Summary
Denne protokollen har som mål å demonstrere hvordan man microinject en DNA/DOTAP blanding i eyebuds av en dag gamle Xenopus laevis embryo, og hvordan å image og rekonstruere individuelle grønne fluorescerende PROTEIN (GFP) uttrykker optikk axonal arbors i tectal midbrains av intakt, levende Xenopus rumpetroll.
Abstract
Den primære visuelle projeksjon av rumpetroll av akvatiske frosken Xenopus laevis fungerer som et utmerket modell system for å studere mekanismer som regulerer utviklingen av neuronal tilkobling. Under etablering av retino-tectal projeksjon, optikk axons strekker seg fra øyet og navigere gjennom forskjellige regioner av hjernen for å nå sine mål vev, den optiske tectum. En gang optisk axons Gå inn det tectum, de utdype Terminal arbors det funksjonen å forhøye antallet av Synaptic forbindelser de kanne lage med mål interneurons inne det tectum. Her beskriver vi en metode for å uttrykke DNA-koding grønt fluorescerende protein (GFP), og få-og tap-of-Function genet konstruerer, i optiske neurons (retinal Ganglion celler) i Xenopus embryo. Vi forklarer hvordan du microinject en kombinert DNA/lipofection-reagens til eyebuds av en dag gammel embryo slik at eksogene gener uttrykkes i ett eller et lite antall optiske neurons. Ved å tagge gener med GFP eller co-sprøyte med en GFP plasmider, Terminal axonal arbors av individuelle optiske neurons med endrede molekylære signalering kan bli avbildet direkte i hjernen av intakt, levende Xenopus rumpetroll flere dager senere, og deres morfologi kan være kvantifisert. Denne protokollen gir mulighet for bestemmelse av celle-autonome molekylære mekanismer som ligger til grunn utviklingen av optiske axon arborization in vivo.
Introduction
Under utviklingen av nervesystemet, axons av presynaptiske nerve neurons navigere gjennom ulike regioner av hjernen for å nå sine målområder. Når axons invadere deres mål vev, etablerer de Synaptic forbindelser med postsynaptic mål neurons. I mange typer neurons, axons øke antallet og romlige omfanget av Synaptic forbindelser de kan gjøre ved utarbeide nettverk av Terminal grener eller arbors1. Den retino-tectal projeksjon av rumpetroll av akvatiske frosken Xenopus laevis er en kraftig virveldyr modell for å undersøke mekanismer underliggende Terminal axon arborization og Synaptic connectivity2,3,4 . Individuell GFP uttrykke optikk axonal arbors med normal og endret molekylær signalering kan observeres direkte i intakt, Living Xenopus rumpetroll5,6,7,8. For å uttrykke GFP alene eller sammen med full lengde eller avkortet versjoner av gener i små antall optiske neurons, bruker vi en teknikk som involverer microinjection/lipofection av DNA i eyebuds av en dag gammel Xenopus embryo9, 10. denne teknikken ble opprinnelig utviklet for å studere mekanismer for optikk axon pathfinding i unge Xenopus rumpetroll, og har siden blitt brukt av oss og andre til å bestemme celle-autonome molekylære mekanismer underliggende optikk axon arborization i Xenopus rumpetroll5,6,7,8,9,10.
Alternative teknikker for å uttrykke eksogene gener i et lite antall optiske neurons har blitt utviklet i andre modell arter, så vel som i X. laevis. Men hver av disse tilnærmingene presenterer utfordringer og begrensninger i forhold til microinjection av DNA/lipofection reagens i eyebuds av Xenopus embryo. Hos mus kan transgenesis brukes til å uttrykke gener i et lite antall optiske neurons, men generering av transgene mus er kostbart og tidkrevende og transgene mus ofte til stede med uønskede bivirkninger11. Transgene sebrafisk som uttrykker eksogene gener i optiske neurons kan også skapes ved å injisere plasmider i tidlige kløft scenen embryo12. Imidlertid krever denne prosessen kloning av en bestemt promoter å uttrykke gener i en mosaikk mønster i optiske neurons i sebrafisk larver12. Hyppigheten av uttrykk for eksogene DNA i optiske neurons i transgene sebrafisk er også noe lavere (< 30%) sammenlignet med Xenopus rumpetroll som ble MICROINJECTED med DNA/liposomal-reagens (30 − 60%)12. I ovo electroporation har også blitt brukt til å uttrykke gener i et lite antall optiske neurons i kyllinger13. Imidlertid har denne prosedyren ikke fullt ut karakterisere mekanismer som etablerer optisk anslag fordi optikk axon arborization ikke kan bli avbildet i intakt, levende Chick embryo. Endelig har flere laboratorier brukt electroporation til å transfect gener i små antall optiske neurons i Xenopus rumpetroll14,15. Likevel krever electroporation optimalisering av utstyr og protokoller (stimulator, elektroder, romlige og timelige mønstre av bølge pulser) utover det som brukes for microinjection av DNA/lipofection reagens i eyebuds av Xenopus embryo.
