Summary
이 프로토콜은 DNA/DOTAP 혼합물을 1일 된 제노푸스 라에비스 배아의 안구에 미세 주입하는 방법과 지각 중뇌에서 광학 축색 아버를 발현하는 개별 녹색 형광 단백질(GFP)을 이미지화하고 재구성하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이.
Abstract
수생 개구리 제노푸스 laevis의 올챙이의 주요 시각적 투영은 신경 연결의 발달을 통제하는 기계장치를 공부하기위한 훌륭한 모델 시스템 역할을합니다. 레티노-tectal 투영의 설치 도중, 광학 축색은 눈에서 확장하고 그들의 표적 조직, 광학 tectum에 도달하기 위하여 두뇌의 별개의 지구를 통해서 탐색합니다. 일단 광학 축새가 tectum에 들어가면, 그(것)들은 tectum에 있는 표적 interneurons로 만들 수 있는 시냅스 연결의 수를 증가하기 위하여 기능하는 말단 아버를 정교하게 합니다. 여기서, 우리는 제노푸스 배아에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 DNA를 발현하는 방법, 및 이득-기능 상실 유전자 구성, 광뉴런(망막 신경절 세포)을 발현하는 방법을 설명한다. 우리는 외인성 유전자가 광학 뉴런의 단 하나 또는 작은 수에서 표현되는 그래야 1 일 오래된 태아의 안구에 결합된 DNA/lipofection 시약을 마이크로 주입하는 방법을 설명합니다. GFP와 유전자를 태그하거나 GFP 플라스미드와 공동 주입함으로써, 변형 된 분자 신호를 가진 개별 광학 뉴런의 말단 축삭 아버는 며칠 후 살아있는 제노푸스 올챙이, 그리고 그들의 형태에 따라 그대로 뇌에서 직접 이미지화 될 수 있습니다. 정량화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 광학 축색 아버라이드의 개발을 뒷받침하는 세포 자율 분자 메커니즘의 결정을 가능하게 합니다.
Introduction
신경계의 발달 도중, 시냅스 전 신경의 축세포는 그들의 표적 지역에 도달하기 위하여 두뇌의 다양한 지구를 통해서 탐색합니다. 축 삭 그들의 대상 조직을 침공 하는 때, 그들은 synaptic 대상 뉴런시 연결을 설정. 뉴런의 많은 모형에서, 축세포는 말단 가지 또는 아버1의정교하게 네트워크를 정교하게 하여 만들 수 있는 시냅스 연결의 수 그리고 공간 넓이 증가합니다. 수생 개구리 제노푸스 laevis의 올챙이의 레티노 tectal 투영은 말단 축삭 수목화 및 시냅스 연결성2,3,4의 근본적인 메커니즘을 검사하기위한 강력한 척추 동물 모델입니다. . 정상 및 변경된 분자 신호로 광학 축색 아버를 발현하는 개별 GFP는 그대로 관찰할 수 있으며, 살아있는 제노푸스 올챙이5,6,7,8. GFP를 단독으로 또는 소수의 광학 뉴런에서 전체 길이 또는 잘린 유전자 버전과 함께 표현하기 위해, 우리는 1 일 오래 된 제노푸스 배아의 안구에 DNA의 미세 주입 / 지질 을 포함하는 기술을 사용합니다9, 10. 이 기술은 원래 젊은 제노푸스 올챙이에서 광학 축색 경로 발견의 메커니즘을 연구하기 위해 개발되었으며, 이후 광학 축작의 기본 세포 자율 분자 메커니즘을 결정하기 위해 우리와 다른 사람에 의해 적용되었습니다 제노푸스 올챙이5,6 ,7,8,9,10의수료화 .
