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Bioengineering

Tono basale biassiale e test passivi del sistema riproduttivo Murine utilizzando un miografo a pressione

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/60125
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Tulane University

Summary

Questo protocollo utilizzava un sistema miografo a pressione disponibile in commercio per eseguire test miografici di pressione sulla vagina murina e sulla cervice. Utilizzando i media con e senza calcio, i contributi del tono basale delle cellule muscolari lisce (SMC) e della matrice extracellulare passiva (ECM) sono stati isolati per gli organi in condizioni fisiologiche stimate.

Abstract

Gli organi riproduttivi femminili, in particolare la vagina e la cervice, sono composti da vari componenti cellulari e da una matrice extracellulare unica (ECM). Le cellule muscolari lisce presentano una funzione contrattile all'interno delle pareti vaginali e cervicali. A seconda dell'ambiente biochimico e della distensione meccanica delle pareti dell'organo, le cellule muscolari lisce alterano le condizioni contrattili. Il contributo delle cellule muscolari lisce in condizioni fisiologiche al basale è classificato come un tono basale. Più specificamente, un tono basale è la costrizione parziale della linea di base delle cellule muscolari lisce in assenza di stimolazione ormonale e neurale. Inoltre, l'ECM fornisce supporto strutturale per le pareti degli organi e funziona come serbatoio per segnali biochimici. Questi segnali biochimici sono vitali per varie funzioni degli organi, come incitare la crescita e mantenere l'omeostasi. L'ECM di ogni organo è composto principalmente da fibre di collagene (per lo più tipi di collagene I, III e V), fibre elastiche e glicosaminoglicani/proteoglicani. La composizione e l'organizzazione dell'ECM dettano le proprietà meccaniche di ogni organo. Un cambiamento nella composizione ECM può portare allo sviluppo di patologie riproduttive, come prolasso dell'organo pelvico o rimodellamento cervicale prematuro. Inoltre, i cambiamenti nella microstruttura e rigidità dell'ECM possono alterare l'attività delle cellule muscolari lisce e il fenotipo, con conseguente perdita della forza contrattile.

In questo lavoro, i protocolli riportati vengono utilizzati per valutare il tono basale e le proprietà meccaniche passive della vagina murina non incinta e della cervice a 4-6 mesi di età in estro. Gli organi sono stati montati in un miografo a pressione disponibile in commercio ed è stato eseguito sia il diametro della pressione che i test di lunghezza della forza. Sono inclusi dati di esempio e tecniche di analisi dei dati per la caratterizzazione meccanica degli organi riproduttivi. Tali informazioni possono essere utili per la costruzione di modelli matematici e per progettare razionalmente interventi terapeutici per le patologie della salute delle donne.

Introduction

La parete vaginale è composta da quattro strati, l'epitelio, la mina propria, muscularis, e l'avvento. L'epitelio è composto principalmente da cellule epiteliali. La propriala ha una grande quantità di fibre di collagene elastico e fibrillare. Il muscolo è anche composto da elastina e fibre di collagene, ma ha una maggiore quantità di cellule muscolari lisce. L'avventtia è costituita da elastina, collagene e fibroblasti, anche se in concentrazioni ridotte rispetto agli strati precedenti. Le cellule muscolari lisce sono di interesse per i gruppi di ricerca motivati biomeccanicamente in quanto svolgono un ruolo nella natura contrattile degli organi. Come tale, quantificare la frazione di area della cellula muscolare liscia e l'organizzazione è fondamentale per comprendere la funzione meccanica. Indagini precedenti suggeriscono che il contenuto muscolare liscio all'interno della parete vaginale è organizzato principalmente nell'asse circonferenziale e longitudinale. L'analisi istologica suggerisce che la frazione dell'area muscolare liscia è di circa il 35% per entrambe le sezioni prossimali e distali della parete1.

La cervice è una struttura altamente collagenosa, che fino a poco tempo fa, si pensava avesse un minimo contenuto di cellule muscolari lisce2,3. Recenti studi, tuttavia, hanno suggerito che le cellule muscolari lisce possono avere una maggiore abbondanza e ruolo nella cervice4,5. La cervice presenta un gradiente di cellule muscolari lisce. L'os interno contiene 50-60% cellule muscolari lisce in cui l'os esterno contiene solo 10%. Gli studi sui topi, tuttavia, riportano la cervice da compostare da cellule muscolari lisce 10-15% e tessuto connettivo fibroso 85-90% senza menzione delle differenze regionali6,7,8. Dato che il modello murino differisce dal modello umano frequentemente riportato, sono necessarie ulteriori indagini riguardanti la cervice del topo.

Lo scopo di questo protocollo era quello di chiarire le proprietà meccaniche della vagina murina e della cervice. Ciò è stato ottenuto utilizzando un dispositivo miografo a pressione che consente la valutazione delle proprietà meccaniche nelle direzioni circonferenziali e assiali contemporaneamente, pur mantenendo le interazioni nativo della matrice cellulare e la geometria dell'organo. Gli organi erano montati su due cannule personalizzati e fissati con suture 6-0 di seta. Sono stati eseguiti test di diametro della pressione intorno all'allungamento assiale fisiologico stimato per determinare la conformità e la modulitangente9. Sono stati condotti test di lunghezza della forza per confermare l'allungamento assiale stimato e per garantire che le proprietà meccaniche siano state quantificate nella gamma fisiologica. Il protocollo sperimentale è stato eseguito sulla vagina murina e sulla cervice murine non incinta a 4-6 mesi di età in estrus.