Vi og andre tidligere brukt teknikken av microinjection/lipofection av DNA i eyebuds av Xenopus embryo å bestemme celle autonome signalering mekanismer som etablerer optikk axon arborization5,6, 7 andre er , 8. vi i utgangspunktet brukt denne tilnærmingen til å analysere funksjonene til Cadherin og wnt adapter protein β-catenin i optikk axonal arborization i Xenopus rumpetroll5,6. I en studie viste vi at β-catenin binding til α-catenin og til PDZ kreves, henholdsvis for initiering og forme optikk axonal arbors in vivo5. I en annen rapport, viste vi at β-catenin bindende domener for α-catenin og GSK-3β oppositely modulere projeksjon mønstre av ventrale optikk axonal arbors6. Flere nylig identifiserte vi roller for wnt faktor, adenomatøse poliposis coli (APC), i regulering morfologiske funksjoner av optikk axonal arbors i Xenopus rumpetroll7. Av co-uttrykker N-terminalen og sentrale domener av APC som modulere β-catenin stabilitet og mikrotubulinettverket organisasjon sammen med GFP i individuelle optiske neurons, vi bestemt delte og distinkte roller for disse APC interaksjon domener på grenen nummer, lengde og vinkel i optisk axonal arbors in vivo7. Et annet laboratorium brukte microinjection/lipofection teknikk for å bestemme celle autonome roller for signalering av BDNF reseptor, TrkB, i optikk axonal arbors i Xenopus rumpetroll8. Denne gruppen viste at uttrykk for en dominerende-negativ TrkB perturbed forgrening og Synaptic modning i individuelle optikk axon arbors in vivo8. Samlet har lipofection teknikken i Xenopus allerede opplyst de spesifikke rollene til ulike gener i optikk axon forgrening i det opprinnelige miljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her over ha blitt anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av Touro universitet California (protokollen # TUCA003TE01X).
1. innhenting X. laevis embryo
- Få X. laevis embryo av naturlig mating av par av mannlige og kvinnelige voksne frosker primet med humant GONADOTROPIN (HCG), av in vitro befruktning av egg skur fra kvinnelige voksne frosker PRIMET med HCG, eller ved å bestille direkte (tabell over Materialer).
-
Dejelly embryo oppnådd med en 2% cystein løsning ved romtemperatur (tabell av materialer)16.
- Samle 50 − 100 embryo i en stor Petri-tallerken. Fjern løsningen på embryo er i ved decanting eller ved hjelp av en plast overføring pipette. Tilsett 25 mL 2% cystein oppløsning (0,5 g cystein i 25 mL ddH2O, pH til 8,0) til fatet som inneholder embryo.
- Forsiktig virvel Petri parabolen inneholder embryo i cystein løsningen til gelé strøk av embryo faller av og embryo samle i en klump i midten av fatet (5 − 10 min). På dette punktet, langsomt og forsiktig helle av cystein løsningen i et avfalls beger. Pass på å ikke helle for mange av embryo i avfalls begeret sammen med den cystein løsningen.
- Skyll embryo i Petri parabolen 6 MB med 10% endret Markus ringer løsning (MMR) eller annen passende løsning (f. eks modifisert Barth ' s Solution, MBS), virvlende fatet hver gang løsningen er erstattet.
- Kultur embryo i 10% MMR til de når utviklingstrinn 22 − 2417. Xenopus embryo kan inkubert ved temperaturer mellom 15 − 25 ° c. Graden av utvikling av embryo avhenger av temperaturen de er inkubert på17.
Merk: Xenopus embryo bestilles fra en katalog som vanligvis kommer i laboratoriet ved utviklingstrinn 20 − 24, slik at de kan bli dejellied og microinjected med en gang.
2. klargjøre DNA-plasmider og lage en DNA/DOTAP-blanding
- Subclone DNA Expression konstruerer til Xenopus uttrykk vektorer pCS2 + eller pCS2 + Mt eller derivater derav (opprinnelig konstruert av D. Turner og R. Rupp)5,6,7. pCS2 + vektorer inneholder en modifisert Cytomegalovirus (CMV) promoter som forenkler genuttrykk i frosker.
