Summary
Detta protokoll syftar till att visa hur man microinjicera en DNA/DOTAP blandningen i ögonknoppar av en dag gamla Xenopus laevis embryon, och hur man avbildar och rekonstruera enskilda grön fluorescerande protein (GFP) uttrycker optiska axonala arbors i tectal midbrains av intakt, levande Xenopus grodyngel.
Abstract
Den primära visuella projektionen av grodyngel av vatten groda Xenopus laevis fungerar som ett utmärkt modellsystem för att studera mekanismer som reglerar utvecklingen av neuronala konnektivitet. Under etableringen av retino-tectal projektion, optiska axoner sträcker sig från ögat och navigera genom olika regioner i hjärnan för att nå sin målvävnad, den optiska tectum. När optiska axoner in i tectum, de utarbeta Terminal arbors som fungerar för att öka antalet synaptiska anslutningar de kan göra med mål interneuroner i tectum. Här beskriver vi en metod för att uttrycka DNA-kodning grönt fluorescerande protein (GFP), och vinst-och förlust av funktion gen konstruktioner, i optiska nervceller (retinala ganglionceller) i Xenopus embryon. Vi förklarar hur man microinjicera en kombinerad DNA/lipofektion reagens i ögonknoppar av en dag gamla embryon så att exogena gener uttrycks i enstaka eller ett litet antal optiska nervceller. Genom att tagga gener med GFP eller co-injicera med en GFP plasmid, Terminal axonal arbors av enskilda optiska neuroner med förändrad molekylär signalering kan avbildas direkt i hjärnan av intakt, levande Xenopus grodyngel flera dagar senare, och deras morfologi kan kvantifieras. Detta protokoll möjliggör bestämning av cell-autonoma molekylära mekanismer som ligger till grund för utvecklingen av optisk Axon arborization in vivo.
Introduction
Under utvecklingen av nervsystemet, axoner av presynaptiska neuroner navigera genom olika regioner i hjärnan för att nå sina mål områden. När axoner invadera deras målvävnader, de upprättar synaptiska anslutningar med postsynaptiska mål nervceller. I många typer av nervceller, axoner öka antalet och rumsliga omfattningen av synaptiska anslutningar de kan göra genom att utarbeta nätverk av terminalen grenar eller arbors1. Den retino-tectal projektion av grodyngel av vatten groda Xenopus laevis är en kraftfull ryggradsdjur modell för att undersöka mekanismerna bakom Terminal Axon arborization och synaptisk anslutning2,3,4 . Individuell GFP uttrycker optiska axonala arbors med normal och förändrad molekylär signalering kan observeras direkt i intakt, levande Xenopus grodyngel5,6,7,8. För att uttrycka GFP ensam eller tillsammans med fullängds eller trunkerade versioner av gener i litet antal optiska neuroner, använder vi en teknik som involverar mikroinjektion/lipofektion av DNA i ögonknoppar av en dag gamla Xenopus embryon9, 10. denna teknik utvecklades ursprungligen för att studera mekanismer för optisk Axon pathfinding hos unga Xenopus grodyngel, och har sedan dess tillämpats av oss och andra för att bestämma cell-autonoma molekylära mekanismer bakom optisk Axon arborization i Xenopus grodyngel5,6,7,8,9,10.
Alternativa tekniker för att uttrycka exogena gener i ett litet antal optiska nervceller har utvecklats i andra modell arter, liksom i X. laevis. Emellertid, var och en av dessa metoder presenterar utmaningar och begränsningar jämfört med görs av DNA/lipofection reagens i ögonknoppar av Xenopus embryon. Hos möss, transgenes kan användas för att uttrycka gener i ett litet antal optiska nervceller, men generationen av transgena möss är kostsamt och tidskrävande och transgena möss ofta närvarande med oönskade biverkningar11. Transgena zebrafiskar som uttrycker exogena gener i optiska nervceller kan också skapas genom injicering av plasmider i de tidiga embryona till embryon12. Denna process kräver dock kloning av en specifik promotor för att uttrycka gener i ett mosaikmönster i optiska neuroner i zebrafiskar larver12. Frekvensen av uttryck av EXOGEN DNA i optiska neuroner i transgena zebrafiskar är också något lägre (< 30%) jämfört med Xenopus grodyngel som mikroinjicerades med DNA/liposomalt reagens (30 − 60%)12. I ovo elektroporation har också använts för att uttrycka gener i ett litet antal optiska nervceller i kycklingar13. Emellertid, detta förfarande har misslyckats med att helt karakterisera mekanismer som upprättar optiska projektioner eftersom optisk Axon arborization inte kan avbildas i intakt, levande chick embryon. Slutligen har flera laboratorier använt elektroporation för att transfect gener i ett litet antal optiska neuroner i Xenopus grodyngel14,15. Ändå kräver elektroporation optimering av utrustning och protokoll (stimulator, elektroder, rumsliga och temporala mönster av våg pulser) utöver det som används för görs av DNA/lipofection reagens i ögonknoppar av Xenopus embryon.