Il protocollo è suddiviso in due sezioni di test meccanici principali: tono basale e test passivo. Un tono basale è definito come la costrizione parziale della linea di base delle cellule muscolari lisce, anche nelle assenze di stimolazione locale, ormonale e neurale esterna10. Questa natura contrattile di base della vagina e della cervice produce comportamenti meccanici caratteristici che vengono poi misurati dal sistema miografo a pressione. Le proprietà passive vengono valutate rimuovendo il calcio intercellulare che mantiene lo stato di base della contrazione, con conseguente rilassamento delle cellule muscolari lisce. Nello stato passivo, le fibre di collagene ed elastina forniscono i contributi dominanti per le caratteristiche meccaniche degli organi.

Il modello murino è ampiamente utilizzato per studiare le patologie nella salute riproduttiva delle donne. Il mouse offre diversi vantaggi per quantificare le relazioni in evoluzione tra ECM e le proprietà meccaniche all'interno del sistema riproduttivo11,12,13,14. Questi vantaggi includono cicli estistici brevi e ben caratterizzati, costi relativamente bassi, facilità di movimentazione e un tempo gestazionale relativamente breve15. Inoltre, il genoma dei topi da laboratorio è ben mappato e i topi geneticamente modificati sono strumenti preziosi per testare ipotesi meccanicistiche16,17,18.

I sistemi miografici a pressione disponibili in commercio sono ampiamente utilizzati per quantificare le risposte meccaniche di vari tessuti e organi. Alcune strutture notevoli analizzate sul sistema miografo a pressione includono arterie elastiche19,20,21,22, vene e innesti vascolari ingegnerizzati su tessuti23,24, l'esofago25, e l'intestino crasso26. La tecnologia del miografo a pressione consente la valutazione simultanea delle proprietà nelle direzioni assiali e circolari, mantenendo al contempo le interazioni cell-ECM native e la geometria in vivo. Nonostante l'ampio uso di sistemi miografici nella meccanica dei tessuti molli e degli organi, un protocollo che utilizzava la tecnologia del miografo a pressione non era stato precedentemente sviluppato per la vagina e la cervice. Precedenti indagini sulle proprietà meccaniche della vagina e della cervice sono state valutate uniaxially27,28. Questi organi, tuttavia, sperimentano il carico multiassiale all'interno del corpo29,30, quantificando così la loro risposta meccanica biassiale è importante.

Inoltre, recenti lavori suggeriscono che le cellule muscolari lisce possono svolgere un potenziale ruolo nelle patologie dei tessuti molli5,28,31,32. Questo fornisce un'altra attrazione nell'utilizzare la tecnologia miografica a pressione, in quanto conserva le interazioni nativo cellula-matrice, permettendo così la delineazione del contributo che le cellule muscolari lisce giocano in fisiologica e patologica Condizioni. Qui, proponiamo un protocollo per quantificare le proprietà meccaniche multiassiali della vagina e della cervice sia in condizioni di tono basale che passive.

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Protocol

Nulliparous 4-6 mesi trici C57BL6J topi (29.4 - 6.8 grammi) a estrus sono stati utilizzati per questo studio. Tutte le procedure sono state approvate dall'Institute Animal Care and Use Committee della Tulane University. Dopo la consegna, i topi si sono acclimatati per una settimana prima dell'eutanasia e sono stati alloggiati in condizioni standard (cicli di luce/buio di 12 ore).

1. Sacrificio del topo a estrus

  1. Determinare il ciclo esrous: Il ciclo esrous è stato monitorato dalla valutazione visiva in conformità agli studi precedenti15,33,34. Il ciclo esrous è costituito da quattro fasi: proestrus, estrus, metestrus e diestrus. Durante la fase proestrus i genitali sono gonfi, rosa, umidi e rugosi. La fase estrus è rugosa ma meno gonfia, rosa e umida. Metestrus e diestrus sono entrambi segnalati come non esibiscono gonfiore e rugosità, privo di una tonalità rosa, e secco34,35.
  2. Eseguire esperimenti su estrus: tutti i test meccanici sono stati eseguiti mentre i topi erano a estrus, in quanto questo è il più facile da visualizzare e fornisce un timepoint coerente e ripetibile.
  3. Per i topi sottoposti a test del tono basale, eutanasia tramite ghigliottina. Per i topi testati solo in condizioni passive,eutanasia con inalazione di biossido di carbonio (CO 2). La ghigliottina serve a preservare la funzione delle cellule muscolari lisce del tratto riproduttivo, poiché il gas CO2 altera le proprietà contrattuali delle cellule muscolari lisce36,37,38, 39,40,41,42. È imperativo eseguire la dissezione entro 30 minuti per ridurre al minimo la possibilità di apoptosi cellulare.