- Forsterk pCS2-plasmider som inneholder GFP og/eller gener av interesse med miniprep sett (tabell av materialer) etter standardprosedyren. I det siste eluering trinnet i miniprep-protokollen utfører du en sekvensiell eluering av DNA-en til ddH2O for å gi en endelig konsentrasjon på > 1 μg/μL.
- Oppbevar alle pCS2-plasmider ved-80 ° c til de er klare til å utføre et microinjection/lipofection eksperiment, det vil si, når embryo er på utviklingstrinn 22 − 24.
- Tin DNA-plasmider som skal lipofected ved romtemperatur. Umiddelbart før lipofection, sentrifuge DNA plasmider kort. Dette vil hindre utfelling dannes i DNA/DOTAP blanding som kan tette tuppen av microcapillary pipette.
- Kombiner DNA plasmider med DOTAP liposomal transfeksjoner reagens (tabell av materialer) ved et 1:3 (w/v) ratio9,10. For eksempel overføre 2 μg av DNA til en 1,5 mL mikrosentrifugen tube og tilsett 6 μL av DOTAP, eller overføre 3 mikrogram DNA i et mikrosentrifugen rør og tilsett 9 μL av DOTAP.
- Når DNA og DOTAP kombineres, forsiktig flick mikrosentrifugen røret for å blande løsningen. DNA/DOTAP løsningen skal bli litt ugjennomsiktig etter blanding.
- Hvis to plasmider skal lipofected sammen (f. eks pCS2-GFP med en andre pCS2 plasmider inneholder en avkortet eller full-lengde versjon av et gen) i optiske neurons, først kombinere de to plasmider (etter kort sentrifugering begge) på en 1:1 ratio, og deretter legge DOTAP på et 1:3 (w/v)-forhold. Kombiner for eksempel 1 μg av pCS2-GFP med 1 μg av en andre pCS2-plasmider, og legg deretter til 6 μL av DOTAP.
Merk: Studier har vist at lipofection av to plasmider i eyebuds av Xenopus embryo på disse utviklingsmessige stadier vil resultere i deres co-uttrykk i individuelle optiske neurons9,10.
3. legge en Microinjection nål med DNA/DOTAP
- Klem forsiktig tuppen av en trukket glass microcapillary pipette med fine tang (tabell av materialer).
- Tilbakefylling glasset microcapillary pipette med mineralolje ved hjelp av en microfil slik at en liten dråpe mineralolje vises på klippet spissen av micropipette. Fyll microcapillary pipette halvveis med mineralolje.
- Legg den trakk glass microcapillary pipette som nå er fylt med mineralolje i en egnet injeksjons holder koblet til en injeksjonsvæske. Hvis du bruker en injeksjonstype (materialfortegnelsen), tar du ut stempelet halvveis før du legger microcapillary pipette på den. Når den microcapillary pipette er forsvarlig festet til injeksjonsstedet, forlenge stempelet i full utstrekning for å bekrefte at microcapillary pipette er sterkt festet til injeksjonsstedet og beveger seg ikke med forlengelsen av stempelet.
- Overfør et 3 μL fall av DNA/DOTAP-blandingen på et snitt firkantet (1 tommer firkantet) ark med para fin papir.
- Under et stereo dissekere mikroskop, Flytt tuppen av glasset microcapillary pipette inn i DNA/DOTAP drop.
- Langsomt suge DNA/DOTAP slippe inn i glasset microcapillary pipette ved hjelp av Fyll alternativet på injeksjons apparatet. Som væsken er lastet inn i microcapillary pipette, vil slippe bli mindre. På grunn av den svake tettheten til DNA/DOTAP-løsningen, skal grensen mellom mineral oljen og DNA/DOTAP-løsningen være synlig i glass microcapillary pipette (figur 1). Hvis det er nødvendig, stopper du å fylle microcapillary pipette med jevne mellomrom for å tillate trykket i glasset microcapillary pipette å kalibrere.
