Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह प्रदर्शित करना है कि एक दिन पुराने Xenopus लेविस भ्रूणों की आंखों में डीएनए/DOTAP मिश्रण को माइक्रोइंजेक्ट कैसे किया जाए, और कैसे व्यक्तिगत ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोडॉर्स को टेक्सटल मिडब्रेन में व्यक्त किया जाए और कैसे बनाएं। बरकरार, जीवित Xenopus tadpoles.
Abstract
जलीय मेंढक Xenopus laevis के टैडपोल के प्राथमिक दृश्य प्रक्षेपण तंत्र है कि न्यूरॉन कनेक्टिविटी के विकास को विनियमित अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है. रेटिनो-टेक्टल प्रक्षेपण की स्थापना के दौरान, ऑप्टिक एक्सॉन आंखों से विस्तार करते हैं और अपने लक्ष्य ऊतक, ऑप्टिक टेकटम तक पहुंचने के लिए मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों के माध्यम से नेविगेट करते हैं। एक बार ऑप्टिक एक्सॉन tectum में प्रवेश, वे टर्मिनल arbors कि कार्य synaptic कनेक्शन वे tectum में लक्ष्य interneurons के साथ कर सकते हैं की संख्या में वृद्धि करने के लिए विस्तृत. यहाँ, हम डीएनए एन्कोडिंग ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करने के लिए एक विधि का वर्णन, और लाभ- और हानि के समारोह जीन constructs, ऑप्टिक न्यूरॉन्स में (रेटिना गुच्छिका कोशिकाओं) Xenopus भ्रूण में. हम बताते हैं कि एक दिन पुराने भ्रूणों की आंखों में संयुक्त डीएनए/लिपोफेक्शन अभिकर्मक को माइक्रोइंजेक्ट कैसे करें ताकि बाह्य जीन ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एकल या छोटी संख्या में व्यक्त किए जा सकें। GFP के साथ जीन टैगिंग या सह एक GFP प्लाज्मिड के साथ इंजेक्शन द्वारा, बदल आणविक संकेतन के साथ व्यक्तिगत ऑप्टिक न्यूरॉन्स के टर्मिनल axonal arbors बरकरार के दिमाग में सीधे छवि बनाई जा सकती है, Xenopus tadpoles रहने वाले कई दिन बाद, और उनकी आकृति विज्ञान मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल सेल स्वायत्त आणविक तंत्र है कि विवो में ऑप्टिक एक्सॉन arborization के विकास underlie के निर्धारण के लिए अनुमति देता है.
Introduction
तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान, presynaptic न्यूरॉन्स के axons मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों के माध्यम से नेविगेट करने के लिए अपने लक्ष्य क्षेत्रों तक पहुँचने. जब axons अपने लक्ष्य ऊतकों पर आक्रमण, वे postsynaptic लक्ष्य न्यूरॉन्स के साथ synaptic कनेक्शन स्थापित. कई प्रकार के न्यूरॉन्स में, एक्सॉन ्स्समें से वे टर्मिनल शाखाओं या आर्बोर्स 1 के विस्तार नेटवर्क द्वारा कर सकते हैं कि synaptic कनेक्शन की संख्या और स्थानिक सीमा में वृद्धि होतीहै। जलीय मेंढक Xenopus laevis के टैडपोल के रेटिनो-टेक्टल प्रक्षेपण टर्मिनल एक्सॉन आर्बोराइजेशन और synaptic कनेक्टिविटी2,3,4 अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली कशेरुकी मॉडल है . व्यक्तिगत GFP सामान्य और बदल आणविक संकेत के साथ ऑप्टिक axonal arbors व्यक्त बरकरार में सीधे देखा जा सकता है, रहने वाले Xenopus tadpoles5,6,7,8. अकेले या एक साथ ऑप्टिक न्यूरॉन्स की छोटी संख्या में जीन की पूर्ण लंबाई या छोटा संस्करणों के साथ GFP व्यक्त करने के लिए, हम एक दिन पुराने Xenopus भ्रूण9की eyebuds में माइक्रोइंजेक्शन / 10.यह तकनीक मूल रूप से युवा Xenopus टैडपोल्स में ऑप्टिक एक्सॉन पथ खोज के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, और तब से हमारे और दूसरों के द्वारा लागू किया गया है सेल-स्वायत्त आणविक तंत्र ऑप्टिक एक्सॉन अंतर्निहित निर्धारित करने के लिए एक्सिनोपस टैडपोल्स5,6,7,8,9,10में वृक्षीकरण .
ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या में exogenous जीन व्यक्त करने के लिए वैकल्पिक तकनीक अन्य मॉडल प्रजातियों में विकसित किया गया है, साथ ही एक्स laevisमें. तथापि, इनमें से प्रत्येक दृष्टिकोण एक्सनोपस भ्रूणों की आंखों में डीएनए/लिपोफेक्शन अभिकर्मक के माइक्रोइंजेक्शन की तुलना में चुनौतियां और सीमाएँ प्रस्तुत करता है। चूहों में, ट्रांसजेनेसिस का उपयोग ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या में जीनों को व्यक्त करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी महंगा है और समय लेने वाली और ट्रांसजेनिक चूहों अक्सर अवांछनीय दुष्प्रभावों के साथ मौजूद11. ऑप्टिक न्यूरॉन्स में बहिर्जात जीनों को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक जेब्राफ़िश को प्रारंभिक क्लीवेज अवस्थाभ्रूणों मेंप्लाज्मिड इंजेक्शन लगाकर भी बनाया जा सकता है . हालांकि, इस प्रक्रिया के लिए एक विशिष्ट प्रमोटर की क्लोनिंग की आवश्यकता होती है जो जेब्राफिश लार्वा 12 में ऑप्टिक न्यूरॉन्स में मोज़ेक पैटर्न में जीनों को व्यक्त करताहै। ट्रांसजेनिक जेब्राफ़िश में ऑप्टिक न्यूरॉन्स में exogenous डीएनए की अभिव्यक्ति की आवृत्ति भी कुछ कम है ([lt;30%) Xenopus tadpoles की तुलना में है कि डीएनए के साथ microined थे/ ओवो इलेक्ट्रोपोट्रेशन में भी13चूजों में ऑप्टिक न्यूरॉन्स की छोटी संख्या में जीनों को व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया गया है . हालांकि, इस प्रक्रिया को पूरी तरह से तंत्र है कि ऑप्टिक अनुमानों की स्थापना की विशेषता में विफल रहा है क्योंकि ऑप्टिक एक्सॉन arborization बरकरार, रहने वाले लड़की भ्रूण में छवि नहीं किया जा सकता है. अंत में, कई प्रयोगशालाओं ने जीनों को ट्रांसफेक्ट करने के लिए इलेक्ट्रोपोट्रेशन का उपयोग किया है जो कि एक्सिनोपस टैडपोल्स14,15में ऑप्टिक न्यूरॉन्स की छोटी संख्या में होता है । फिर भी, इलेक्ट्रोपोरोनेशन के लिए उपकरणों और प्रोटोकॉलों (तरंग दालों के स्टिम्युलेटर, इलेक्ट्रोड, स्थानिक और अस्थायी पैटर्न) के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जिसका उपयोग Xenopus भ्रूणों की आंखों में डीएनए/लिपोफेक्शन अभिकर्मक के माइक्रोइंजेक्शन के लिए किया जाता है।
हम और अन्य लोगों ने पहले एक्सनोपस भ्रूणों की आंखों में सूक्ष्म इंजेक्शन/लिपोफेक्शन की तकनीक का उपयोग सेल स्वायत्त संकेतन तंत्र का निर्धारण करने के लिए किया जो ऑप्टिक एक्सॉन आर्बोाइजेशन5,6, 7 , 8.हमने शुरू में इस दृष्टिकोण का उपयोग जेनोपस टैडपोल्स5,6में ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोाइजेशन में कैदरिन और वंट एडेप्टर प्रोटीन के कार्यों को विभाजित करने के लिए किया था. एक अध्ययन में हमने यह दिखाया कि विवो5में ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोजरों को आरंभ करने और उसे आकार देने के लिए क्रमशः जेड-कैटेनिन और पीडीजेड के लिए जेड-कैटेनिन के लिए बाध्यकारी होने की आवश्यकता है। दूसरी रिपोर्ट में हमने यह प्रदर्शित किया कि $-कैटिनिन तथा जीएसके-3 के लिए जेड-कैटिनन बाध्यकारी डोमेन, अधर ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोर्स6के विपरीत रूप से मॉडुलेट प्रक्षेप पैटर्न। हाल ही में, हमने Xenopus tadpoles7में ऑप्टिक ऐक्सोनल आर्बोर्स की आकृतिक विशेषताओं को विनियमित करने में Wnt कारक, एडेनोमैटस पोलिपोसिस कोलाई (एपीसी) के लिए भूमिकाओं की पहचान की। APC के N-terminal और केंद्रीय डोमेन को सह-व्यक्त करके जो अलग-अलग ऑप्टिक न्यूरॉन्स में GFP के साथ-साथ जेड-कैटेनिन स्थिरता और माइक्रोट्युबल संगठन को मॉडुलित करते हैं, हमने शाखा संख्या पर इन एपीसी इंटरैक्शन डोमेन के लिए साझा और अलग-अलग भूमिकाएं निर्धारित की हैं, लंबाई, और विवो7में ऑप्टिक axonal arbors में कोण . एक अन्य प्रयोगशाला ने एक्सनपोस टैडपोल्स8में ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोर्स में बीडीएनएफ रिसेप्टर, टी.के.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी.बी. रिसेप्टर द्वारा संकेतन के लिए सेल स्वायत्त भूमिकाओं का निर्धारण करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन/लिपोफेक्शन तकनीक का उपयोग किया। इस समूह ने यह दिखाया कि विवो8में व्यक्तिगत ऑप्टिक एक्सॉन आर्बोमेंस में एक प्रमुख-नकारात्मक TrkB क्षुब्ध शाखाकरण और synaptic परिपक्वता की अभिव्यक्ति. कुल मिलाकर, Xenopus में lipofection तकनीक पहले से ही देशी वातावरण में ऑप्टिक एक्सॉन शाखाओं में विभिन्न जीन की विशिष्ट भूमिकाओं को प्रकाशित किया है.