소수의 광학 뉴런에서 외인성 유전자를 발현하는 대체 기술은 X. laevis뿐만아니라 다른 모델 종에서도 개발되었다. 그러나, 이 접근의 각각은 제노푸스 태아의 안구부에서 DNA/lipofection 시약의 미세 주입과 비교될 때 도전과 한계를 제시합니다. 마우스에서, 트랜스제네시스는 소수의 광학 뉴런에서 유전자를 발현하는데 사용될 수 있지만, 형질전환 마우스의 생성은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리고 형질전환 마우스는 종종 바람직하지 않은부작용(11)으로존재한다. 광학 뉴런에서 외인성 유전자를 발현하는 형질전환 제브라피쉬는 또한 초기 절단 단계배아(12)에플라스미드를 주입함으로써 생성될 수 있다. 그러나, 이러한 과정은 제브라피쉬유충(12)에서광학 뉴런에서 모자이크 패턴으로 유전자를 발현하기 위해 특정 프로모터의 복제를 요구한다. 형질전환 제브라피시의 광학 뉴런에서 외인성 DNA의 발현 빈도도 다소 낮습니다(<30%). DNA/리포좀 시약(30−60%)으로 미세주입된 제노푸스 올챙이와비교하면 12. 오보에서 전기천공은 또한 병아리13에서소수의 광학 뉴런에서 유전자를 발현하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이 절차는 광학 축사 arborization가 살아있는 병아리 배아에서 상연될 수 없기 때문에 광학 투영을 설치하는 기계장치를 완전히 특성화하는 것을 실패했습니다. 마지막으로, 몇몇 실험실은 제노푸스 올챙이14,15에있는 소수의 광학 뉴런으로 유전자를 트랜스펙트하기 위하여 전기천기를 이용했습니다. 그러나 전기포공은 제노푸스 배아의 안구에 DNA/지방 흡입 시약을 미세 주입하는 데 사용되는 것 이상으로 장비 및 프로토콜(자극기, 전극, 공간 및 시간적 파펄스 패턴)의 최적화가 필요합니다.
우리와 다른 사람들은 이전에 광학 축세포 arborization5,6을설치하는 세포 자율 신호 메커니즘을 결정하기 위해 제노푸스 배아의 안구에 DNA의 미세 주입 / lipofection의 기술을사용했습니다. 7명 , 8. 우리는 처음에 제노푸스 올챙이5,6에서광학 축색 아버화에서 Cadherin 및 Wnt 어댑터 단백질 β-카테닌의 기능을 해부하기 위해이 방법을사용했다. 한 연구에서는, β-카테닌이 α-카테닌 및 PDZ에 결합하는 것을 각각 생체 내에서 광학 축삭 아버를 시작하고 형성하기 위해 필요하다는 것을 보여주었다5. 제2 보고에서, 우리는 α-카테닌 및 GSK-3β에 대한 β-카테닌 결합 도메인이 복부 광학 축삭 아버의 투영 패턴을 반대로 조절한다는 것을입증했다 6. 최근에는 제노푸스 올챙이7에서광학 축색 아버의 형태학적 특징을 조절하는 Wnt 요인, 선종성 poliposis coli (APC)에 대한 역할을 확인했습니다. 개별 광학 뉴런에서 GFP와 함께 β-카테닌 안정성 및 미세소관 조직을 조절하는 APC의 N-말단 및 중앙 도메인을 공동 표현함으로써, 우리는 분기 번호에서 이러한 APC 상호 작용 도메인에 대한 공유및 뚜렷한 역할을 결정했습니다. 길이, 및 생체 내 축축아의 각도7. 또 다른 실험실은 제노푸스 올챙이8의광학 축색 아버에서 BDNF 수용체, TrkB에 의한 신호에 대한 세포 자율적 역할을 결정하기 위해 미세 주입/지질 주입 기술을 사용했다. 이 그룹은 생체 내 개별 광학 축아에서 지배적 인 음의 TrkB 교란 분기 및 시냅스 성숙의 발현을 보여주었다8. 전반적으로, 제노푸스의 지질 기술은 이미 네이티브 환경에서 광학 축색 분지에서 다른 유전자의 특정 역할을 조명했다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 투로 대학 캘리포니아의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 # TUCA003TE01X).
1. X. 래비스 배아 획득
- 인간 융모성 생식샘 자극호르몬(HCG)으로 프라이밍된 수컷 과 암컷 성개구리 쌍의 자연적인 짝짓기로 X. laevis 배아를 얻거나, HCG로 프라이밍된 여성 성인 개구리에서 흘린 난자의 체외 수정에 의해, 또는 직접 주문함으로써(표의 표 재료)를참조하십시오.
-
실온에서 2% 시스테인 용액으로 수득된 데젤리 배아(표 오브 머티리얼)16.
- 큰 페트리 접시에 50-100 개의 배아를 수집합니다. 플라스틱 이송 파이펫을 디캔팅하거나 사용하여 배아가 들어있는 용액을 제거합니다. 2% 시스테인 용액 의 25 mL를 추가 (0.5 g 시스테인 25 mL ddH2O, pH 8.0) 배아를 포함하는 접시에.