Vi och andra tidigare använt tekniken för mikroinjektion/lipofektion av DNA i ögonknoppar av Xenopus embryon för att bestämma cell autonoma signalering mekanismer som upprättar optisk Axon arborization5,6, 7 , 8. vi använde inledningsvis denna metod för att dissekera funktionerna hos cadherin och WNT adapter protein β-catenin i optisk axonal arborization i Xenopus grodyngel5,6. I en studie visade vi att β-cateninbindning till α-catenin och till PDZ krävs för att initiera och forma optiska axonala arbors in vivo5. I en andra rapport, vi visade att β-catenin bindnings domäner för α-catenin och GSK-3β motsatt modulera projektion mönster av ventrala optiska axonala arbors6. På senare tid har vi identifierat roller för WNT Factor, adenomatös poliposis coli (APC), för att reglera morfologiska egenskaper av optiska axonala arbors i Xenopus grodyngel7. Genom att co-uttrycka N-terminalen och centrala domäner APC som modulera β-catenin stabilitet och mikrotubuli organisation tillsammans med GFP i enskilda optiska neuroner, bestämde vi delade och distinkta roller för dessa APC interaktion domäner på filialnummer, längd och vinkel i optiska axonala arbors in vivo7. Ett annat laboratorium använde microinjection/lipofection teknik för att bestämma cell autonoma roller för signalering av BDNF-receptorn, TrkB, i optiska axonala arbors i Xenopus grodyngel8. Denna grupp visade att uttrycket av en dominerande-negativ TrkB oroad förgrening och synaptisk mognad i enskilda optiska Axon arbors in vivo8. Sammantaget har lipofection tekniken i Xenopus redan belyst de specifika rollerna av olika gener i optisk Axon förgrening i den inhemska miljön.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Touro University California (protokoll # TUCA003TE01X).
1. erhållande av X. laevis embryon
- Få X. laevis embryon genom naturlig parning av par av manliga och kvinnliga vuxna grodor primas med humant koriongonadotropin (hCG), genom in vitro fertilisering av ägg som skjul från kvinnliga vuxna grodor PRIMAS med HCG, eller genom att beställa direkt (tabell över Material).
-
Dejelly embryon som erhållits med en 2% cystein lösning vid rumstemperatur (tabell över material)16.
- Samla 50 − 100 embryon i en stor petriskål. Ta bort lösningen som embryona är i genom att Dekantera eller använda en plastpipett. Tillsätt 25 mL 2% cystein lösning (0,5 g cystein i 25 mL ddH2O, pH till 8,0) till skålen som innehåller embryon.
- Snurra försiktigt petriskål som innehåller embryon i cystein lösningen tills gelé skikt av embryon faller av och embryon samlas i en klump i mitten av skålen (5 − 10 min). Vid denna punkt, sakta och försiktigt Häll av cystein lösningen i en avfalls bägare. Var noga med att inte hälla för många av embryona i avfalls bägaren tillsammans med cystein lösning.
- Skölj embryona i petriskål 6x med 10% modifierad Marks ring lösning (MMR) eller annan lämplig lösning (t. ex. modifierad Barth lösning, MBS), virvlande skålen varje gång lösningen byts ut.
- Odla embryona i 10% MMR tills de når utvecklingsstadier 22 − 2417. Xenopus -embryon kan inkuberas vid temperaturer mellan 15 − 25 ° c. Graden av utveckling av embryona beror på den temperatur de inkuberas vid17.
Anmärkning: Xenopus -embryon som beställs från en katalog anländer vanligtvis till laboratoriet på utvecklingsstadiet 20 − 24, så att de kan dejellied och mikroinjiceras genast.
2. förbereda DNA-plasmider och göra en blandning av DNA/DOTAP
- Subclone DNA-uttryck konstruerar till Xenopus Expression vektorer pCS2 + eller pCS2 + MT eller derivat därav (ursprungligen konstruerad av D. Turner och R. Rupp) 5,6,7. pCS2 + vektorer innehåller en modifierad cytomegalovirus (CMV) promotor som underlättar genuttryck i grodor.