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Protocol
यहाँ वर्णित सभी तरीकों को ट्यूरो विश्वविद्यालय कैलिफोर्निया (प्रोटोकॉल ] TUCA003TE01X के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. एक्स लेविस भ्रूण प्राप्त करना
- मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी) के साथ प्राइम्ड पुरुष और मादा वयस्क मेंढ़कों के जोड़े की प्राकृतिक संभोग द्वारा एक्स लेविस भ्रूण प्राप्त करें, मादा वयस्क मेंढ़कों से बहाने के इन विट्रो निषेचन द्वारा एचसीजी के साथ, या सीधे आदेश द्वारा(तालिका सामग्री)।
-
डिजेली भ्रूण कमरे के तापमान पर 2% सिस्टेस्टीन विलयन के साथ प्राप्त किए गए (सामग्री तालिका)16.
- एक बड़े पेट्री डिश में 50 डिग्री 100 भ्रूण लीजिए। समाधान भ्रूण decanting या एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipette का उपयोग करके कर रहे हैं निकालें. भ्रूण युक्त पकवान में 2% cysteine समाधान (0.5 ग्राम cysteine 25 एमएल डीडीएच2हे, पीएच 8.0 करने के लिए पीएच) के 25 एमएल जोड़ें।
- धीरे से cysteine समाधान में भ्रूण युक्त पेट्री पकवान घूमता जब तक भ्रूण के जेली कोट गिर जाते हैं और भ्रूण पकवान के केंद्र में एक झुरमुट में इकट्ठा (5 "10 मिनट). इस बिंदु पर, धीरे धीरे और धीरे से एक अपशिष्ट बीकर में cysteine समाधान डालना. ध्यान रखें कि cysteine समाधान के साथ अपशिष्ट बीकर में भी कई भ्रूण डालना नहीं है।
- पेट्री डिश 6x में भ्रूण को 10% संशोधित मार्क के रिंगर समाधान (एमएमआर) या अन्य उपयुक्त समाधान (उदा., संशोधित बार्थ के समाधान, एमबीएस) के साथ भ्रूण ों को कुल्ला करें, हर बार समाधान को बदलने के बाद पकवान को घुमाते हैं।
- 10% एमएमआर में भ्रूणों को तब तक संस्कृति करें जब तक कि वे विकास ात्मक चरणों तक नहीं पहुंच जाते 22-2417. Xenopus भ्रूण 15 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान पर इनक्यूबेट किया जा सकता है। भ्रूणों के विकास की दर उस तापमान पर निर्भर करती है जो उन्हें17वर्ष की अवस्था में इनक्यूबेट किया जाता है .
नोट: एक सूची से आदेश दिया Xenopus भ्रूण आम तौर पर विकास के चरणों में प्रयोगशाला में पहुंचें 20-24, ताकि वे dejellied और microinded किया जा सकता है तुरंत.
2. डीएनए Plasmids की तैयारी और एक डीएनए /
- Subclone डीएनए अभिव्यक्ति Xenopus अभिव्यक्ति वेक्टर pCS2 + या pCS2 + मीट्रिक टन या डेरिवेटिव में निर्माण (मूल रूप से डी टर्नर और आर Rupp द्वारा निर्मित)5,6,7. pCS2+ सदिशों में एक संशोधित साइटोमेगागोवायरस (सीएमवी) प्रमोटर होता है जो मेंढ़कों में जीन अभिव्यक्ति की सुविधा प्रदान करता है।
- मानक प्रक्रिया का पालन करते हुए न्यूनतम किट(सामग्री की तालिका) के साथ जीएफपी और/या ब्याज के जीनयुक्त PCS2 प्लाज्मिड्स को बढ़ाना। मिनिप्रेप प्रोटोकॉल के अंतिम एल्यूशन चरण में, डी डी एच2व् में डीएनए का अनुक्रमिक उत्सर्जन करें ताकि अंतिम सांद्रता की प्राप्ति हो।
- सभी pCS2 प्लाज्मिडको -80 डिग्री सेल्सियस पर तब तक स्टोर करें जब तक कि माइक्रोइंजेक्शन/लिपोफेक्शन प्रयोग करने के लिए तैयार न हो जाए, अर्थात जब भ्रूण विकास ात्मक चरणों में होते हैं, 22 डिग्री 24।
- थाव डीएनए प्लाज्मिड कमरे के तापमान पर lipofected किया जा करने के लिए। lipofection से तुरंत पहले, संक्षेप में अपकेंद्रण डीएनए प्लाज्मिड. यह डीएनए में बनाने से वेग को रोक देगा /
- डीएनए प्लाज्मिड को 1:3 (w/v ) अनुपात9,10में डीओटीएपी लिपोसोमल ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक (सामग्री की तालिका) के साथ मिलाएं . उदाहरण के लिए, डीएनए के 2 डिग्री ग्राम को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और डीओएपी के 6 डिग्री एल को जोड़ें, या माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डीएनए के 3 डिग्री ग्राम को स्थानांतरित करें और 9 डिग्री एल डीओटीएपी जोड़ें।
- एक बार डीएनए और DOTAP संयुक्त कर रहे हैं, धीरे microcentrifuge ट्यूब झटका समाधान मिश्रण करने के लिए. डीएनए/DOTAP समाधान मिश्रण के बाद थोड़ा अपारदर्शी हो जाना चाहिए.