Figur 1: bilder av microcapillary pipette. Bilder viser en microcapillary pipette på injeksjons apparatet, før (a), og etter (B) fylling med DNA/DOTAP. Åpne piler, tuppen av stempelet i microcapillary pipette (A, B). Lukket pil, linje mellom mineralolje og DNA/DOTAP i den fylte microcapillary pipette (B). Scale bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Microinjecting DNA/DOTAP inn Eyebuds av 1 dag gamle Xenopus embryo
- Manuelt devitellinize ti trinn 20 − 24 Xenopus embryo med fine tang i en 10 mm Petri parabolen fylt med 0,1 x MMR. Ta tak i eggeplomme konvolutt i midjen for å unngå å skade embryo. Med tang i både eksperimentator venstre og høyre hånd, pop boblen av eggeplomme konvolutten og slipp embryo fra eggeplomme konvolutten. Pass på å ikke skade embryo når du fjerner eggeplomme konvolutten.
Merk: Begynnelsen på etappe 20, Xenopus embryo utvikle et innrykk eller "midje" mellom de fremre og bakre halvdelene av fosteret. Denne midjen tillater et gap å danne mellom eggeplomme konvolutten og embryo på denne posisjonen. - Bruk en pipette med plast overføring med et kutt tupp for å overføre 5 − 10 devitellinized trinn 22 − 24 embryo til en 10 mm Petri-rett fylt med 1x MMR.
Merk: Den høyere saltoppløsning i 1x MMR Letter helbredelse av punktering sår som vil følge av microinjection. - Under stereomikroskopet, ta tak i en av de devitellinized embryo i Petri parabolen med pinsett i hver hånd, og ordne embryo slik at dens fremre Pol er pekt opp i synsfeltet. Orientere fosteret slik at den ligger sidelengs og en av dens eyebuds (venstre eller høyre) vender oppover.
- Under stereomikroskopet, hold embryo med tang i eksperimentator ' s ikke-dominerende hånd, og med eksperimentator dominerende hånd innføre spissen av glasset micropipette inn i eyebud (fra ventrale eller rygg side, avhengig av halvparten av det embryo som for tiden injiseres), like under epidermis (figur 2). Injiser mellom 70 − 210 nL av DNA/DOTAP-løsningen. Dette kan gjøres i flere pulser, avhengig av størrelsen på pulsen som injeksjonsstedet er satt til (vanligvis 70 nL).
Merk: Deepness av injeksjon er svært viktig for lipofection i optiske neurons. Hvis plasseringen av spissen av microcapillary er riktig satt inn svært overfladisk inn i eyebud, deretter etter microinjection, den grå epidermis overliggende eyebud vil hovne opp. Hvis posisjonen er for dyp, vil den grå eyebud ikke vise noen endringer, og hyppigheten av uttrykk for DNA i optiske neurons vil være lavere. - Snu fosteret rundt og utføre samme microinjection i eyebud på kontralateral siden av fosteret.
- Injiser både eyebuds på 6 − 10 (eller flere) embryo i hvert eksperiment.
- Etter microinjection, lagre embryo i en Petri parabol med 1x MMR for ca 30 min for å lette såret healing.
- Etter 30 min, overføring injisert embryo i en 0,1 x MMR løsning med 0,001% bleking agent (phenylthiocarbamide) for å redusere pigmentering. Kultur embryo dekket i cirka fem dager, til embryo har utviklet seg til rumpetroll på stadier 46-4716.
Figur 2: avgrensning av eyebud region for microinjection. Skjematisk (A) og Photomicrograph (B) av X. laevis embryo på utviklingsmessige stadier 22/23 viser eyebud regionen som bør mål for microinjection (røde høydepunkter). Scale bar = 1 mm. panel A har blitt modifisert fra Zahn et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Imaging av GFP uttrykke optikk axonal arbors i intakt, Living rumpetroll
Merk: Når rumpetroll som ble lipofected med DNA nå utviklingstrinn 46-47, er de klare for bildebehandling.
- Før bildebehandling må rumpetroll være anesthetized. For å bedøve rumpetroll, overføre lipofected rumpetroll til en 0,02% tricaine løsning i ddH2O i en 10 mm Petri parabolen. Vent 5 − 10 min til rumpetroll blir Immobile. Kontroller at rumpetroll fortsatt er i live ved å observere deres bankende hjerter under et stereo dissekere mikroskop.
- Plasser en anesthetized rumpetroll i et spesiallaget silikon kammer på et glass lysbilde og forsegle med en dekkglass. Rumpetroll skal vippe litt slik at den ene siden (venstre eller høyre) av hodet er vinklet oppover og bare såvidt berører dekselet slip.
- Screen halvparten av rygg tectal mellomhjernen av rumpetroll som vippes oppover ved lav forstørrelse for GFP uttrykke optikk axonal arbors.
