Clearing verwendet werden, in umgekehrter Reihenfolge, mit jedem Schritt für 5 min: 2x 100% Xylol, Ethanol-Serie (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).
- Erhitzen Sie ein Wasserbad mit einer temperaturgeregelten Kochplatte auf 70 °C. Legen Sie ein Glas gefüllt mit wärmeinduziertem Epitop-Retrieval (HIER)-Puffer (pH 9; Materialtabelle, die 10% Glycerin als Temperaturpuffer enthält, in ein Wasserbad. Wenn der HIER-Puffer 70 °C erreicht hat, legen Sie das Rack mit Dias in Pufferglas.
- Inkubieren Sie Dias für 120 min bei 70 °C.
- Entfernen Sie das Glas aus dem Wasserbad und lassen Sie es abkühlen zu RT. Spülen Sie Abschnitte 3x mit entionisiertem Wasser und einmal mit TBS (pH 7.4).
- Entfernen Sie vorsichtig Flüssigkeit aus Rutschen zwischen den Abschnitten mit gewalztem Filterpapier oder Wattestäbchen, so dass die Abschnitte hydratisiert werden.
- Schaffen Sie Barrieren um Abschnitte mit einem hydrophoben Barrierestift.
- Inkubieren Sie Abschnitte im Sperrpuffer (1% Rinderserumalbumin [BSA], 2% normales Eselserum, 5% Kaltwasserfischgelatine und Waschmittel [Materialtabelle] in TBS) bei RT für 30 min, um eine unspezifische Bindung zu verhindern.
- Verdünnung von Primärantikörpern in einer Konzentration von 1 g/ml im Sperrpuffer.
HINWEIS: Für Mensch und Maus NETs, eine Kombination von Kaninchen-Antikörper gegen neutrophile Elastase und Huhn Antikörper gegen Histone 2B verwendet werden kann (Tabelle der Materialien). - Dias in eine feuchte Kammer stellen. Entfernen Sie den Sperrpuffer und fügen Sie die verdünnten Primärantikörper hinzu, ohne die Abschnitte mit ausreichendem Volumen zu waschen, um eine Trocknung zu verhindern. Befeuchtekammer mit Paraffinfolie versiegeln und über Nacht bei RT inkubieren.
- Waschen Sie Abschnitte 3x mit TBS für je 5 min.
- Bereiten Sie die Arbeitslösung für sekundäre Antikörper im Blockierpuffer vor. Zum Nachweis von Primärantikörpern verwenden Sie sekundäre Antikörper, die in Esel aufgezogen und gegen Serumproteine von mehreren Arten vorabsorbiert werden (Materialtabelle). Abdeckung von Gewebeabschnitten mit Arbeitslösung von sekundären Antikörpern. Dias in feuchte Kammer übertragen, mit Paraffinfolie versiegeln. 1 h bei RT inkubieren.
HINWEIS: Esel Anti Kaninchen konjugiert cy2 und Esel Anti Huhn konjugiert Cy3 kann mit einem DNA-Gegenfleck kombiniert werden. - Waschen Sie Abschnitte 3x für je 5 min mit TBS, dann einmal für 5 min mit entionisiertem Wasser.
- Abdeckung Abschnitte mit Montagemedium (Tabelle der Materialien) und auftragen Deckglas Vermeidung Blasenbildung.
- Lassen Sie die Montage des Mediums erstarren, und analysieren Sie dann die Immunfluoreszenz mit einem Weitfeldmikroskop mit geeigneten Bandpassfiltern oder einem konfokalen Mikroskop.
Representative Results
Mit diesem Protokoll können NET-Komponenten erfolgreich in paraffinintegriertem Gewebe sowohl menschlichen als auch murinen Ursprungs nachgewiesen werden. Bei nicht stimulierten Neutrophilen befindet sich H2B ausschließlich im Kern und neutrophile Elastase in Granulaten; daher überlappen sich ihre Fluoreszenzsignale nicht. Im Gegensatz dazu kolokalisieren ne, H2B und DNA während der NETosis und nach der NET-Bildung teilweise. Wenn als grüne, rote und blaue Signale dargestellt, werden Bereiche der Kolokalisierung als weißliches Overlay dargestellt (Abbildung 1G, Abbildung 2Dund Abbildung 3D). Diese Überlagerung kann auch mit Bildanalysesoftware quantifiziert werden. Pixel aus überlappenden Signalen, die positiv für Grün, Rot und Blau sind, wurden verwendet, um ein violettes Overlay zu erstellen, das NET-Bereiche in Abbildung 1G', Abbildung 2D'und Abbildung 3D'darstellt. Einige der Zellen in Abbildung 1 und Abbildung 2 haben kernige Kerne, sind aber negativ für NE. Es wird angenommen, dass diese Zellen eosinophile Granulozyten sind.