- यदि दो प्लाज्मिड को एक साथ lipofected किया जाना है (जैसे, एक दूसरे pCS2 प्लाज्मिड के साथ pCS2-GFP जिसमें एक जीन का छोटा या पूर्ण लंबाई संस्करण होता है) ऑप्टिक न्यूरॉन्स में, पहले दो प्लाज्मिड को मिलाएं (उन दोनों को संक्षिप्त रूप से सेंट्रीफ्यूजिंग करने के बाद) एक 1:1 अनुपात में, और फिर जोड़ें एक 1:3 (w/v) अनुपात पर DOTAP. उदाहरण के लिए, pCS2-GFP के 1 $g के साथ एक दूसरे pCS2 प्लाज्मिड के 1 $g के साथ गठबंधन और फिर DOTAP के 6 डिग्री एल जोड़ें.
नोट: अध्ययनों से पता चला है कि इन विकासात्मक अवस्थाओं में Xenopus भ्रूणों की आंखों में दो प्लाज्मिड के लिपोफेक्शन के परिणामस्वरूप व्यक्तिगत ऑप्टिक न्यूरॉन्स9,10में उनकी सह-अभिव्यक्ति होगी .
3. डीएनए के साथ एक माइक्रोइंजेक्शन सुई लोड हो रहा है /
- सूक्ष्म ताने (सामग्री कीसारणी)के साथ खींचे गए कांच के माइक्रोकैपिलरी पिपेट की नोक को धीरे से क्लिप करें।
- खनिज तेल के साथ कांच microcapillary pipette backfill इस तरह है कि खनिज तेल के एक छोटे से बूंद micropipette के काटा टिप पर प्रकट होता है का उपयोग कर. खनिज तेल के साथ माइक्रोकैपिलरी पिपेट आधे रास्ते भरें।
- खींच ासाकेत सूक्ष्मकपाली पिपेट को लोड करें जो अब एक इंजेक्शन धारक में खनिज तेल से भर जाता है जो इंजेक्टर से जुड़ा होता है। यदि एक इंजेक्टर(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर , उस पर microcapillary pipette लोड करने से पहले प्लंजर आधे रास्ते से बाहर निकाल दें. एक बार microcapillary pipette सुरक्षित रूप से इंजेक्टर से जुड़ा हुआ है, पूरी हद तक प्लंजर का विस्तार करने के लिए पुष्टि करें कि microcapillary pipette दृढ़ता से इंजेक्टर से जुड़ा हुआ है और प्लंजर के विस्तार के साथ कदम नहीं है.
- पैराफिन पेपर के कट वर्ग (1 इंच वर्ग) शीट पर डीएनए/DOTAP मिश्रण के 3 डिग्री एल ड्रॉप को स्थानांतरित करें।
- एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, डीएनए / DOTAP ड्रॉप में कांच microcapillary pipette की नोक ले जाएँ।
- इंजेक्शन उपकरण पर भरने के विकल्प का उपयोग करके कांच माइक्रोकैपिलरी पिपेट में धीरे-धीरे डीएनए/DOTAP ड्रॉप को चूसें। के रूप में तरल microcapillary pipette में भरी हुई है, ड्रॉप छोटे हो जाएगा. डीएनए/DOTAP समाधान की थोड़ी अस्पष्टता के कारण, खनिज तेल और डीएनए/DOTAP समाधान के बीच की सीमा कांच माइक्रोकैपिलरी पिपेट में दिखाई देनी चाहिए (चित्र 1)। यदि आवश्यक हो, तो समय-समय पर माइक्रोकैपिलरी पिपेट को भरना बंद करें ताकि कांच माइक्रोकैपिलरी पिपेट में दबाव को फिर से कैलिब्रेट करने की अनुमति मिल सके।
चित्रा 1: माइक्रोकैपिलरी पिपेट की छवियाँ। छवियाँ इंजेक्शन उपकरण पर एक microcapillary pipette दिखाने के लिए, से पहले(ए),और बाद (बी) डीएनए के साथ भरने / खुला तीर, माइक्रोकैपिलरी पिपेट में प्लंजर की नोक(ए, बी)। बंद तीर, भरा microcapillary pipette में खनिज तेल औरडीएनए / स्केल बार - 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
4. 1 दिन पुराने Xenopus भ्रूण के Eyebuds में DNA/DOTAP माइक्रोइनइंजेक्शन
- मैन्युअल रूप से दस चरण 20 डिग्री 24 Xenopus भ्रूण 0.1x MMR से भरा एक 10 मिमी पेट्री डिश में ठीक बल के साथ। भ्रूण को घायल करने से बचने के लिए कमर पर विटेललाइन लिफाफा पकड़ें। दोनों प्रयोगकर्ता के बाएँ और दाएँ हाथों में बलप्स के साथ, vitelline लिफाफा के बुलबुले पॉप और vitelline लिफाफा से भ्रूण जारी. सावधानी बरतें कि विटेललाइन लिफाफा निकालते समय भ्रूण को घायल न करें।
नोट: चरण 20 में शुरू, Xenopus भ्रूण भ्रूण के पूर्वकाल और पीछे के हिस्सों के बीच एक इंडेंटेशन या 'वाइस' विकसित. इस कमर इस स्थिति में vitelline लिफाफा और भ्रूण के बीच फार्म के लिए एक अंतर की अनुमति देता है. - एक कटौती टिप के साथ एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipette का उपयोग करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए 5 "10 devitellinized चरण 22"24 भ्रूण एक 10 मिमी पेट्री 1x MMR से भरा पकवान के लिए.