- Amplify pCS2 plasmider som innehåller GFP och/eller gener av intresse med miniprep Kits (tabell över material) enligt standardförfarandet. I det slutliga elutionssteget i miniprep-protokollet, utför en sekventiell eluering av DNA i ddH2O för att ge en slutlig koncentration på > 1 μg/μl.
- Förvara alla pCS2 plasmider vid-80 ° c tills redo att utföra en microinjection/lipofektion experiment, dvs när embryon är i utvecklingsstadier 22 − 24.
- Tina DNA-plasmider som ska lipofected vid rumstemperatur. Omedelbart före lipofektion, kort Centrifugera DNA-plasmider. Detta kommer att förhindra fällning bildas i DNA/DOTAP blandningen som kan täppa spetsen av microcapillary pipett.
- Kombinera DNA-plasmider med dotap liposomalt transfection reagens (tabell över material) vid ett 1:3 (w/v) förhållande9,10. Överför till exempel 2 μg DNA till ett 1,5 mL microcentrifugerör och tillsätt 6 μL DOTAP, eller överför 3 μg DNA i ett microcentrifugerör och tillsätt 9 μL DOTAP.
- När DNA och DOTAP kombineras, försiktigt snärta microcentrifug röret för att blanda lösningen. DNA/DOTAP lösningen bör bli något ogenomskinlig efter blandning.
- Om två plasmider skall lipofected tillsammans (t. ex., pCS2-GFP med en andra pCS2 plasmid innehållande en stympad eller full-length version av en gen) i optiska nervceller, först kombinera två plasmider (efter kort centrifugering båda) vid en 1:1 förhållande, och sedan lägga till DOTAP vid ett 1:3 (w/v) förhållande. Till exempel, kombinera 1 μg pCS2-GFP med 1 μg av en sekund pCS2 plasmid och tillsätt sedan 6 μL DOTAP.
Anmärkning: Studier har visat att lipofektion av två plasmider i ögonknoppar av Xenopus embryon i dessa utvecklingsstadier kommer att resultera i deras co-uttryck i enskilda optiska neuroner9,10.
3. Ladda en Mikroinjektionsnål med DNA/DOTAP
- Klipp försiktigt spetsen på ett draget glas microcapillary pipett med fina pinpett (tabell över material).
- Återfyll glaset microcapillary pipett med mineralolja med hjälp av en microfil så att en liten droppe mineralolja visas på den klippta spetsen av mikropipett. Fyll mikrokapillärpipetten halvvägs med mineralolja.
- Ladda det dragna glaset microcapillary pipett som nu fylls med mineralolja i en lämplig injektions hållare ansluten till en injektor. Om du använder en injektor (tabell över material), mata ut kolven halvvägs innan du laddar mikrokapillärpipetten på den. När mikrokapillärpipetten är ordentligt fastsatt på injektorn, Förläng kolven i full utsträckning för att bekräfta att mikrokapillärpipetten är starkt fäst vid injektorn och inte rör sig med förlängningen av kolven.
- Överför en 3 μL droppe av DNA/DOTAP blandningen på en klippa kvadrat (1 tum kvadrat) ark av paraffin papper.
- Under en stereo dissekera Mikroskop, flytta spetsen av glaset microcapillary pipett i DNA/DOTAP droppe.
- Sakta suga DNA/DOTAP droppe i glaset microcapillary pipett med hjälp av Fyllningsalternativ på injektions apparaten. Eftersom vätskan är laddad i mikrokapillärpipetten, kommer droppe att bli mindre. På grund av den lilla opaciteten hos DNA/DOTAP-lösningen bör gränsen mellan mineraloljan och DNA/DOTAP-lösningen vara synlig i glas mikrokapillärpipetten (figur 1). Vid behov, sluta fylla mikrokapillärpipetten regelbundet för att tillåta att trycket i glas mikrokapillärpipetten kalibrerar.