2. Dissezione del sistema riproduttivo

  1. Configurazione: posizionare un pad assorbente sulla stazione di lavoro e riempire un piatto Petri e una siringa con la soluzione HBSS (Balanced Salt Solution) a 4 gradi centigradi. Utilizzare una salvietta per lo smaltimento dei tessuti adiposi. Posizionare il lato ventrale del topo verso l'alto e nastro adesivo le zampe e la coda. Accendere le luci del microscopio e impostare micro-forbici, forbici, due paia di pinzette dritte e due paia di pinzette curve.
  2. Utilizzando pinzette angolari e forbici, sollevare la pelle intorno all'addome e fare un'incisione alla base dell'addome, sopra l'osso pubico. L'incisione dovrebbe essere abbastanza superficiale da non forare la parete muscolare addominale. Continuare a utilizzare le forbici per tagliare in modo superiore verso la gabbia toracica e in profondità attraverso i muscoli addominali.
  3. Rimuovere il grasso superficiale tirando leggermente sul grasso con le pinzette curve e micro-forbici. Il tessuto adiposo rifletterà la luce eterogeneamente con un aspetto simile a quello degli scintillii. Mettere tutto il grasso e il tessuto rimossi sulla salvietta. Identificare sia le corna uterine che l'osso pubico.
  4. Posizionare le forbici chiuse tra la parete vaginale e l'osso pubico. Tagliare con cura il centro dell'osso pubico (simfisi pubica). Posizionare le pinzette curve su entrambe le estremità dell'osso pubico tagliato. Tirare entrambe le estremità tagliate lateralmente per consentire un migliore accesso agli organi riproduttivi.
  5. Rimuovere la vescica e l'uretra dalla parete vaginale. Questo può essere fatto utilizzando pinzette dritte e micro-forbici. Tenere la vescica con una pinzetta dritta per creare tensione e utilizzare tecniche di dissezione smussata per separare il tessuto circostante dalla vagina. Una volta che la vescica e l'uretra sono sezionati via, tagliare la base e rimuovere dalla cavità del corpo.
  6. Identificare il sistema riproduttivo: le corna uterine biforcate dalla cervice. La cervice può essere identificata dalla vagina a causa di differenze di geometria e rigidità. Il diametro esterno della cervice è più piccolo della vagina. La cervice è più rigida della vagina e si sente simile a quella di un tallone (Figura 1).
  7. Utilizzare inchiostro e pinze per contrassegnare 3 punti mm lungo gli organi. Iniziare sotto le ovaie sui tubi uterini e contrassegnare i punti in modo inferiore per raggiungere la cervice. Utilizzare il punto della cervice centrale per iniziare un percorso punto verso il basso per l'introito vagina.
  8. Lasciare asciugare l'inchiostro e separare gli organi riproduttivi dal tessuto adiposo circostante, dal tessuto connettivo e dal colon. Pulire la vagina il più vicino possibile all'introitus vaginale. Utilizzando le forbici, tagliare intorno all'introito vaginale.
    NOTA: Durante questo processo è possibile che gli organi si asciughino. Se questa è una preoccupazione, una siringa riempita con HBSS a 4 gradi centigradi può essere utilizzata per aggiungere umidità agli organi.
  9. Tagliare le corna uterine immediatamente inferiori alle ovaie. Si noti che gli organi si ritrarranno dalla lunghezza dell'espianto del post come il tessuto connettivo viene rimosso e l'organo si ritrae. Collocare gli organi riproduttivi sezionati in un piatto di Petri riempito con 4 gradi centigradi. Questa variazione di lunghezza può essere utilizzata per calcolare la lunghezza stimata in vivo (sezione 5).
    NOTA: Abbiamo identificato che l'utilizzo di HBSS a questa temperatura durante la dissezione e la cannulation non influisce sulla fattibilità liscia delle cellule muscolari. Mantenere un pH di 7.4, tuttavia, è imperativo per mantenere la vitalità delle cellule muscolari lisce. A questa temperatura, l'HBSS ha un livello di pH di 7,4.
  10. Dopo un periodo di equilibratore di 15 minuti in HBSS a 4 gradi centigradi, misurare lo spazio tra i punti utilizzando le pinze. Registrare le misure per ogni distanza in un foglio di calcolo. Questi valori verranno utilizzati per calcolare il rapporto di stiramento in vivo (lunghezza originale/lunghezza espulsa).
  11. Impostare la salvietta che contiene il tessuto scartato sulla regione addominale con il tessuto in eccesso rivolto verso l'interno del topo e immergere la salvietta in 4 gradi centigradi. Avvolgere il topo e il tessuto in eccesso in un foglio e mettere in un sacchetto sicuro congelatore per essere conservato a -20 gradi centigradi. Il comportamento meccanico passivo sulla vagina non è stato trovato per essere significativamente diverso dopo un ciclo di congelamento-disgelo43. Tutti gli organi testati sono stati utilizzati immediatamente dopo l'eutanasia o dopo un ciclo di congelamento-scongelamento.

3. Cannulating

  1. Determinare la dimensione corretta della cannula per il tipo di organo. In un tipico topo C57BL6J, la vagina utilizza cannule di 3,75 mm di diametro e rivettate. La cervice utilizza una cannula che è 3,75 mm per l'estremità vaginale e una cannula di 0,75 mm di diametro per l'estremità uterina (Figura 2) La cannula 0,75 mm è liscia.
    NOTA: Le dimensioni del diametro indicate sopra sono utilizzate per i tipici topi C57BL6 nulliparous 4-6 mesi, C57BL6 x 129SvEv e i mouse non pariferi di età compresa tra 7-9 mesi. Tuttavia, alcune circostanze, come il prolasso o la gravidanza, possono richiedere una cannula di dimensioni maggiori.
  2. Ad ogni organo, montare il lato cervicale sulla porzione del trasduttore di forza del dispositivo di cannolazione. Montare l'estremità opposta dell'organo (vaginale o uterina) sulla porzione micrometrica del dispositivo. Stringere entrambe le estremità con suture.
  3. A causa della differenza di spessore e grado di contrattilità tra la vagina e la cervice, possono essere utilizzate tecniche variabili per eseguire la canonatura più efficace. Per la vagina, mettere 2 suture tra i rivetti 2nd e 3rd della cannula in modo "X". Quando si puònulare la cervice, la cannula non è rivettata in modo che l'organo è meglio posizionato sul retro della cannula con 3 suture orizzontali sull'estremità uterina e 4 suture sull'os esterno. Per entrambi gli organi, la lunghezza massima non deve essere superiore a 7 mm tra le suture (Figura 3).