नोट: 1x एमएमआर में उच्च नमक समाधान पंचर घावों के उपचार की सुविधा देता है जो माइक्रोइंजेक्शन से परिणाम देगा। - स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, प्रत्येक हाथ में बलकेड़ के साथ पेट्री डिश में devitellinized भ्रूण में से एक को समझ, और भ्रूण की व्यवस्था इतना है कि अपने पूर्वकाल ध्रुव को देखने के क्षेत्र में बताया जाता है. भ्रूण को उन्मुख करें ताकि यह बाद में झूठ बोल रहा हो और इसकी एक आंख (बाएं या दाएं) ऊपर की ओर की ओर बढ़ रही है।
- स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, प्रयोगकर्ता के गैर प्रमुख हाथ में forceps के साथ भ्रूण पकड़, और प्रयोगकर्ता के प्रमुख हाथ के साथ eyebud में कांच micropipette की नोक परिचय ( अधर या पृष्ठीय पक्ष से, के आधे पर निर्भर करता है भ्रूण जो वर्तमान में इंजेक्ट किया जा रहा है, केवल बाह्य त्वचा के नीचे (चित्र 2)। डीएनए/DOTAP समाधान के 70 डिग्री 210 nL के बीच इंजेक्शन। यह कई दालों में किया जा सकता है, पल्स इंजेक्टर के आकार के आधार पर करने के लिए सेट किया गया है (आमतौर पर 70 nL).
नोट: इंजेक्शन की गहराई ऑप्टिक न्यूरॉन्स में lipofection के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. यदि माइक्रोकैपिलरी की नोक की स्थिति सही ढंग से आंखों में बहुत सतही रूप से डाली जाती है, तो माइक्रोइंजेक्शन के बाद, ग्रे एपिडर्माइस आंखों के ऊपर से बढ़ जाएगी। यदि स्थिति बहुत गहरी है, ग्रे eyebud किसी भी परिवर्तन नहीं दिखाएगा, और ऑप्टिक न्यूरॉन्स में डीएनए की अभिव्यक्ति की आवृत्ति कम हो जाएगा. - भ्रूण को चारों ओर मोड़ें और भ्रूण के प्रतिपक्ष पर नेत्रबुद्ध में एक ही सूक्ष्म इंजेक्शन का प्रदर्शन करें।
- प्रत्येक प्रयोग में 6 डिग्री 10 (या अधिक) भ्रूणों की दोनों आंखें इंजेक्ट करें।
- माइक्रोइंजेक्शनके बाद, घाव भरने की सुविधा के लिए लगभग 30 मिनट के लिए 1x एमएमआर के साथ एक पेट्री डिश में भ्रूण की दुकान करें।
- 30 मिनट के बाद, बिना रंग के कम करने के लिए 0.001% विरंजन एजेंट (फेनिलथियोकार्बेमाइड) के साथ 0.1x एमएमआर समाधान में इंजेक्शन भ्रूण को स्थानांतरित करें। लगभग पांच दिनों के लिए कवर भ्रूण संस्कृति, जब तक भ्रूण चरणों में टैडपोल में विकसित किया गया है 46-4716.