Figur 1: bilder av mikrokapillärpipett. Bilder visar en mikrokapillärpipett på injektions apparaten, före (a), och efter (B) fyllning med DNA/dotap. Öppna pilar, spetsen på kolven i mikrokapillärpipetten (a, B). Sluten pil, linje mellan mineralolja och DNA/DOTAP i den fyllda mikrokapillärpipetten (B). Scale bar = 1 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. microinjicera DNA/DOTAP i Ögonknoppar av 1 dag gamla Xenopus embryon
- Manuellt devitellinize tio steg 20 − 24 Xenopus embryon med finpinps i en 10 mm petriskål fylld med 0,1 x MMR. Ta tag i Eukaryoter kuvert i midjan för att undvika att skada embryona. Med tång i både försöksledaren vänster och höger händer, pop bubblan i Eukaryoter kuvert och frigöra embryot från Eukaryoter kuvert. Var noga med att inte skada embryona när du tar bort vitellinkuvertet.
Anmärkning: Med början vid etapp 20 utvecklar Xenopus embryon ett indrag eller "midja" mellan de främre och bakre halvorna av embryot. Denna midja tillåter ett gap att bildas mellan Eukaryoter kuvert och embryot på denna position. - Använd en plastöverföringspipett med en snitt spets för att överföra 5 − 10 devitelliniserade steg 22 − 24 embryon till en 10 mm petriskål fylld med 1x MMR.
Anmärkning: Den högre saltlösningen i 1x MMR underlättar läkning av punktering sår som kommer att resultera från mikroinjektion. - Under stereomikroskopet, ta tag i en av de devitellinized embryon i petriskål med pinps i varje hand, och ordna embryot så att dess främre stolpen är pekade upp i synfältet. Orientera embryot så att den ligger lateralt och en av dess ögonknoppar (vänster eller höger) är vänd uppåt.
- Under stereomikroskopet, hålla embryot med pinpett i försöksledaren icke-dominerande hand, och med försöksledaren dominerande hand införa spetsen på glaset micropipett i eyebud (från ventrala eller ryggsidan, beroende på hälften av embryot som för närvarande injiceras), precis under epidermis (figur 2). Injicera mellan 70 − 210 nL av DNA/DOTAP-lösningen. Detta kan göras i flera pulser, beroende på storleken på den puls injektorn är inställd på (vanligtvis 70 nL).
Anmärkning: Den djup injektion är mycket viktigt för lipofektion i optiska nervceller. Om placeringen av spetsen på microcapillary är korrekt insatt mycket ytligt i ögonknoppen, sedan efter mikroinjektion, den grå överhuden ovanför eyebud kommer att svälla. Om positionen är för djup, den grå eyebud kommer inte att visa några förändringar, och frekvensen av uttrycket av DNA i optiska nervceller kommer att vara lägre. - Vänd embryot runt och utför samma mikroinjektion i ögonknoppen på den kontralaterala sidan av embryot.
- Injicera båda ögonknopparna på 6 − 10 (eller fler) embryon i varje experiment.
- Efter mikroinjektion, lagra embryon i en petriskål med 1x MMR för cirka 30 min för att underlätta sårläkning.
- Efter 30 min, överföring injiceras embryon i en 0,1 x MMR lösning med 0,001% blekmedel (fenyltiokarbamid) för att minska pigmentering. Kultur de embryon som omfattas av cirka fem dagar, tills embryona har utvecklats till grodyngel på stadier 46 − 4716.
Figur 2: avgränsning av eyebuds region för mikroinjektion. Schematisk (a) och photomicrograph (B) av X. laevis embryo i utvecklingsstadier 22/23 Visa eyebud region som bör riktas mot mikroinjektion (röda höjdpunkter). Skalstapel = 1 mm. panel A har modifierats från Zahn et al.18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. avbildning av GFP uttrycker optiska Axonala arbors i intakt, levande grodyngel
Anmärkning: När grodyngel som lipofected med DNA nå utvecklingsstadier 46 − 47, de är redo för avbildning.
- Före avbildning måste grodyngel vara sövda. Att söva grodyngel, överföra lipofected grodyngel i en 0,02% tricaine lösning i DDH2O i en 10 mm petriskål. Vänta 5 − 10 min tills grodyngel blir orörbara. Kontrollera att grodyngel är fortfarande vid liv genom att observera deras svävning hjärtan under en stereo dissekera Mikroskop.
- Placera en sövda grodyngel i en skräddarsydd silikon kammare på en glas-Slide och tätning med en täckslip. Grodyngel bör luta något så att ena sidan (vänster eller höger) av huvudet är vinklad uppåt och bara knappt vidrör täckslip.
- Screen hälften av dorsala tectal mellanhjärnan av grodyngel som lutas uppåt vid låg förstoring för GFP uttrycker optiska axonala arbors.