4. Miografo a pressione

  1. Per impostare il sistema di miografo a pressione, accendere il sistema di prova e riempire la bottiglia del serbatoio con 200 mL di HBSS (Figura 4). Accendere il calore e lasciare che l'HBSS nella bottiglia del serbatoio si scaldi. Quindi, accendere il microscopio e aprire il programma per computer. Assicurarsi che l'immagine dell'organo cannulato, l'interfaccia di pressione, le letture del misuratore di flusso e lo strumento funzione sequencer siano tutti visibili (Figura 5).

5. Prove meccaniche di tono Basal

NOTA: La cervice ha mostrato una natura fasica durante le fasi iniziali del test. Tuttavia, questo è diminuito dopo il precondizionamento. Il test del tono basale viene eseguito utilizzando Krebs Ringer Buffer (KRB) nel bacino del dispositivo DMT. Il buffer è aerato con 95% O2 e 5% CO2. Dopo che la porzione di tono basale è completa, viene utilizzato il KRB senza calcio.

  1. Trovare la geometria scaricata: allungare l'organo in modo che la parete non sia in tensione. Per la vagina, osservare le scanalature sulla parete vaginale. Per la cervice, tagliare immediatamente sotto i punti di inchiostro che si trovano sopra e sotto il segno della cervice centrale. Questo escogita un metodo ripetibile per una cervicale in lunghezza situ di 6 mm44. Misurare la lunghezza dalla sutura alla sutura con le pinze
  2. Trovare la pressione scaricata (UP): aumentare la pressione da 0 a 10 mmHg in incrementi di 1 mmHg. Determinare la pressione in cui l'organo non è più collassato. Questo può essere determinato come il salto più grande nel diametro esterno ad una determinata pressione, come indicato sul monitor del programma. Dopo aver registrato la pressione e il diametro esterno, notare questo come il primo punto in cui l'organo non è collassato e azzerare la forza.
  3. Stimato in vivo stretch: Calcolare il tratto stimato in vivo dividendo la lunghezza misurata in vivo per la lunghezza misurata dopo l'espianto:
    Equation 1
  4. Pre-condizionamento del diametro della pressione: impostare la pressione suEquation 20 mmHg, la lunghezza sulla lunghezza in vivo stimata e il gradiente su 1,5 mmHg/s. Eseguire una sequenza che porta la pressione da 0 mmHg alla pressione in vivo , scaricata (Tabella 1), tenere premuto per 30 secondi, e prendere la pressione a 0 mmHg con un periodo di attesa di 30 secondi. Dopo aver ripetuto per un totale di 5 cicli, premere Stop nel programma per computer e salvare il file.
  5. Trovare l'allungamento sperimentale in vivo: regolare l'organo in modo che sia stimato in vivo mentre è alla pressione scaricata e premere Start. Valutare i valori di pressione rispetto alla forza per i valori di pressione che vanno dalla pressione scaricata alla pressione massima (tabella1). Premere il pulsante Stop nel programma per computer e salvare il file.
    NOTA: il valore di stiramento misurato viene calcolato in situ. Questo è accompagnato dalla limitazione che può essere misurata solo dopo aver disarticolato la sinfisi pubica. Di conseguenza, il tethering naturale viene perso, che può modificare la lunghezza. Il tratto teorico, tuttavia, si basa sulla teoria precedentemente introdotta che l'organo sperimenterà cambiamenti minimi in vigore quando esposto a pressioni fisiologiche per risparmiare energia45. Nel protocollo, l'allungamento misurato in vivo sarà il valore di stiramento calcolato utilizzando la lunghezza identificata sperimentalmente in cui vi è un minimo cambiamento di forza quando esposto a una gamma fisiologica di pressioni.
  6. Pre-condizionamento del diametro della pressione: impostare la pressione su 0 mmHg, la lunghezza sulla lunghezza in vivo sperimentale e il gradiente di 1,5 mmHg/s. Eseguire una sequenza che porta la pressione da 0 mmHg alla pressione massima , UP , tenere premuto per 30 secondi e tornare a 0 mmHg con un annuncio periodo di attesa di 30 secondi. Dopo aver ripetuto questo per un totale di 5 cicli, premere il pulsante Stop nell'interfaccia del programma e salvare il file.
    NOTA: 5.4 è fondamentale per ottenere una lettura della forza assiale più coerente con una pressione crescente. Questo passaggio aiuta a trovare il corretto tratto in vivo, che viene spesso sottovalutato in base ai segnali visivi. 5.6 serve come passo precauzionale per ridurre al minimo l'isteresi e per ottenere una risposta coerente, ripetibile, matematicamente interpretabile dell'organo.
  7. Pre-condizionamento della lunghezza della forza: immettere una pressione massima di 1/3, ovvero UP, sia per la pressione di ingresso che per la pressione di uscita. Regolare l'organo a -2% della lunghezza in vivo e premere Inizio. Regolare la lunghezza al 2% in vivo, quindi scendere di nuovo a -2% a 10 m/s. Ripetere l'estensione assiale per un totale di 5 cicli. Premere Stop nel programma del computer e salvare il file.
  8. Equilibration: Con l'organo alla lunghezza in vivo determinata, impostare sia la pressione di inserizione che di uscita a 1/3 della pressione massima: UP. Equilibrate l'organo per 10 minuti. Riportare lentamente entrambe le pressioni a 0 mmHg con il gradiente impostato come 1,5 mmHg/s.