चित्र 2: माइक्रोइंजेक्शन के लिए आईबुड क्षेत्र का सीमांकन। 22/23 के विकास चरणों में एक्स लेविस भ्रूण के योजनाबद्ध (ए) और फोटोमाइक्रोग्राफ (बी) में आईबुड क्षेत्र दिखाया गया है जिसे माइक्रोइंजेक्शन (लाल प्रकाश) के लिए लक्षित किया जाना चाहिए। स्केल बार ] 1 मिमी पैनल ए को ज़हान एट अल से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
5. GFP की इमेजिंग बरकरार में ऑप्टिक Axonal Arbors व्यक्त, रहने वाले Tadpoles
नोट: जब डीएनए के साथ लिपोफेटेड टैडपोल विकासात्मक चरणों तक पहुंचते हैं, तो वे इमेजिंग के लिए तैयार होते हैं।
- इमेजिंग से पहले, टैडपोल एनेस्थेटाइज़ किया जाना चाहिए। टैडपोल्स को एनेस्थेटाइज करने के लिए, 10 मिमी पेट्री डिश में डीएच2ओ में 0.02% ट्राइकेन समाधान में लिपोफेक्ट ेडपोल को स्थानांतरित करें। रुको 5 "10 मिनट जब तक tadpoles स्थिर हो जाते हैं. सत्यापित करें कि टैडपोल अभी भी एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत उनकी धड़कन दिल देख कर जीवित हैं।
- एक एनेस्थेटाइज्ड टैडपोल को एक ग्लास स्लाइड पर एक कस्टम-निर्मित सिलिकॉन चैम्बर में रखें और कवरस्लिप के साथ सील करें। टैडपोल को थोड़ा झुकाना चाहिए ताकि उसके सिर का एक पक्ष (बाएं या दाएं) ऊपर की ओर कोण हो और कवर स्लिप को मुश्किल से छू जाए।
- टैडपोल के पृष्ठीय टेक्टल मिडब्रेन का आधा भाग स्क्रीन करें जो कि ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोज़ को व्यक्त करने वाले जीएफपी के लिए कम आवर्धन पर ऊपर की ओर झुका हुआ है।
नोट: एक व्यापक ईमानदार सूक्ष्मदर्शी एक epilfuorscence रोशनी और एक apochromatic उद्देश्य लेंस (सामग्री की तालिका)के साथ सुसज्जित फ्लोरोसेंट arbors के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. - यदि tectal गोलार्द्ध ऑप्टिक axonal arbors व्यक्त एक से तीन GFP के बीच होता है, एक उच्च विपरीत 40x हवा लंबी काम दूरी उद्देश्य का उपयोग कर इन arbors के चित्रों की एक z श्रृंखला पर कब्जा (सामग्री की तालिका). प्रत्येक axonal arbor के लिए, 1.5 डिग्री मी अंतराल पर 10 डिग्री 20 z-श्रृंखला स्लाइस पर कब्जा।
- टेकटल मिडब्रेन के दूसरी ओर एक्सॉन आर्बोकोंस को देखने के लिए, सिलिकॉन चैम्बर में टैडपोल को पुनः लोड करें ताकि यह दूसरी तरफ झुक जाए और कवर स्लिप के साथ सील कर सके। फिर चरण 5.3 और 5.4 दोहराएँ.
6. Optic Axonal Arbor Morphology का पुनर्निर्माण और परिमाणीकरण
- ऑप्टिक axonal arbors व्यक्त एक से तीन GFP के बीच होता है कि एक छवि स्टैक का चयन करें.
- प्रत्येक z-slice में दिखाई प्रत्येक ऑप्टिक axonal arbor के हिस्से का पता लगाने के लिए ग्राफिक संपादन सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका)में मुक्तहस्त ड्राइंग उपकरण का उपयोग करें। प्रत्येक z-स्लीव में स्पष्ट प्रत्येक वृक्ष के टुकड़ों के माध्यम से अनुरेखण वृक्ष का एक सटीक 2D प्रक्षेपण पैदा करेगा। विभिन्न रंगों ऑप्टिक axonal arbors व्यक्त अलग GFP का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- जब7की जरूरत होती है, तो छवियों की मूल z-श्रृंखला के संदर्भ में, axonal arbors के 2 डी पुनर्निर्माण पर सभी morphometric माप बनाओ। छवि जे सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) काउपयोग करना, इस तरह की शाखाओं की संख्या (यानी, शाखा युक्तियाँ या शाखा अंक की संख्या), कुल वृक्ष शाखा लंबाई, शाखा प्रति लंबाई, लंबाई और arbor की चौड़ाई, वृक्ष के समग्र आकार के रूप में morphological मापदंडों को मापने (L/ अनुपात, परिपत्र), और शाखाओं के कोण7.
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Representative Results
इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल एक से दस ऑप्टिक axonal arbors में GFP (अलोन या एक अतिरिक्त डीएनए निर्माण के साथ) व्यक्त इंजेक्शन Xenopus भ्रूण के 30 डिग्री 60% की सफलता दर पैदावार. चित्रा 3 में, हम GFP के प्रतिनिधि confocal छवियों को हमारे हाल ही में प्रकाशित अध्ययन से बरकरार Xenopus tadpoles में नियंत्रण और उत्परिवर्ती ऑप्टिक axonal arbors व्यक्तदिखाते हैं 7. इस अध्ययन के लिए, हम PCS2 प्लाज्मिड में APC (APCNTERM और APC]-cat) के दो डोमेन म्यूटेंट क्लोन, और सह एक pCS2-GFP लेबलिंग प्लाज्मिड के साथ एक साथ एक दिन पुराने Xenopus भ्रूण की eyebuds में इन प्लाज्मिड इंजेक्शन. चित्रा 4 कई मात्रात्मक माप हम नियंत्रण और APC उत्परिवर्ती axonal arbors के पुनर्निर्माण पर किए गए परिणामसे पता चलता है, शाखाओं की संख्या सहित, कुल arbor शाखा लंबाई, और शाखाओं का मतलब लंबाई.