Anmärkning: En widefield upprätt Mikroskop utrustad med en epilfuorescence belysning och en apokromatiska objektiv objektiv (tabell över material) kan användas för att skärmen för fluorescerande arbors. - Om den tectal halvklotet innehåller mellan en till tre GFP uttrycker optiska axonala arbors, fånga en z-serie av bilder av dessa arbors med en hög kontrast 40x luft lång arbetsavstånd mål (tabell över material). För varje axonal Arbor, fånga 10 − 20 z-seriens skivor med 1,5 μm intervall.
- För att Visa Axon arbors på andra sidan av tectal midbrain, Ladda grodyngel i kisel kammaren så att den lutar till andra sidan och tätning med en täckslip. Upprepa sedan steg 5,3 och 5,4.
6. rekonstruktion och kvantifiering av optisk axonal Arbor-morfologi
- Välj en bildstapel som innehåller mellan en till tre GFP uttrycker optiska axonala arbors.
- Använd fri hands ritverktyget i grafisk redigeringsprogram (tabell över material) för att spåra den del av varje optisk axonal Arbor synlig i varje z-slice. Spårning genom bitar av varje Arbor tydligt i varje z-Slice kommer att skapa en exakt 2D projektion av Arbor. Olika färger kan användas för att spåra olika GFP uttrycker optiska axonala arbors.
- Gör alla morphometriska mätningar på 2D-rekonstruktioner av axonala arbors, med hänvisning till den ursprungliga z-serien av bilder vid behov7. Med hjälp av bild J programvara (tabell över material), mått morfologiska parametrar såsom antal grenar (dvs. antal gren tips eller gren punkter), totala Arbor grenlängd, längd per gren, längd och bredd av Arbor, övergripande form av Arbor (L/W cirkularitet) och vinkeln på grenarna7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som beskrivs i denna artikel ger en framgång på 30 − 60% av injicerade Xenopus embryon uttrycker GFP (ensamt eller tillsammans med en ytterligare DNA-konstruktioner) i en till tio optiska axonala arbors. I figur 3visar vi representativa konfokala bilder av GFP som uttrycker kontroll och muterade optiska axonala arbors i intakta Xenopus grodyngel från vår nyligen publicerade studie7. För denna studie, vi klonade två domän mutanter av APC (APCNTERM och APCβ-Cat) i pCS2 plasmider, och co-injiceras dessa plasmider tillsammans med en pCS2-GFP märkning plasmid i ögonknoppar av en dag gamla Xenopus embryon. Figur 4 visar resultaten av flera kvantitativa mätningar vi gjort på rekonstruktioner av kontroll och APC Mutant axonal arbors, inklusive antal grenar, totala Arbor grenlängd, och genomsnittlig längd grenar.
Figur 3: representativa bilder av GFP-uttryckande kontroll och muterade optiska axonala arbors. (A) Schematisk av MUTANTER av APC N-Terminal och Central Domain mutanter som var klonade till pCS2 plasmider. Brepresentativa konfokalbilder av en enda GFP och GFP-APC Mutant optiska axonala arbors i tecta av intakt, levande Xenopus grodyngel. C) rekonstruktioner av z-seriens bilder av GFP-kontroll och APC Mutant optiska axonala arbors. Skalstreck = 30 μm (B), 40 μm (C). Denna siffra har modifierats från Jin et al.7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: kvantifiering av morfologier för rekonstruktioner av kontroll och muterade axonala arbors. Tomter med antal grenar (a), total berså Grens längd (B) och genomsnittlig Grens längd (C) bekräfta observerade skillnader mellan kontroll och APC Mutant uttrycker axonal arbors. Data i paneler A − C visas i procent av kontroll medelvärdet med SEM. * ovanför datafältet eller linjen indikerar p < 0,05. Ytterligare spridningsdiagram av antalet grenar kontra genomsnittlig filial längd med Regressions linjer visar omvänd korrelation mellan dessa parametrar i optiska axonala arbors uttrycker APC domäner (D, E). Exempel nummer: (a) GFP-12, APCNTERM – 18 APCβ-Cat-25; BGFP-12, APCNTERM-16, APCβ-Cat-25. C) GFP-11, APCNTERM-16, APCβ-Cat-25. Denna siffra har modifierats från Jin et al.7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln visar vi hur man uttrycker exogena DNA-konstruktioner i ett eller ett litet antal optiska neuroner och hur man avbildar enskilda GFP uttrycker optiska axonala arbors med normala och förändrade molekylära signalering i intakt, levande grodyngel av grodan X . laevis. Vi förklarar också hur man rekonstruera och kvantifiera morfologin av GFP uttrycker optiska axonala arbors från bilder tagna in vivo. För att uttrycka exogena DNA-plasmider i litet antal optiska neuroner, microinjicera vi en DNA/lipofection reagens blandningen i eyebud primordia av en dag gamla Xenopus embryon, med hjälp av en teknik som först utvecklades i laboratoriet för Christine Holt att studera Optic Axon pathfinding i unga grodyngel9,10,19,20,21. Vi och andra har också tillämpat denna DNA microinjection/lipofektion teknik för att studera molekylära mekanismer som reglerar optisk Axon arborization i äldre intakt, Living X. laevis grodyngel5,6, 7 , 8. Detta billigt, enkelt förfarande för övergående, cellspecifika transgenes tillåter bestämning av cell-autonom genfunktion för att utveckla optiska axonala arbors i ett levande ryggradsdjur modellsystem.