- 배아의 젤리 코트가 떨어지고 배아가 접시의 중앙에 덩어리로 수집 될 때까지 시스테인 용액에 배아를 포함하는 페트리 접시를 부드럽게 소용돌이 (5-10 분). 이 시점에서 시스테인 용액을 천천히 부드럽게 폐기물 비커에 붓습니다. 시스테인 용액과 함께 폐기물 비커에 너무 많은 배아를 부어 하지 않도록주의하십시오.
- 페트리 접시에 배아를 10% 수정된 마크링거 용액(MMR) 또는 기타 적합한 용액(예: 수정된 Barth의 용액, MBS)으로 헹구고, 용액을 교체할 때마다 접시를 소용돌이치십시오.
- 배아를 10% MMR에서 배양하여 발달 단계에 도달할 때까지 22−2417. 제노푸스 배아는 15-25°C 사이의 온도에서 배양할 수 있습니다. 배아의 발달 속도는17에서배양되는 온도에 달려 있습니다.
참고: 카탈로그에서 주문한 제노푸스 배아는 보통 발달 단계 20-24에 실험실에 도착하기 때문에 즉시 dejellied 및 microinjected 될 수 있습니다.
2. DNA 플라스미드 를 준비하고 DNA / DOTAP 혼합물만들기
- 서브클론 DNA 발현은 제노푸스 발현 벡터 pCS2+ 또는 pCS2+MT 또는 이의 유도체(원래 D. 터너 및 R. Rupp에 의해 구성)5,6,7. pCS2+ 벡터는 개구리에서 유전자 발현을 용이하게 하는 변형된 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 함유하고 있다.
- 표준 절차에 따라 GFP 및/또는 관심 유전자를 포함하는 pCS2 플라스미드를 미니프렙키트(재료 표)로증폭합니다. 미니프렙 프로토콜의 최종 용출 단계에서, DNA를 ddH2O로 순차적으로 용출하여 >1 μg/μL의 최종 농도를 산출한다.
- 모든 pCS2 플라스미드를 -80°C에서 미세 주입/지방 흡입 실험을 수행할 준비가 될 때까지, 즉 배아가 발달 단계에 있을 때 22-24로 저장합니다.
- DNA 플라스미드를 해동하여 실온에서 리포에감염된다. 지방 흡입 직전에, 잠시 원심 분리기 DNA 플라스미드. 이것은 미세 모세관 파이펫의 끝을 막을 수있는 DNA / DOTAP 혼합물에서 침전물이 형성되는 것을 방지할 것입니다.
- DNA 플라스미드를 DOTAP 리포좀 형벌시약(재료표)과1:3(w/v) 비율로결합하여 9,10. 예를 들어, DNA 2 μg를 1.5 mL 마이크로원지 지 튜브로 옮기고 DOTAP 6 μL을 추가하거나, 미세 원심 분리튜브에 3 μg의 DNA를 전달하고 9 μL의 DOTAP를 추가합니다.
- DNA와 DOTAP가 결합되면 미세 원심 분리튜브를 부드럽게 쓸어 넘기면 용액을 혼합합니다. DNA/DOTAP 용액은 혼합 후 약간 불투명해져야 합니다.
- 두 플라스미드가 함께 리포에 감염되는 경우(예를 들어, 두 개의 pCS2-GFP와 유전자의 잘린 또는 전체 길이 버전을 포함하는 두 번째 pCS2 플라스미드)가 광학 뉴런에서 먼저 두 플라스미드를 결합한 후(둘 다 원심분리한 후) 1:1 비율로 추가합니다. 1:3(v)의 비율로 DOTAP. 예를 들어, 1 μg의 pCS2-GFP를 두 번째 pCS2 플라스미드의 1 μg와 결합한 다음 DOTAP 6 μL을 추가합니다.
참고: 연구 결과에 따르면 이러한 발달 단계에서 제노푸스 배아의 안구에 두 플라스미드를 입술을 삽입하면 개별 광학 뉴런9,10에서공동 발현이 발생할 수 있습니다.
3. DNA/DOTAP로 미세 주사 바늘로 적재
- 당겨진 유리 미세 모세관 파이펫의 끝을 미세한집게(재료 표)로부드럽게 잘라냅니다.