Wenn die Gewebeabschnitte eine Dicke von 2–3 m haben, können sie durch Weitfeldmikroskopie mit 10- oder 20-fachen Objektiven analysiert werden. Ein Beispiel ist in Abbildung 1dargestellt, die einen Abschnitt des menschlichen Blinddarmgewebes zeigt, das für NE (grün), H2B (rot) und Hoechst 33342 (blau) gebeizt ist. Die Panels A, C, E und G stammen aus einem Bereich des Abschnitts, der NETs enthält, während die Panels B, D, F und H aus einem anderen Bereich desselben Abschnitts stammen, der zahlreiche Neutrophile enthält(Abbildung 1B, NE), aber keine NETs. Bereiche mit massiver NET-Bildung sind auch bei geringer Vergrößerung leicht zu finden, da alle drei NET-Komponenten kolokalisiert werden, oft in stringy extrazellulären Strukturen, die in der Überlagerung der drei Kanäle als weißliche extrazelluläre Fasern erscheinen (Abbildung 1G ), lila Overlay in Abbildung 1G'.
Die Färbemuster beider Gewebebereiche unterscheiden sich deutlich, wobei NE in Granulaten enthalten ist (Abbildung 1B) und DNA in Kernen (Abbildung 1F). Interessanterweise ist die Färbung für H2B in neutrophilen Bereichen(Abbildung 1D) im Vergleich zu NET-haltigem Gewebe eher schwach (Abbildung 1C). Dies könnte auf die Größe des Antikörpers zurückzuführen sein (IgY hat 180 kD im Vergleich zu 150 kD für IgG), was eine Bindung an kompaktes Chromatin in intakten Kernen verhindern kann, während der Zugang zu H2B erleichtert wird, wenn das Chromatin wie bei NETs dekondensiert wird (Abbildung 1C).
Für eine höhere Auflösung müssen konfokale Mikroskope oder Weitfeldmikroskope mit Dekonvolution eingesetzt werden, um unscharfe Unschärfen aimieren zu können. Abbildung 2 zeigt einen NET-reichen Bereich aus demselben menschlichen Appendicitis-Exemplar. Es ist eine maximale Projektion eines konfokalen Stapels. NE (grün, Abbildung 2A) findet sich in Granulaten, ist aber auch extrazellulär reichlich vorhanden, wo es mit H2B (rot, Abbildung 2B)und DNA (blau, Abbildung 2C)kolokalisiert wird. Die extrazelluläre Kolokalisierung führt zu einer weißlichen Farbkombination (Abbildung 2D). Diese Pixel positiv für Grün, Rot und Blau wurden verwendet, um ein violettes Overlay zu erstellen, das NETs in Abbildung 2D' darstellt.
Abbildung 3 ist ein Detail eines zentralen Abschnitts aus einer Mauslunge, die mit Mycobacterium tuberculosis (M. tb) infiziert ist. Die Antigen-Retrieval- und Färbebedingungen sind die gleichen wie für Abbildung 1 und Abbildung 2. Auch hier ist die Kolokalisierung aller drei NET-Komponenten deutlich sichtbar als weißliche Bereiche zwischen Neutrophilen, die verwendet wurde, um eine violette Schicht zu erstellen, die NETs in Abbildung 3D'anzeigt.
Die Spezifität der Färbung wird in der Ergänzenden Abbildung 1gezeigt, die eine vernachlässigbare Färbung mit Kontrollantikörpern darstellt, und die Zusatzabbildung 1A,B zeigt Kaninchen nicht-immunes Serum (grün) und Huhn anti-GFP IgY (rot). Abbildung 1 C,D zeigt die Färbung mit sekundären Antikörpern allein, die Kombination war die gleiche wie in Abbildung 1, Abbildung 2und Abbildung 3. Ergänzende Abbildung 1A,C zeigt einen Abschnitt der menschlichen Blinddarmentzündung ähnlich Abbildung 1 und Abbildung 2. Ergänzende Abbildung 1B,D ist Maus-Lungengewebe ähnlich Abbildung 3. DNA ist mit Hoechst 33342 gefärbt. Die Maßstabsleiste steht für 25 m.