Merk: En widefield oppreist mikroskop utstyrt med en epilfuorescence belysning og en apochromatic objektiv linse (tabell av materialer) kan brukes til skjermen for fluorescerende arbors. - Hvis tectal halvkule inneholder mellom en til tre GFP uttrykke optikk axonal arbors, ta en z-serie med bilder av disse arbors bruker en høy kontrast 40x luft lang arbeidsavstand objektiv (tabell av materialer). For hver axonal Arbor, Capture 10 − 20 z-serien skiver på 1,5 μm intervaller.
- For å vise axon arbors på den andre siden av tectal mellomhjernen, reload rumpetroll i silisium kammeret slik at den kan vippes til den andre siden og forsegle med en cover slip. Gjenta deretter trinn 5,3 og 5,4.
6. rekonstruksjon og kvantifisering av optikk axonal Arbor morfologi
- Velg en bildestakk som inneholder mellom én til tre GFP som uttrykker optisk axonal arbors.
- Bruk verktøyet for frihåndstegning i grafikkredigeringsprogram vare (tabell med materialer) til å spore den delen av hver optiske axonal Arbor som er synlig i hver z-sektor. Tracing gjennom bitene av hver Arbor tydelig i hver z-Slice vil skape en nøyaktig 2D projeksjon av Arbor. Forskjellige farger kan brukes til å spore distinkte GFP uttrykke optikk axonal arbors.
- Gjør alle morphometric målinger på 2D-rekonstruksjoner av axonal arbors, med referanse til den opprinnelige z-serien av bilder når det trengs7. Bruke Image J-programvare (tabell av materialer), måle morfologiske parametre som antall grener (dvs. antall gren tips eller gren poeng), total Arbor gren lengde, lengde per gren, lengde og bredde på Arbor, generell form av Arbor (L/W ratio, sirkularitet), og vinkel på grener7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen gir en suksess rate på 30 − 60% av injisert Xenopus EMBRYO uttrykker GFP (alene eller sammen med en ekstra DNA konstruerer) i en til ti optiske axonal arbors. I Figur 3viser vi representative konfokalmikroskopi bilder av GFP som uttrykker kontroll og mutant optikk axonal arbors i intakt Xenopus rumpetroll fra vår nylig publiserte studie7. For denne studien, klonet vi to domene mutanter av APC (APCNTERM og APCβ-cat) i pCS2 plasmider, og co-injisert disse plasmider sammen med en pCS2-GFP merking plasmider i eyebuds av en dag gamle Xenopus embryo. Figur 4 viser resultatene av flere kvantitative målinger vi gjort på rekonstruksjoner av kontroll og APC mutant axonal arbors, inkludert antall grener, total Arbor gren lengde, og gjennomsnittlig lengde på grener.
Figur 3: representative bilder av GFP uttrykke kontroll og mutant optikk axonal arbors. (A) skjematisk av MUTANTER av APC N-terminal og sentral domene mutanter som ble klonet i pCS2 plasmider. (B) representative konfokalmikroskopi bilder av enkelt GFP og GFP-APC mutant optikk axonal arbors i tecta av intakt, levende Xenopus rumpetroll. (C) rekonstruksjoner av z-serie bilder av GFP kontroll og APC mutant optikk axonal arbors. Skala stolper = 30 μm (B), 40 μm (C). Dette tallet har blitt modifisert fra Jin et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kvantifisering av morfologier av rekonstruksjoner av kontroll og mutant axonal arbors. Plott av antall grener (A), total Arbor gren lengde (B), og gjennomsnittlig gren lengde (C) Bekreft observerte forskjeller mellom kontroll og APC mutant uttrykker axonal arbors. Data i paneler A − C vises som prosent av kontroll gjennomsnittet med SEM. * over datalinjen eller linjen angir p < 0,05. Ytterligere scatter plott av antall grener versus gjennomsnittlig gren lengde med regresjon linjer viser invers korrelasjon mellom disse parametrene i optikk axonal arbors uttrykke APC domener (D, E). Eksempel tall: (A) GFP-12, APCNTERM-18 APCβ-Cat-25; (B) GFP-12, APCNTERM-16, APCβ-Cat-25; (C) GFP-11, APCNTERM-16, APCβ-Cat-25. Dette tallet har blitt modifisert fra Jin et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen viser vi hvordan du uttrykker eksogene DNA konstruksjoner i enkelt eller lite antall optiske neurons og hvordan å avbilde individuelle GFP uttrykke optikk axonal arbors med normal og forandret molekylær signalering i intakt, levende rumpetroll av frosken X . laevis. Vi forklarer også hvordan å rekonstruere og kvantifisere morfologi av GFP uttrykke optikk axonal arbors fra bilder tatt i vivo. For å uttrykke eksogene DNA plasmider i små antall optiske neurons, microinject vi en DNA/lipofection reagens blandingen i eyebud Primordia av en dag gamle Xenopus embryo, ved hjelp av en teknikk først utviklet i laboratoriet av Christine Holt å studere optikk axon pathfinding i unge rumpetroll9,10,19,20,21. Vi og andre har også brukt denne DNA microinjection/lipofection teknikk for å studere molekylære mekanismer som regulerer optikk axon arborization i eldre intakt, Living X. laevis rumpetroll5,6, 7 andre er , 8. denne billig, enkel prosedyre for transient, celle spesifikke transgenesis tillater bestemmelse av celle-autonome gen funksjon i å utvikle optiske axonal arbors i et levende virveldyr modell system.