- 마이크로필을 사용하여 유리 미세 모세관 파이펫을 미네랄 오일로 채우면 미세 파이펫의 잘린 끝에 미네랄 오일이 조금 떨어집니다. 미세 모세관 파이펫을 미네랄 오일로 반쯤 채웁니다.
- 이제 미네랄 오일로 채워진 당겨진 유리 미세 모세관 파이펫을 인젝터에 연결된 적절한 사출 홀더에 적재하십시오. 인젝터(재료표)를사용하는 경우 미세 모세관 파이펫을 로드하기 전에 플런저를 반쯤 배출합니다. 미세 모세관 파이펫이 인젝터에 단단히 부착되면 플런저를 최대한 확장하여 미세 모세관 파이펫이 인젝터에 강하게 부착되고 플런저의 확장과 함께 움직이지 않는지 확인합니다.
- DNA/DOTAP 혼합물의 3 μL 드롭을 파라핀 종이의 절단 사각형(1인치 정사각형) 시트에 옮니다.
- 스테레오 해부 현미경아래에서 유리 미세 모세관 파이펫의 끝을 DNA/DOTAP 드롭으로 옮습니다.
- 주사 장치의 채우기 옵션을 사용하여 DNA/DOTAP 드롭을 유리 미세 모세관 파이펫으로 천천히 빨아들입니다. 액체가 미세 모세관 파이펫에 적재되면 낙하가 작아집니다. DNA/DOTAP 용액의 약간의 불투명성으로 인해 미네랄 오일과 DNA/DOTAP 용액 사이의 경계가 유리 미세 모세관 파이펫에서 표시되어야합니다(그림 1). 필요한 경우 유리 미세 모세관 파이펫의 압력이 재보정될 수 있도록 주기적으로 미세 모세관 파이펫을 채우지 십시오.
그림 1: 미세 모세관 파이펫 이미지. 이미지는 주사 장치, 전(A)및 후(B)DNA /DOTAP로 채우는 미세 모세관 파이펫을 보여줍니다. 마이크로 모세관 파이펫(A,B)에서화살표, 플런저 끝을 엽니다. 닫힌 화살표, 미네랄 오일과 DNA / DOTAP 사이의 선은 채워진 미세 모세관 파이펫(B). 배율 표시줄 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 1 일 오래 된 제노푸스 배아의 눈부아에 마이크로 주입 DNA / DOTAP
- 0.1x MMR로 채워진 10mm 페트리 접시에 미세 한 집게로 10 단계 20-24 제노푸스 배아를 수동으로 devitellinize. 배아를 다치게하지 않도록 허리의 비텔린 봉투를 잡습니다. 실험자의 왼손과 오른손에 집게를 두면 비텔린 봉투의 거품을 터뜨리고 비텔린 봉투에서 배아를 풀어냅니다. 비텔린 봉투를 제거할 때 배아를 손상시키지 않도록 주의하십시오.
참고: 단계 20에서 시작, 제노푸스 배아는 배아의 전방과 후방 반쪽 사이 들여쓰기 또는 '허리'를 개발합니다. 이 허리는 이 위치에서 비텔린 봉투와 배아 사이에 간격을 형성할 수 있습니다. - 절단 팁이 있는 플라스틱 전사 파이펫을 사용하여 5-10 탈막 단계 22-24 배아를 1x MMR로 채워진 10mm 페트리 접시로 옮김을 옮김을 사용하십시오.
참고: 1x MMR의 높은 소금 용액은 미세 주사로 인한 펑크 상처의 치유를 용이하게합니다. - 입체 현미경에서, 각 손에 집게와 페트리 접시에 편차 배아 중 하나를 잡고, 그 전방 기둥이 시야에서 가리키도록 배아를 배열. 배아가 측면으로 누워 있고 눈부드 중 하나(왼쪽 또는 오른쪽)가 위쪽을 향하게 되도록 배아를 배아의 방향을 조정합니다.
- 입체 현미경의 밑에, 실험자의 비 지배적인 손에 있는 집게로 배아를 잡고, 실험자의 지배적인 손으로 유리 마이크로파이펫의 끝을 안구부로 소개합니다 (복부 또는 등쪽 측에서, 반에 따라 현재 주입되고 있는 배아, 표피 바로아래(그림 2). DNA/DOTAP 용액의 70-210 nL 사이에 주입하십시오. 이것은 인젝터가 설정된 펄스의 크기에 따라 여러 펄스에서 수행 될 수있다 (일반적으로 70 nL).