Abbildung 1: Weitfeldfluoreszenzmikroskopie eines Paraffinabschnitts einer menschlichen Appendizitis-Probe.
Die Panels A, C, E und G zeigen einen Gewebebereich mit NETs, während die Panels B, D, F und H einen anderen Bereich desselben Abschnitts zeigen, der reich an Neutrophilen, aber ohne NET-Bildung ist. Färbung ist gegen NE (A,B; grün), H2B (C,D; rot) und DNA (E,F; blau). Abbildung 1G,H stellt die Überlagerung aller drei Kanäle dar. Pixel mit einer Intensität zwischen 80 und 256 in allen Farben stellen Bereiche mit überlappender Färbung für NE, H2B und DNA dar und gelten als abgeleitet von NETs oder Neutrophilen, die sich einer NETosis unterziehen. Diese Pixel wurden im Panel G'pseudofarben als violett gefärbt, wo sie eine große Fläche bilden; und in Panel H', wo nur kleine Flecken gefunden werden. Die Bilder wurden mit einem Weitfeldmikroskop mit einem 20-fachen Objektiv aufgenommen, und die Maßstabsleiste stellt 25 m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Konfokale Fluoreszenzmikroskopie von NET-Komponenten in einer menschlichen Appendizitis-Probe.
Es wurde derselbe Gewebeabschnitt verwendet, der in Abbildung 1 verwendet wurde. (A) Färbung gegen NE, (B) Darstellung von H2B und (C) Hoechst 33342 Färbung der DNA. (D) Die Überlagerung aller drei Kanäle. Die Kolokalisierung aller drei Signale ist pseudofarbenes Violett im Panel D'. Dazu wurden Pixel mit einer Intensität >80 in allen drei Farben mit Volocity 6.3 erkannt. Der violette Bereich zeigt NETs oder Neutrophile, die sich einer NETosis unterziehen. Die Bilder wurden mit einer konfokalen Mikroskopie als Z-Stacks aufgenommen und als maximale Projektion präsentiert. Die Maßstabsleiste steht für 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Konfokale Fluoreszenzmikroskopie von NET-Komponenten in einer mit M. tbinfizierten Mauslunge .
Es ist ein Detail aus dem zentralen Teil eines Abschnitts einer vollständigen Lunge mit massiver neutrophiler Infiltration. (A) NE Färbung, (B) H2B Färbung, und (C) DNA-Färbung. (D) Die Überlagerung aller drei Kanäle. Das violette Overlay im Panel D' zeigt Pixel mit Intensitätswerten von >80 in allen drei Farben an, die Neutrophile anzeigen, die NETosis und NETs durchlaufen. Die Bilder wurden als Z-Stacks mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen und als maximale Projektion dargestellt. Die Maßstabsleiste steht für 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Färbungskontrolle mit unabhängigen primären Antikörpern. Human (A,C) und murines Gewebe (B,D) wie in Abbildung 1 und Abbildung 2bzw. Abbildung 3verwendet wurde, waren mit nicht verwandten primären Antikörpern (A,B) oder ohne primäre Antikörper (C,D) gefärbt. Als Kontrollprimärantikörper in den Panels A und B wurden Serum von einem nicht geimpften Kaninchen und ein Huhn IgY gegen GFP angewendet. Sekundäre Antikörper waren die gleichen wie in allen anderen Färbungen gezeigt und auch in den Paneelen C und D verwendet. Wie erwartet wurde unter allen Bedingungen eine vernachlässigbare Hintergrundfärbung festgestellt, die die Spezifität der Antikörper veranschaulicht, die für Abbildung 1, Abbildung 2und Abbildung 3verwendet werden. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen, DNA mit Hoechst 33342 gebeizt, und Maßstabsbalken stellt 25 'm. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Discussion
Mit dem wachsenden Bewusstsein für die Rolle von NETs bei der Pathogenese9gewinnt deren Nachweis im Gewebe von Patienten oder Versuchstieren zunehmend an Bedeutung. Paraffin-eingebettete Gewebeproben haben eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu anderen Gewebepräparaten (z. B. Abschnitte von kryokonservierten Proben). Die Gewebekonservierung in paraffin-eingebetteten Proben ist deutlich überlegen, und sobald sie eingebettet sind, werden die Proben jahrzehntelang konserviert, was retrograde Studien ermöglicht. Für den Nachweis von NETs, die filigrane Strukturen sind, ist eine gute Probenkonservierung eine Voraussetzung, die die Verwendung von kryokonserviertem Material ausschließt, das anfällig für Gewebeschäden aufgrund der Eiskristallbildung ist, die zu Artefakten führen kann, die morphologisch ähneln Netze.