  9. Rivalutare la geometria scaricata: impostare l'organo sulla lunghezza in vivo e la pressione sulla pressione scaricata. Diminuire la lunghezza assiale verso la lunghezza scaricata stimata ad una velocità di 10 m/s fino a quando non vi è un minimo cambiamento nella forza. Questa lunghezza corrispondente è nota come lunghezza scaricata, o dove l'organo non è in tensione né compressione. Prima di azzerare la forza, registrare la lunghezza scaricata, il diametro esterno e il valore di forza.
    NOTA: la geometria scaricata prima è stata determinata da segnali visivi, che è puramente qualitativa. È necessaria una nuova valutazione per un metodo quantitativo e per tenere conto delle possibili variazioni di lunghezza che possono verificarsi durante il precondizionamento. Questa geometria verrà utilizzata nella sezione 8.
  10. Configurazione ad ultrasuoni: utilizzare il pacchetto addominale di imaging generale per visualizzare gli organi nel dispositivo di test. (Figura 6). Prima di eseguire il test, ridurre al minimo gli artefatti dal fondo del bacino metallico del miografo a pressione. Regolare la cannula ad un'altezza che è la distanza massima dal fondo con il tessuto ancora completamente immerso nella soluzione di test. Un supporto personalizzato viene stampato in 3D per stabilizzare il trasduttore in posizione verticale durante l'imaging.
  11. Imaging ad ultrasuoni: Identificare la cannula vicino al trasduttore di forza e regolare lo stadio del microscopio per l'immagine lungo la lunghezza del tessuto. Durante tutto il processo di test, viene tenuta traccia dell'area centrale lungo la lunghezza (Figura 6A,C). Dopo aver imaging, esaminate il loop dell'immagine "Cine store" costituito da una serie di fotogrammi in modalità B e identificate il fotogramma con il diametro esterno più grande. I calcoli di spessore effettuati verranno utilizzati nella sezione 8.
  12. Test del diametro della pressione (-2% in lunghezza vivo): premere Inizio e regolare l'organo in modo che sia -2% della lunghezza in vivo, impostare la pressione su 0 mmHg e gradiente a 1,5 mmHg/s. Aumentare la pressione da 0 mmHg alla pressione massima. Riportare la pressione a 0 mmHg con un periodo di attesa di 20 secondi. Ripetere l'operazione per 5 cicli.
  13. Test del diametro della pressione (lunghezza in vivo): premere Inizio e regolare l'organo in modo che sia a lunghezza in vivo, impostare la pressione su 0 mmHg e il gradiente su 1,5 mmHg/s. Aumentare la pressione da 0 mmHg alla pressione massima. Riportare la pressione a 0 mmHg con un periodo di attesa di 20 secondi. Ripetere l'operazione per 5 cicli.
  14. Test del diametro di pressione (lunghezza in vivo del diametro della pressione): regolare l'organo in modo che sia di lunghezza in vivo del 2%, impostare la pressione su 0 mmHg e il gradiente su 1,5 mmHg/s. Aumentare la pressione da 0 mmHg alla pressione massima e quindi di nuovo verso il basso fino a 0 mmHg con un periodo di attesa di 20 secondi. Ripetere l'operazione per 5 cicli. I dati di pressione di tutte e tre le lunghezze saranno utilizzati nella sezione 8.
  15. Test di lunghezza della forza (pressione nominale): impostare la pressione sulla pressione scaricata e l'organo su -2% della lunghezza in vivo. Allungare l'organo fino a un 2% della lunghezza in vivo e tornare a -2% la lunghezza in vivo alla velocità di 10 m/s. Ripetere per un totale di 3 cicli.
  16. Test di lunghezza della forza (1/3 pressione massima - UP): Impostare la pressione su 1/3 della pressione massima : UP e regolare l'organo a -2% della lunghezza in vivo. Dopo aver premuto Start, allungare l'organo fino a ottenere il 2% della lunghezza in vivo e di nuovo a -2% la lunghezza in vivo ad una velocità di 10 m/s. Dopo aver ripetuto per un totale di 3 cicli, premere Stop e salvare i dati.
  17. Test di lunghezza della forza (pressione massima 2/3 - UP): Impostare la pressione su 2/3 della pressione massima : UP e regolare l'organo a -2% della lunghezza in vivo. Premere Start e allungare l'organo fino a ottenere il 2% della lunghezza in vivo e di nuovo a -2% la lunghezza in vivo ad una velocità di 10 m/s. Dopo aver ripetuto per un totale di 3 cicli, premere Stop e salvare i dati.
  18. Test di lunghezza massima (pressione massima e UP): Impostare la pressione sulla pressione massima - UP e regolare l'organo a -2% la lunghezza in vivo. Ad una velocità di 10 m/s, allungare l'organo fino al 2% della lunghezza in vivo e di nuovo a -2% la lunghezza in vivo. Dopo aver ripetuto per un totale di 3 cicli, salvare i dati. Tutti i dati di forza saranno utilizzati nella sezione 8.
  19. Rimuovere i supporti di prova KRB e lavare con KRB privo di calcio. Sostituire i supporti con una soluzione KRB gratuita gratuita con 2 mM EGTA. Incubare il tessuto per 30 minuti. Rimuovere la soluzione e sostituire i supporti con KRB fresco privo di calcio.