참고: 주사의 깊이는 광학 뉴런으로의 지방 흡입에 매우 중요합니다. 미세 모세관의 끝의 위치가 눈부아에 매우 표면적으로 정확하게 삽입되면 미세 주입을 따라 눈부신을 덮는 회색 표피가 부풀어 오게됩니다. 위치가 너무 깊으면 회색 안구부가 아무런 변화도 보이지 않으며 광학 뉴런에서 DNA 발현 빈도가 낮아집니다. - 배아를 돌리고 배아의 반대쪽에 있는 안구에 동일한 미세 주사를 수행합니다.
- 각 실험에서 6-10(또는 그 이상) 배아의 두 아이버드를 주입합니다.
- 미세 주사 후, 상처 치유를 촉진하기 위해 약 30 분 동안 1 x MMR로 페트리 접시에 배아를 저장합니다.
- 30 분 후, 주입 된 배아를 0.1 x MMR 용액으로 0.001 % 표백제 (페닐티오카르바미드)로 옮겨 색소 침착을 감소시다. 배아를 배양하는 배아는 46-4716단계에서올챙이로 발전할 때까지 약 5일 동안 덮여 있었다.
그림 2: 미세 주입을 위한 안구 부 영역의 경계. 22/23 단계에서 X. laevis 배아의회로도(A)및 광현미경(B)은 미세 주사(빨간 하이라이트)를 대상으로 해야 하는 안구부 영역을 나타낸다. 배율 막대 = 1 mm. 패널 A는 Zahn 외18에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. GFP 표현 광학 축색 아버의 이미징 그대로, 살아있는 올챙이
참고: DNA에 감염된 올챙이가 발달 단계에 도달하면 46-47, 그들은 이미징을 위한 준비가 되어 있습니다.
- 이미징 전에 올챙이를 마취시켜야 합니다. 올챙이를 마취시키기 위해, 10 mm 페트리 접시에 ddH2O에서 0.02 % 트리카인 용액으로 리포감염된 올챙이를 옮김. 올챙이가 움직이지 않게 될 때까지 5-10 분 기다립니다. 스테레오 해부 현미경으로 자신의 박동 심장을 관찰하여 올챙이가 여전히 살아 있는지 확인합니다.
- 마취된 올챙이 한 개를 유리 슬라이드에 맞춤형 실리콘 챔버에 넣고 커버슬립으로 밀봉합니다. 올챙이는 머리의 한쪽(왼쪽 또는 오른쪽)이 위쪽으로 기울어져 커버 슬립을 거의 닿지 않도록 약간 기울여야 합니다.
- 광학 축색 아버를 표현하는 GFP를 위해 낮은 배율로 위쪽으로 기울어진 올챙이의 등쪽 지각 중뇌의 절반을 스크리닝합니다.
참고: 에필푸오레시엔스 조명과 아포크로매틱 대물렌즈(표)가 장착된 넓은 직립 현미경을 사용하여 형광 수목상을 가릴 수 있습니다. - 지각반구가 광학 축색 아버를 표현하는 1~3개의 GFP 를 포함하는 경우, 고대비 40x 공기 장거리목표(재료 표)를사용하여 이러한 아버의 z 시리즈 이미지를 캡처합니다. 각 축색 아버에 대해 1.5 μm 간격으로 10-20 z 시리즈 슬라이스를 캡처합니다.
- 텍탈 중뇌의 반대편에 있는 축산 아버를 보려면 실리콘 챔버의 올챙이를 다시 로드하여 다른 쪽으로 기울어지고 커버 슬립으로 밀봉합니다. 그런 다음 5.3 단계와 5.4단계를 반복합니다.
6. 광학 축색 아목 형태의 재건 및 정량화
- 광학 축색 아버를 표현하는 1~3개의 GFP가 포함된 이미지 스택을 선택합니다.
- 그래픽 편집 소프트웨어(재료 표)에서자유형 그리기 도구를 사용하여 각 z 슬라이스에 표시되는 각 광학 축축한 아버의 부분을 추적하십시오. 각 z 슬라이스에서 각 아버의 조각을 추적하면 아버의 정확한 2D 프로젝션이 생성됩니다. 다른 색상은 광학 축색 아버를 표현하는 별개의 GFP를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.