Det finns flera viktiga faktorer att överväga för bästa praxis när microinjicera DNA/DOTAP i ögonknoppar av Xenopus embryon. För det första bör DNA-koncentrationen, såsom anges i andra rapporter, vara större än 1 μg/μl9,10. DNA-koncentrationer mellan 1 − 3 μg/μL är bäst, men DNA-koncentrationer så låga som 0,7 μg/μL kan också användas. För det andra, microinjicera DNA i steg 22 − 24 Xenopus embryon är optimalt för experiment där målet är att undersöka mekanismer som reglerar optisk axonal arborization. I embryon i dessa utvecklingsstadier är ögonknoppar morfologiskt åtskilda och kan lättare riktas mot injektion14. De flesta optiska nervceller i eyebud primordia av Stage 22 − 24 embryon är också post-mitotiska, vilket resulterar i ett mindre antal optiska nervceller som uttrycker GFP, vilket i sin tur möjliggör bättre upplösning vid avbildning individuell GFP optisk axonal arbors i grodyngel. Slutligen, tidigare studier har visat att exogena gener uttrycks ~ 8 h efter lipofection9. Därför, uttrycker gen konstruktioner i ögonknoppar av Stadium 22 − 24 embryon innebär att generna kommer stör varken cell öde val av optiska nervceller eller den initiala utväxt av deras axoner. En tredje faktor som kommer att säkerställa framgång när microinjicera DNA i Xenopus embryo eyebuds är att DNA ska injiceras i en relativt ytlig region av eyebud9,10. Injicera i mer djupa vävnader i eller runt ögonknoppen kommer att resultera i en lägre andel av embryon som innehåller optiska nervceller som uttrycker den EXOGEN DNA10.
Det finns också flera frågor att vara medveten om när Imaging och rekonstruera GFP uttrycker optiska axonala arbors i intakt, levande Xenopus grodyngel. Först bör forskarna bara fånga bilder av tectal halvklot som innehåller mellan en till tre GFP uttrycker optiska axonala arbors. Om en enda bild innehåller mer än tre GFP uttrycker optiska axonala arbors, det arbors kommer sannolikt att ha överlappande grenar, vilket kommer att göra det svårt att definiera de enskilda arbors under återuppbyggnadsprocessen. En annan fråga att vara medveten om är att återuppbyggnaden och kvantifiering av optisk axonal Arbor morfologi är de mest tidskrävande stegen i detta protokoll. Vi uppskattar att rekonstruera och kvantifiera optisk axonal Arbor morfologi kräver cirka 80 − 90% av den totala tiden för experimentet. Även om tekniker har utvecklats för att automatisera återuppbyggnaden av tectal neuron dendritiska arbors, dessa beräkningsmetoder har ännu inte tillämpats på optiska axonala arbors samt22. Även mödosamt, processen att rekonstruera optisk berså morfologi ökar dramatiskt forskarnas förståelse av detaljerna i optisk axonal berså morfologi. Denna extra detalj, i sin tur avsevärt förbättrar kvaliteten på bilder av GFP uttrycker arbors dessa forskare kan fånga i framtida experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Touro University California College of Osteopatisk medicin för att stödja vår forskning. Vi erkänner tidigare studenter i laboratoriet (Esther Wu, Gregory peng, taegun Jin, John lim) som hjälpte till att genomföra denna görs teknik i vårt laboratorium. Vi är tacksamma för Dr Christine Holt, i vars laboratorium denna DNA microinjection/lipofection teknik i Xenopus embryon utvecklades först.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