6. Prove meccaniche passive

NOTA: se si inizia con il test passivo, iniziare dal passaggio 1. Se il test del tono basale è stato eseguito prima dell'avvio passivo al passaggio 6. Se si inizia con il tessuto congelato, lasciare un periodo di acquisimento di 30 minuti a temperatura ambiente prima di cannulare l'organo.

  1. Trovare la geometria scaricata: Allungare l'organo in modo che la parete dell'organo non sia in tensione. Misurare l'organo cannulato dalla sutura alla sutura e registrarlo come lunghezza scaricata.
  2. Trovare la pressione scaricata: Dopo aver premuto Start, aumentare la pressione da 0 a 10 mmHg in incrementi di 1 mmHg. Durante l'esecuzione di questo processo, determinare la pressione in cui l'organo non è in tensione. Utilizzando il monitor del programma per computer, questo può essere determinato dal salto più grande nel diametro esterno. Dopo aver acerato la forza, registrare questa pressione così come il diametro esterno e notare questo come il primo punto in cui l'organo non è collassato.
  3. Stimato in vivo stretch: Calcolare il tratto stimato in vivo dividendo la lunghezza misurata in vivo per la lunghezza misurata dopo l'espianto.
  4. Pre-condizionamento del diametro della pressione: dopo aver premuto Start, impostare la pressione impostata su 0 mmHg, la lunghezza come stimata in lunghezza in vivo e gradiente su 1,5 mmHg/s. Iniziare l'esecuzione di una sequenza che porta la pressione da 0 mmHg alla pressione massima e di nuovo a 0 Mmhg. Ripetere questo processo per 5 cicli con un tempo di attesa di 30 secondi.
  5. Precondizionamento della lunghezza della forza: regolare l'organo in base alla lunghezza in vivo e inserire manualmente la pressione scaricata nel programma informatico per entrambe le pressioni. Dopo aver premuto Start, impostare il gradiente su 2 mmHg e la pressione su 1/3 del massimo. Allungare l'organo fino al 2% e scendere fino a -2% allungare a 10 m/s. Ripetere questo ciclo per un totale di 5 volte e premere Stop.
  6. Trovare la lunghezza in vivo sperimentale: trova e trama i valori della forza al -2% della lunghezza in vivo, la lunghezza in vivo e il 2% della lunghezza in vivo. Prendere le forze a pressioni equidistanti che vanno da 0 mmHg alla pressione massima. Il tratto sperimentale in vivo sarà il valore di tratto che presenta una linea relativamente piatta su una gamma di pressioni.
  7. Ripetere il diametro della pressione e i passaggi di precondizionamento assiali alla nuova lunghezza in vivo.
  8. Equilibration: Con l'organo alla lunghezza determinata in vivo, impostare la pressione di uscita e uscita alla pressione di scarico. Lasciare che l'organo riequilici per 15 minuti. Dopo 15 minuti, portare lentamente la pressione di presa e uscita fino a 0 mmHg.
  9. Rivalutare la configurazione scaricata: portare l'organo alla lunghezza scaricata e rivalutare la lunghezza scaricata. Registrare la lunghezza scaricata e il diametro esterno mentre la pressione è di 0 mmHg, la pressione scaricata e 1/3 la pressione massima. Azzerare la forza alla pressione scaricata. Il diametro alla pressione scaricata è il diametro in vivo.
    NOTA: La rivalutazione della lunghezza scaricata è necessaria in quanto in precedenza sono state osservate piccole deformazioni plastiche nei tessuti biologici molli a seguito del precondizionamento. Questa configurazione scaricata sarà quella utilizzata nella sezione 8.
  10. Ultrasuoni: Eseguire l'imaging in modalità B ad ultrasuoni alla lunghezza e alla pressione scaricate.
  11. Test di diametro della pressione: con l'organo al -2% della lunghezza in vivo determinata sperimentalmente e la pressione a 0 mmHg, premere Start. Aumentare la pressione da 0 mmHg alla pressione massima e di nuovo a 0 mmHg. Tenere il gradino 2-0 mmHg per 20 secondi. Dopo aver ripetuto per un totale di 5 volte, premere il pulsante Stop nell'interfaccia e salvare il file.
    NOTA: Ripetere la ripetizione alla lunghezza in vivo sperimentale, pari al 2% della lunghezza in vivo sperimentale.
  12. Test di lunghezza della forza: impostare la pressione su pressione nominale e regolare l'organo al -2% della lunghezza in vivo. Allungare l'organo fino al 2% della lunghezza in vivo e tornare al -2% della lunghezza in vivo ad una velocità di 10 m/s. Dopo aver ripetuto per un totale di 3 volte, salvare i dati. Ripetere questa operazione per una pressione massima di 1/3, una pressione massima di 2/3 e la pressione massima.
  13. Calcolare lo spessore scaricato dalle immagini a ultrasuoni immagine in modalità B. Utilizzando il software di imaging, tracciare una linea per indicare la profondità di penetrazione. Impostare la scala sulla lunghezza della linea (ad esempio, 2000 m come illustrato nella figura 6B e 6D).
  14. Calcoli dello spessore della parete: Utilizzando un software per computer, tracciano e misurano il diametro interno ed esterno dell'organo. Quindi, disegnare e misurare una linea tra i diametri. Disegnare un totale di 25 linee trastralorote. Media di tutti i punti dati e ripetere per un totale di 3 volte.