चित्रा 3: नियंत्रण और उत्परिवर्ती ऑप्टिक axonal arbors व्यक्त GFP के प्रतिनिधि छवियों. (A) एपीसी एन-टर्मिनल और केंद्रीय डोमेन म्यूटेंट के म्यूटेंट की योजना है जो pCS2 प्लाज्मिड में क्लोन किए गए थे। (बी)एकल GFP और GFP-APC उत्परिवर्ती ऑप्टिक axonal arbors के प्रतिनिधि confocal छवियों बरकरार के tecta में, रहने वाले Xenopus tadpoles. (ग)जीएफपी नियंत्रण और एपीसी उत्परिवर्ती ऑप्टिक ऐक्सोनल arbors के z-श्रृंखला छवियों के पुनर्निर्माण। स्केल बार्स ] 30 डिग्री मी (बी), 40 डिग्री मी (सी)। यह आंकड़ा जिन एट अल से संशोधित किया गया है7. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: नियंत्रण और उत्परिवर्ती अक्षीय arbors के पुनर्निर्माण के morphologies की मात्रा. शाखाओं की संख्या के प्लॉट (क), कुल वृक्ष शाखा लंबाई (बी) और माध्य शाखा लंबाई (सी) नियंत्रण और एपीसी उत्परिवर्ती के बीच पाए गए अंतरों की पुष्टि करते हैं जो अक्षीय वृक्षों को व्यक्त करते हैं। पैनलों में डेटा एजेडसी को SEM के साथ नियंत्रण के प्रतिशत के रूप में दिखाया गया है. *ऊपर डेटा पट्टी या रेखा p.lt; 0.05 को इंगित करता है. प्रतिगमन रेखाओं के साथ शाखाओं की संख्या बनाम माध्य शाखा लंबाई के अतिरिक्त स्कैटर प्लाट ों की संख्या ऑप्टिक एक्सोनल आर्बोज़ में इन पैरामीटरों के बीच व्युत्क्रम सहसंबंध दिखाते हैं, जो एपीसी डोमेन(डी, ई)व्यक्त करते हैं। नमूना संख्या: (एक) GFP-12, APCNTERM-18 APC$-cat-25; (बी) GFP-12, APCNTERM-16, एपीसीजेड-कैट-25; (सी) GFP-11, APCNTERM-16, एपीसीजेड-कैट-25. यह आंकड़ा जिन एट अल से संशोधित किया गया है7. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस लेख में, हम प्रदर्शित कैसे exogenous डीएनए ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एकल या छोटी संख्या में constructs व्यक्त करने के लिए और कैसे छवि के लिए व्यक्तिगत GFP ऑप्टिक axonal arbors बरकरार में सामान्य और बदल आणविक संकेतन के साथ व्यक्त करने के लिए, मेंढक एक्स के रहने वाले tadpoles . लेविस| हम यह भी समझा कैसे पुनर्निर्माण और जीएफपी की आकृति विज्ञान की मात्रा निर्धारित करने के लिए vivo में कब्जा कर लिया छवियों से ऑप्टिक axonal arbors व्यक्त. ऑप्टिक न्यूरॉन्स की छोटी संख्या में exogenous डीएनए प्लाज्मिड व्यक्त करने के लिए, हम एक दिन पुराने Xenopus भ्रूण की eyebud प्राइमोर्डिया में एक डीएनए / lipofection अभिकर्मक मिश्रण microinect, एक तकनीक का उपयोग कर पहले ऑप्टिक अध्ययन करने के लिए क्रिस्टीन होल्ट की प्रयोगशाला में विकसित युवा टैडपोल्स9,10,19,20,21में एक्सॉन पथखोज . हम और अन्य लोगों ने भी इस डीएनए माइक्रोइंजेक्शन/लिपोफेक्शन तकनीक को आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू किया है जो पुराने बरकरार में ऑप्टिक एक्सॉन वृक्षीकरण को विनियमित करता है, जीवित एक्स लेविस टैडपोल5,6, 7 , 8.क्षणिक के लिए यह सस्ती, सरल प्रक्रिया, सेल विशिष्ट transgenesis एक जीवित कशेरुकी मॉडल प्रणाली में ऑप्टिक axonal arbors के विकास में सेल स्वायत्त जीन समारोह के निर्धारण की अनुमति देता है.