Zur optimalen Konservierung sollte Gewebe von Versuchstieren kurz nach dem Tod, idealerweise durch Perfusion, fixiert werden, um eine Autolyse zu vermeiden. Als fixative, frisch zubereitete oder frisch aufgetaute Paraformaldehydlösungen in einem geeigneten Puffer wie TBS oder PBS Erz optimal. Dies ist chemisch definiert im Gegensatz zu Formalin präparaten Präparaten für Standard-Histologie verwendet, und induziert weniger Gewebe-Autofluoreszenz. Im Gegensatz dazu wird menschliches Gewebe oft nicht direkt nach der Exzision fixiert, und als fixative, in der Regel wird eine 10% Verdünnung von Formalin verwendet, die 10% bis 15% Methanol als Stabilisator enthält, um Polymerisation zu verhindern, sowie Ameisensäure, andere Aldehyde und Ketone . Oft wird das Gewebe in diesem Fixativ für längere Zeit vor der Einbettung gespeichert. Das Ergebnis kann die Autolyse (abhängig von der Zeit zwischen Exzision und Fixierung) und übermäßige Bildung von Methylenbrücken aufgrund der Überfixierung sein. Formaldehydfixierung induziert Veränderungen in der tertiären Struktur von Proteinen durch Bildung von intra- und intermolekularen Methylenbrücken10. Nicht-proteinhaltige Zellbestandteile wie Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und Lipide werden nicht direkt fixiert, sondern im dreidimensionalen Proteinverbund immobilisiert. Für eine erfolgreiche Kennzeichnung müssen Methylenbindungen gebrochen werden, um die Epitope bei der Antigenrückgewinnung freizulegen. Dies wird durch Erhitzen von Gewebeabschnitten erreicht, die in einem geeigneten wärmeinduzierten Antigen-Abrufpuffer (HIER-Puffer) auf Mikroskopschlitten montiert sind11. Unsere vorherige Studie analysierte den Einfluss von pH und Temperatur von HIER-Puffern auf den Nachweis von NET-Komponenten in paraffiniertem Gewebe, und es wurde festgestellt, dass eine erfolgreiche Gewebevorbehandlung für eine Komponente oft für eine zweite Komponente suboptimal ist8.
Inzwischen hat sich herausgestellt, dass das Erhitzen des Gewebes auf 70 °C im HIER-Puffer bei einem pH-Wert von 9 ein guter Kompromiss für viele NET-Komponenten ist und eine gute Gewebekonservierung behält, die oft bei höheren Temperaturen beeinträchtigt wird. Es wird vorgeschlagen, die als Ausgangspunkt angegebene Abrufzeit zu verwenden, aber insbesondere bei Archivproben unbekannter Fixierungsparameter kann die Färbeintensität unbefriedigend sein. In diesem Fall kann die Verlängerung oder höhere Temperatur während des Abrufvorgangs die Färbeeffizienz verbessern. Dies kann auch die Histon 2B Färbung des in unserem Protokoll verwendeten IgY-Antikörpers beeinflussen. Wie in Abbildung 1dargestellt, findet sich dekondensiertes Chromatin bei Neutrophilen, die sich einer NETosis unterziehen, sowie bei NETs Flecken, die mit diesem Antikörper viel stärker sind als bei Chromatin in ruhenden Neutrophilen. Dies ist wahrscheinlich auf den eingeschränkten Zugang des 180 kDa IgY Moleküls zu kompakten Kernen zurückzuführen und kann sich nach erhöhter Epitoprückgewinnung unterscheiden. Dies kann die Bindungseffizienz auch in Bereichen von kondensiertem Chromatin verstärken, was zu einer stärkeren Fluoreszenz in normalen Kernen von Neutrophilen und anderen Zellen führen wird. Der Unterschied in der Färbeeffizienz zwischen Neutrophilen, die sich einer NETosis unterziehen, und nicht stimulierten Neutrophilen könnte weniger ausgeprägt sein als in Abbildung 1dargestellt. Bereiche der NET-Bildung würden noch durch die Kolokalisierung von NE, H2B und DNA identifiziert.