7. Pulire

  1. Assicurarsi che la pressione sia di 0 mmHg e spenta. Chiudere l'ingresso principale e l'uscita per entrambe le valvole a tre vie. Aspirare il liquido rimanente dal bacino del dispositivo di cannulation.
  2. Rimuovere l'organo dal palco e riempire la bottiglia serbatoio con acqua deionizzata. Utilizzando una siringa, sciacquare la cannula con acqua. Collegare il tubo per bypassare la cannula.
  3. Ruotare la pressione e il flusso, impostare la pressione di ingresso a 200 mmHg, la pressione di uscita a 0 mmHg, sfumare a 10 mmHg/s, e lasciare che il flusso eseguano per 5 minuti. Lasciare che il sistema a funzionare mentre la bottiglia del serbatoio è vuota e lasciare che l'aria esaurisca per 5 minuti o fino a quando le linee sono asciutte.

8. Analisi dei dati

  1. Per il test del diametro della pressione, raccogliere i dati da dove la pressione inizia ad aumentare dal valore minimo fino al massimo. Per i test di lunghezza della forza, raccogliere i dati da appena al di sotto del picco massimo in vigore fino a quando la forza ha smesso di diminuire.
  2. Aprire il file di dati per ogni test di diametro della pressione e selezionare la scheda della pressione media. Passare all'area di carico dell'ultima curva, 0 mmHg alla pressione massima, e rilasciare i dati in un foglio di calcolo. Selezionare la stessa regione sul diametro esterno, la pressione di ingresso, la pressione di uscita, la forza, la temperatura, il pH e la scheda di flusso posizionando ciascun elemento nello stesso documento.
  3. Aprire i dati per ogni test di lunghezza della forza. Passare all'area di caricamento della curva, dal -2% al 2%, e trascinare i dati in un foglio di calcolo. Selezionare la stessa area per le altre variabili misurate e posizionare ogni elemento nello stesso foglio di calcolo.
  4. Per il diametro della pressione e la lunghezza della forza, sottrarre l'UP da tutti i valori di pressione.
  5. Calcolare la media dei dati sul diametro della pressione ogni 1 mmHg (ad es. 0/- 0,5, 1/-0,5, 2/- 0,5).
  6. Trovare il volume scaricato dell'organo (V). L'equazione 1 può essere utilizzata per trovare V, dato che R02 è il raggio esterno scaricato misurato dal microscopio, L è la lunghezza scaricata e H è lo spessore scaricato rilevato dall'ecografia. L'ipotesi di incomprimibilità è sfruttata, il che significa che l'organo conserva il volume mentre è sottoposto a deformazioni.
    NOTA: La lunghezza scaricata viene misurata con pinze dalla sutura alla sutura. Il diametro scaricato viene misurato al microscopio, alla fotocamera e al software seguito dal calcolo del raggio (Figura 5) Lo spessore scaricato viene calcolato dalle immagini a ultrasuoni (Figura 6).
    Equation 3Equazione 1
  7. Utilizzando l'ipotesi di incomprimibilità, utilizzare il volumeEquation 4scaricato, ilEquation 5raggio esterno deformato ( Equation 6 ) e la lunghezza ( ) per determinare il raggio interno deformato.
    Equation 7Equazione 2
  8. Utilizzare le equazioni 3, 4 e 5 per calcolare ciascuna sollecitazione, rispettivamente. Nelle equazioni 3-5, P è definita come la pressione intraluminale e Ft è la forza misurata dal trasduttore.
    Equation 8Equazione 3
    Equation 9Equazione 4
    Equation 10Equazione 5
  9. Tracciare la relazione pressione-diametro, la relazione forza-pressione, la relazione di stiramento circonferenziale-stress circonferenziale e la sollecitazione assiale e i valori di stiramento circonferenziale (Figura 7, Figura 8). I valori di stiramento possono essere calcolati utilizzando il raggio midwall. Calcoli delle sollecitazioni circonferenziali e assiali possono essere trovati nelle equazioni 6 e 7, rispettivamente.
    Equation 11Equazione 6
    Equation 12Equazione 7
  10. Calcolare la conformità vicino alla gamma di pressione fisiologica e al tratto in vivo. Il limite di pressione inferiore (LPB) è 1 deviazione standard al di sotto della pressione media misurata. Il limite di pressione superiore (UPB) è 1 deviazione standard al di sopra della pressione misurata media9.
    Equation 13
  11. Calcolare la tangente per quantificare il modulo di rigidità del materiale. Identificare la sollecitazione cirferenziale calcolata che corrisponde alla pressione del limite di pressione inferiore e alla pressione del limite superiore. Adattare una linea lineare alla curva di stiramento circonferenziale - sollecitazione circonferenziale all'interno dell'intervallo di sollecitazione identificato alla lunghezza in vivo. Calcolare la pendenza della linea9.

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Representative Results

Un'analisi efficace delle proprietà meccaniche degli organi riproduttivi femminili è subordinata a dissezione, cannolazione e test dell'organo appropriato. È imperativo espiantare le corna uterine alla vagina senza difetti (Figura 1). A seconda del tipo di organo, la dimensione della cannula varierà (Figura 2). La canonazione deve essere fatta in modo che l'organo non possa muoversi durante l'esperimento, ma non danneggiare anche la parete dell'organo durante la procedura (Figura 3). Il fallimento di entrambi i passaggi comporterà l'incapacità della nave di mantenere la pressione. La standardizzazione delle procedure di test è fondamentale per il successo del protocollo al fine di produrre risultati coerenti e ripetibili.