- 필요한 경우 이미지의 원래 z 시리즈를 참조하여 축축한 아버의 2D 재구성에 대한 모든 형태 측정을합니다 7. 이미지 J 소프트웨어(재료 표)를사용하여 분기 수 (예 : 분기 팁 또는 분기 점 수), 총 아버 분기 길이, 분기 당 길이, 아버의 길이 및 너비, 아버의 전체 모양 (L / W)과 같은 형태 학적 매개 변수를 측정합니다. 비율, 원형), 및 분기의 각도7.
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Representative Results
이 문서에 설명된 프로토콜은 GFP를 발현하는 주입된 제노푸스 배아의 30-60%의 성공률을 산출합니다(단독으로 또는 추가 DNA 구성과 함께) 1~10개의 광학 축색아수목. 도 3에서,우리는 우리의 최근 출판 된 연구7에서그대로 제노푸스 올챙이에서 제어 및 돌연변이 광학 축색 아버를 표현하는 GFP의 대표적인 공초점 이미지를 보여줍니다. 이 연구를 위해, 우리는 APC (APCNTERM 및 APCβ-cat)의 두 개의 도메인 돌연변이체를 pCS2 플라스미드로 복제하고, 이 플라스미드를 pCS2-GFP 라벨링 플라스미드와 함께 1일 된 제노푸스 배아의 안구에 공동 주입하였다. 그림 4는 가지 수, 총 아버 분기 길이 및 분기의 평균 길이를 포함하여 대조군 및 APC 돌연변이 축색 아버의 재구성에 대한 몇 가지 정량적 측정 결과를 보여줍니다.
그림 3: 제어 및 돌연변이 광학 축색 아버를 표현하는 GFP의 대표적인 이미지. (a)PCS2 플라스미드로 복제된 APC N-말단 및 중앙 도메인 돌연변이체의 돌연변이체체. (B)단일 GFP 및 GFP-APC 돌연변이 광학 축색 아버의 대표적인 공초점 이미지는 그대로, 살아있는 제노푸스 올챙이의 tecta. (C)GFP 제어 및 APC 돌연변이 광학 축색 아버의 z 시리즈 이미지의 재구성. 배율 막대 = 30 μm (B), 40 μm (C). 이 수치는 Jin et al.7에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 제어 및 돌연변이 축색 아버의 재건의 형태정량화. 플롯의개수(A),총 아버 분기길이(B),및 평균 분기길이(C)는축축아아버를 발현하는 대조군과 APC 돌연변이체 간의 관찰된 차이를 확인한다. 패널 A-C의 데이터는 SEM을 사용하여 제어 평균의 백분율로 표시됩니다. *위 데이터 막대 또는 선은 p < 0.05를 나타냅니다. 회귀선이 있는 분기 길이대 분기 길이의 추가 산란도는 APC도메인(D, E)을표현하는 광학 축축아에서 이러한 매개변수 간의 역상관관계를 표시합니다. 샘플 번호:(A)GFP-12, APCNTERM-18 APCβ-고양이-25; (B)GFP-12, APCNTERM-16, APCβ-고양이-25; (C)GFP-11, APCNTERM-16, APCβ-cat-25. 이 수치는 Jin et al.7에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 기사에서는 단일 또는 소수의 광학 뉴런에서 외인성 DNA 구조를 표현하는 방법과 개구리 X의 살아있는 올챙이에서 정상 적이고 변경 된 분자 신호로 광학 축색 아버를 표현하는 개별 GFP를 이미지화하는 방법을 보여줍니다. . 라에비스. 우리는 또한 생체 내에서 캡처 한 이미지에서 광학 축색 아버를 표현하는 GFP의 형태를 재구성하고 정량화하는 방법에 대해설명합니다. 소수의 광학 뉴런에서 외인성 DNA 플라스미드를 발현하기 위해, 우리는 크리스틴 홀트의 실험실에서 처음 개발된 기술을 사용하여 DNA/지질 검사 시약 혼합물을 1일 된 제노푸스 배아의 아이버드 프리모르디아에 마이크로주사하여 광학을 연구했습니다. 젊은 올챙이9,10,19,20,21에서축산 경로 찾기 . 우리와 다른 사람들은 또한 이 DNA 미세 주입/지질 검사 기술을 적용하여 이전 그대로 광학 축색 아버화를 조절하는 분자 메커니즘을 연구하고 있습니다. 7명 , 8. 과도, 세포 특정 종족에 대한이 저렴하고 간단한 절차는 살아있는 척추 동물 모델 시스템에서 광학 축색 아버를 개발하는 세포 자율 유전자 기능의 결정을 할 수 있습니다.