Das Fixierungsverfahren kann auch eine signifikante Autofluoreszenz des Gewebes induzieren, vor allem im bläulich/grünen Teil des Spektrums. Es ist wichtig, den größten Teil dieser Autofluoreszenz zu vermeiden, indem sie geeignete schmale Bandpass-Fluoreszenzfiltersätze (Weitfeld) oder Detektoreinstellungen (konfokad) verwenden, die dem Emissionsmaximum des fluorchromen Fluorchroms entsprechen, das bei blauer Anregung verwendet wird, z. B. Cy2, Alexafluor 488. In extremen Fällen der Autofluoreszenz sollte der bläulich-grüne Teil des Spektrums vermieden werden. Stattdessen können Fluoreszenzsignale im weit roten Teil des Spektrums leichter erkannt werden (z. B. sekundäre Antikörper, die an Cy 5 oder Alexafluor 635 gekoppelt sind), aber dies erfordert filterlose Schwarz-Weiß-Kameras oder konfokale Mikroskope. Da das menschliche Auge jenseits von 600 nm eher unempfindlich ist, können weit rote Fluoreszenzsignale mit dem Okular kaum erkannt werden. In jedem Fall ist es wichtig, negative Kontrollen (z. B. nicht-immune Sera/Isotyp-Kontrollen anstelle von primären Antikörpern oder auslassenden Primärantikörpern) zu verwenden, um geeignete Expositionszeiten oder Detektoreinstellungen zu bestimmen.
Gewebeabschnitte von 1 x 2 m können mit Weitfeldmikroskopen mit 10- oder 20-fachen Objektiven analysiert werden. Diese Linsen bieten eine große Brenntiefe, so dass (fast) der gesamte Gewebebereich im Fokus stehen wird. Dies kann verwendet werden, um Gewebeabschnitte schnell nach Bereichen der NET-Bildung zu scannen, wenn sie ausreichend groß sind (wie in Abbildung 1). Die Kolokalisierung der grünen (NE), roten (H2B) und blauen (DNA) Kanäle führt zu einer weißen Färbung, die Bereiche der NET-Bildung anzeigt (Abbildung 1G). Für höhere Vergrößerungen sind konfokale oder weiträumige Mikroskope mit Dekonvolution notwendig. Abbildung 2 zeigt Details der menschlichen Appendicitis-Probe, die auch für Abbildung 1verwendet wird. In Abbildung 2Alokalisiert NE kleine Punkte (Granulat), aber ein großer Teil ist extrazellulär, oft bilden Streifen, die sich mit H2B (Abbildung 2B) und DNA überlappen (Abbildung 2C). Diese Kolokalisierung führt zu einem weißlichen Overlay, das NETs angibt (Abbildung 2D). Ein sehr ähnliches Muster findet sich im Lungenbereich einer mit M. tuberculosis infizierten Maus (Abbildung 3).
Die hier vorgestellten Proben zeichnen sich durch Bereiche mit einem hohen NET-Bildungsgrad aus, die auch bei geringer Vergrößerung identifiziert werden können. Je nach Gewebedichte und jeweiligen Stimulus kann die NET-Bildung viel weniger ausgeprägt sein, bis hin zur NET-Bildung kleiner Gruppen von Neutrophilen (z. B. bei Myokarditis siehe vorherige Publikation12). Es wird angenommen, dass dieses Protokoll dazu beitragen wird, mehr Forschung über NE im Gewebe zu fördern und hoffentlich bei der Entschlüsselung unerkannter Rollen von NETs bei der Bildung oder Prävention von Krankheiten zu helfen.
Disclosures
Die Finanzierungsquelle dieser Arbeit ist die Max-Planck-Gesellschaft. Wir danken Arturo Zychlinsky für die kritische Lektüre des Manuskripts und Philippe Saikali für das Mausgewebe.
Acknowledgments
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
| cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
| donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
| embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
| embedding molds | Sakura | 4162 | |
| embedding station | Microm | AP280 | |
| ethanol | Roth | 9065.4 | |
| filter paper, rolled | OCB | ||
| forceps | Dumont | 7a | |
| glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
| glycerol | Roth | 3783.1 | |
| HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
| moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
| Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
| normal donkey serum | Merck | S30 | |
| PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
| paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
| paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
| petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
| rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
| racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
| scalpel | Braun | Fig.22 | |
| Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
| tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
| Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
| Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
| Tween 20 | Fluka | 93773 | |
| water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
| widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
| xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A.
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Cattoretti, G., et al. Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Weckbach, L. T., et al. Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis. Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).