Xenopus भ्रूण की eyebuds में डीएनए / DOTAP microinectinctined जब सर्वोत्तम प्रथाओं के लिए विचार करने के लिए कई महत्वपूर्ण कारक हैं. सबसे पहले, जैसा कि अन्य रिपोर्टों में उल्लेख किया गया है, डीएनए सांद्रता 1 ग्राम/एल9,10से अधिक होनी चाहिए। 1$3 g/$L के बीच डीएनए सांद्रता सबसे अच्छी होती है, लेकिन डीएनए सांद्रता 0ण्7 ग्राम/जेडएल के रूप में कम होती है। दूसरा, चरण 22-24 Xenopus भ्रूण में सूक्ष्म इंजेक्शन डीएनए प्रयोगों के लिए इष्टतम है जिसमें लक्ष्य ऑप्टिक axonal arborization को विनियमित तंत्र की जांच करने के लिए है. इन विकासात्मक अवस्थाओं में भ्रूणों में नेत्री रूपात्मक रूप से विभेदित होती हैं और इन्हें इंजेक्शन 14 के लिए आसानी से लक्षित किया जा सकताहै। चरण 22 डिग्री 24 भ्रूण के eyebud प्राइमोर्डिया में अधिकांश ऑप्टिक न्यूरॉन्स भी पोस्ट-माइटोटिक हैं, जो जीएफपी व्यक्त ऑप्टिक न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या में परिणाम है, जो बदले में बेहतर संकल्प के लिए अनुमति देता है जब टैडपोल्स में व्यक्तिगत GFP ऑप्टिक axonal arbors इमेजिंग. अंत में, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि exogenous जीन lipofection9के बाद 8 एच व्यक्त कर रहे हैं. इसलिए, चरण 22-24 भ्रूणों के नेत्रों में जीन निर्माणों को व्यक्त करने का अर्थ है कि जीन न तो ऑप्टिक न्यूरॉन्स के कोशिका भाग्य चयन और न ही उनके एक्सॉन की प्रारंभिक वृद्धि को परेशान करेगा। एक तीसरा पहलू जो एक्सनोपस भ्रूण नेत्रों में डीएनए को माइक्रोइन्क करने पर सफलता सुनिश्चित करेगा , यह है कि डीएनए को नेत्रबुद्धी 9,10के अपेक्षाकृत सतही क्षेत्र में इंजेक्ट किया जाना चाहिए . नेत्रक में या उसके आस - पास अधिक गहरे ऊतकों में प्रवेश करने से भ्रूणों का प्रतिशत कम हो जाता है जिनमें बाह्य वंश के डीएनए10को व्यक्त करने वाले ऑप्टिक न्यूरॉनहोते होते हैं .
वहाँ भी कर रहे हैं कई मुद्दों के बारे में पता होना जब इमेजिंग और GFP बरकरार में ऑप्टिक axonal arbors व्यक्त पुनर्निर्माण, Xenopus tadpoles रहरहे हैं. सबसे पहले, शोधकर्ताओं को केवल tectal गोलार्द्धों कि ऑप्टिक axonal arbors व्यक्त करने के लिए एक से तीन GFP के बीच होते हैं की छवियों पर कब्जा करना चाहिए. यदि एक छवि ऑप्टिक axonal arbors व्यक्त तीन से अधिक GFP शामिल हैं, arbors ओवरलैपिंग शाखाओं है, जो यह मुश्किल पुनर्निर्माण की प्रक्रिया के दौरान व्यक्तिगत arbors को परिभाषित करने के लिए कर देगा की संभावना है. एक और मुद्दा के बारे में पता होना है कि पुनर्निर्माण और ऑप्टिक axonal arbor आकृति विज्ञान के परिमाणीकरण इस प्रोटोकॉल में सबसे अधिक समय लेने वाली कदम हैं. हम अनुमान लगाते हैं कि प्रयोग के कुल समय के लगभग 80-90% की आवश्यकता होती है, जिसका पुनर्निर्माण और परिमाणीकरण ऑप्टिक ऐक्सोनल आर्बो आकारिकी की आवश्यकता होती है। हालांकि तकनीक tectal न्यूरॉन डेन्ड्रिटिक arbors के पुनर्निर्माण को स्वचालित करने के लिए विकसित किया गया है, इन गणना विधियों अभी तक ऑप्टिक axonal arbors के रूप में अच्छी तरह से22के लिए लागू नहीं किया गया है. हालांकि परिश्रमी, ऑप्टिक वृक्ष आकृति विज्ञान के पुनर्निर्माण की प्रक्रिया नाटकीय रूप से ऑप्टिक axonal arbor आकृति विज्ञान के विवरण के शोधकर्ताओं की समझ बढ़ जाती है. यह जोड़ा विस्तार, बारी में, काफी GFP व्यक्त arbors इन शोधकर्ताओं के भविष्य के प्रयोगों में कब्जा करने में सक्षम हैं की छवियों की गुणवत्ता में सुधार.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम अपने अनुसंधान का समर्थन करने के लिए Touro विश्वविद्यालय कैलिफोर्निया कॉलेज Osteopathic चिकित्सा के लिए धन्यवाद. हम प्रयोगशाला में पिछले छात्रों को स्वीकार करते हैं (एस्तेर वू, ग्रेगरी पेंग, Taegun जिन, जॉन लिम) जो हमारी प्रयोगशाला में इस microinctions तकनीक को लागू करने में मदद की. हम डॉ क्रिस्टीन होल्ट के आभारी हैं, जिनकी प्रयोगशाला में Xenopus भ्रूण में इस डीएनए microinction /
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
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