제노푸스 배아의 안구에 DNA/DOTAP을 마이크로주입할 때 모범 사례를 고려해야 할 몇 가지 중요한 요소가 있습니다. 첫째, 다른 보고서에서 언급했듯이, DNA 농도는 1 μg/μL9,10보다커야 한다. 1-3 μg/μL 사이의 DNA 농도가 가장 좋지만 0.7 μg/μL의 낮은 DNA 농도도 사용할 수 있습니다. 둘째, 단계 22-24 제노푸스 배아로 DNA를 미세 주입하는 것은 광학 축색 아보레이드를 조절하는 메커니즘을 검사하는 것이 목표인 실험에 최적입니다. 이러한 발달 단계에서 배아에서, 안구붓은 형태학적으로 분화되고 주사14를더 쉽게 표적으로 할 수 있다. 단계 22-24 배아의 안부 원시에 있는 대부분의 광학 신경은 또한 GFP를 표현하는 더 적은 수의 광학 뉴런을 초래하는 포스트 유사분열이며, 이는 올챙이에서 개별 GFP 광학 축색 아버를 이미징할 때 더 나은 해상도를 가능하게 합니다. 마지막으로, 이전 연구는 외인성 유전자가 지방 분비 후 ~ 8 시간 발현되는 것으로 나타났습니다9. 그러므로, 단계 22-24 배아의 안구부에서 유전자 구성을 표현하는 것은 유전자가 광학 신경의 세포 운명 선택도 그들의 축색의 초기 파생도 교란하지 않을 것이라는 것을 의미합니다. 제노푸스 배아 안구에 DNA를 마이크로주입할 때 성공을 보장하는 세 번째 인자는 DNA가 안bud9,10의비교적 피상적 인 부위에 주입되어야한다는 것입니다. 안구 부 주변에 더 깊은 조직에 주입하면 외인성 DNA10을발현하는 광학 뉴런을 포함하는 배아의 낮은 비율이 발생합니다.
또한 GFP를 이미징하고 재구성하여 광학 축색 아버를 그대로 살아있는 제노푸스 올챙이에서 표현할 때 주의해야 할 몇 가지 문제가 있습니다. 첫째, 연구원은 광학 축색 아버를 표현하는 1개에서 3개의 GFP 사이를 포함하는 tectal 반구의 심상만 캡처해야 합니다. 단일 이미지에 광학 축색 아버를 표현하는 GFP가 3개 이상 포함되어 있는 경우 아버는 겹치는 가지가 있을 수 있으므로 재구성 과정에서 개별 아버를 정의하기가 어렵습니다. 주의해야 할 또 다른 문제는 광학 축색 아버 형태학의 재구성 및 정량화가 이 프로토콜에서 가장 시간이 많이 소요되는 단계라는 것입니다. 우리는 광학 축색 아버 형태를 재구성하고 정량화하는 데 실험 의 총 시간의 약 80-90 %가 필요하다고 추정합니다. 지각 신경 수지상 아버의 재건을 자동화하는 기술이 개발되었지만, 이러한 연산 방법은 아직 광학 축색 아버뿐만 아니라22에적용되지 않았다. 비록 힘들지만, 광학 아버 형태를 재구성하는 과정은 광학 축색 아목 형태학의 세부 사항에 대한 연구원의 이해를 극적으로 증가시킵니다. 이 추가 된 세부 사항, 차례로, 크게 이 연구원은 미래의 실험에서 캡처할 수 있는 아버를 표현 하는 GFP의 이미지의 품질을 향상.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 우리의 연구를 지원하기위한 정골 의학의 투로 대학 캘리포니아 대학 감사합니다. 우리는 우리 실험실에서이 미세 주입 기술을 구현하는 데 도움을 준 실험실 (에스더 우, 그레고리 펭, 진 태건 진, 존 림)의 이전 학생들을 인정합니다. 제노푸스 배아의 이 DNA 미세 주사/지질 검사 기술이 처음 개발된 크리스틴 홀트 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
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