Det er flere viktige faktorer å vurdere for beste praksis når microinjecting DNA/DOTAP i eyebuds av Xenopus embryo. For det første, som nevnt i andre rapporter, bør DNA-konsentrasjonen være større enn 1 μg/μL9,10. DNA-konsentrasjoner mellom 1 − 3 μg/μL er best, men DNA-konsentrasjoner så lave som 0,7 μg/μL kan også brukes. For det andre, microinjecting DNA i trinn 22 − 24 Xenopus embryo er optimalt for eksperimenter der målet er å undersøke mekanismer som regulerer optikk axonal arborization. I embryo på disse utviklingsmessige stadier, eyebuds er morfologisk differensiert og kan lettere mål for injeksjon14. De fleste optiske neurons i eyebud Primordia av scenen 22 − 24 embryo er også post-mitotisk, noe som resulterer i et mindre antall optiske neurons uttrykker GFP, som igjen gir bedre oppløsning når Imaging individuelle GFP optikk axonal arbors i rumpetroll. Endelig har tidligere studier vist at eksogene gener uttrykkes ~ 8 h etter lipofection9. Derfor betyr det å uttrykke gen konstruksjoner i eyebuds av scene 22 − 24 embryo at genene vil forurolige verken celle skjebne valg av optiske neurons eller den første utvekst av deres axons. En tredje faktor som vil sikre suksess når microinjecting DNA i Xenopus embryo eyebuds er at DNA skal injiseres i en relativt overfladisk område av eyebud9,10. Sprøytebruk i mer dypt vev i eller rundt eyebud vil resultere i en lavere andel av embryo som inneholder optiske neurons uttrykke eksogene DNA10.
Der er likeledes adskillige utgaver å bli våken av når tenkelig og rekonstruere GFP uttrykker optisk axonal arbors inne Behold, lever Xenopus rumpetroll. Først bør forskerne bare ta bilder av tectal halvkuler som inneholder mellom en til tre GFP uttrykke optikk axonal arbors. Hvis et enkelt bilde inneholder mer enn tre GFP som uttrykker optikk axonal arbors, vil arbors sannsynligvis ha overlappende grener, noe som gjør det vanskelig å definere de enkelte arbors under gjenoppbyggingsprosessen. Et annet problem å være klar over er at gjenoppbygging og kvantifisering av optiske axonal Arbor morfologi er de mest tidkrevende trinnene i denne protokollen. Vi anslår at rekonstruere og kvantifisere optikk axonal Arbor morfologi krever omtrent 80 − 90% av den totale tiden av eksperimentet. Selv om teknikkene er utviklet for å automatisere gjenoppbyggingen av tectal Nevron dendrittiske arbors, disse beregningsorientert metoder har ennå ikke blitt brukt til optikk axonal arbors også22. Selv arbeidskrevende, prosessen med rekonstruere optikk Arbor morfologi dramatisk øker forskerne forståelse av detaljene i optiske axonal Arbor morfologi. Dette lagt detalj, i sin tur forbedrer betydelig kvaliteten på bildene av GFP uttrykker arbors disse forskerne er i stand til å fange opp i fremtidige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Touro University California College of Osteopathic Medicine for å støtte vår forskning. Vi erkjenner tidligere studenter i laboratoriet (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John lim) som bidro til å implementere denne microinjection teknikken i laboratoriet vårt. Vi er takknemlige for Dr. Christine Holt, i hvis laboratorium dette DNA microinjection/lipofection teknikk i Xenopus embryo ble først utviklet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