Una volta sezionato l'organo e cannulato correttamente, accendere il sistema miografo a pressione. L'impostazione dei sistemi miografo a pressione comporta un'unità di controllo, un misuratore di flusso e una fase (Figura 4). Il sistema miografo a pressione viene utilizzato per monitorare vari aspetti dell'organo mentre viene sottoposto a test meccanici (Figura 5). Un sistema a ultrasuoni, o equivalente, viene utilizzato per misurare lo spessore degli organi nello stato scaricato con e senza tono basale (Figura 6). Dopo i test meccanici, il modulitangente può essere calcolato per le direzioni circonferenziale e assiale (Tabella2).

Sia il test basale del tono che il test passivo producono le proprietà meccaniche chiave del tratto riproduttivo, con e senza il contributo contrattuale delle cellule muscolari lisce (Figura7, Figura 8). Il ridimensionamento tra gli organi richiede alcune regolazioni ai protocolli (Tabella 1), poiché la cervice e la vagina sperimentano carichi diversi in vivo46-48. Tali variazioni possono essere monitorate attraverso tecniche come la catherizzazione a pressione. La a pressione è un metodo utilizzato in precedenza per monitorare le condizioni in vivo all'interno della vagina e dell'utero49-53. I modelli negli studi precedenti vanno da topi, conigli e umani. Gli stessi principi si applicherebbero in modo simile alla pressione cervicale e vaginale specifica per il modello murino. Tuttavia, indipendentemente dall'organo sottoposto a test, gli stessi materiali sono necessari per i protocolli (Tabella 3).

Figure 1
Figura 1: Diagramma di dissezione di Murine. La dissezione del topo per gli organi riproduttivi: entrambe le corna uterine, la cervice e la vagina. Nella figura, la vescica e l'uretra vengono rimossi dall'anteriore della vagina. L'intestino e i muscoli addominali si riflettevano in modo superiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Confronto delle dimensioni delle due cannula. Confronto di dimensioni delle due cannule utilizzate per la cannulazione degli organi riproduttivi. La cannula più grande (D - 3,75 mm) viene utilizzata per il tessuto vaginale (A). La cannula più piccola (D - 0,75 mm) viene utilizzata per cannulating tessuto cervicale (B). La cannula cervicale è liscia mentre la cannula vaginale ha due scanalature. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Metodo di canonificazione per vagina e cervice. A causa della diversa geometria e spessore degli organi riproduttivi, sono più efficacemente cannulati in modi distinti. Per la vagina, posizionare due suture in modo "X". Quando si puònulare la cervice, posizionare 3 suture orizzontali sull'estremità uterina e 4 suture sul os esterno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Configurazione del dispositivo miografo a pressione. La configurazione del dispositivo DMT utilizzato sia per i test basali che passivi. Il DMT è composto da tre hub principali: lo stage (A), l'unità controller (B) e il misuratore di flusso (C). All'interno dell'unità di controllo, c'è una bottiglia serbatoio e una bottiglia di rifiuti. La bottiglia del serbatoio viene inizialmente riempita con liquido che si svuota durante l'esperimento. La bottiglia di scarto, inizialmente vuota, raccoglie il fluido che attraversa l'esperimento. L'unità di controllo si interfaccia con il software DMT sul computer e controlla la pressione, la temperatura e il flusso. L'unità di controllo legge le uscite dai trasduttori di forza e pressione all'interno dello stage attraverso un cavo di interfaccia VGA. Il componente fase del sistema contiene un flusso di ingresso e presa del sistema. Il flusso di ingresso e uscita hanno pressioni di ingresso e di uscita corrispondenti misurate dal sistema. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Impostazione dei file sul programma miografo a pressione. Visualizzazione della configurazione del software del computer. Una casella viene disegnata intorno alla regione di interesse e il diametro esterno del tessuto viene tracciato otticamente in tempo reale (A). I dati ottenuti durante i test meccanici vengono registrati e visualizzati in tempo reale nel diametro esterno, pressione di ingresso, pressione di uscita, pressione media, forza, temperatura, pH e scheda di flusso (B). All'interno della pressione dell'interfaccia di pressione (mmHg), la pendenza (mmHg/s) e il flusso è controllato. Inoltre, viene visualizzata la forza assiale (mN) misurata dal trasduttore di forza in linea. La velocità di flusso (L/min) è riportata nella scheda del misuratore di flusso (C). La sequenza di pressione viene visualizzata e controllata nella scheda sequencer (D). I dati registrati durante i test meccanici vengono registrati e visualizzati in tempo reale nel diametro esterno, pressione di ingresso, pressione di uscita, pressione media, forza, temperatura, pH e scheda di flusso (E). Un test rappresentativo di diametro della pressione della vagina viene visualizzato mostrando diametro esterno in funzione del tempo sulla scheda di diametro esterno. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Imaging ad ultrasuoni. Imaging ad ultrasuoni degli organi riproduttivi murini. Tutte le immagini sono state scattate utilizzando il sistema a ultrasuoni sulla modalità a breve asse-B. Un'immagine rappresentativa della vagina alla lunghezza e alla pressione scaricate (A). Lo spessore della parete vaginale è stato calcolato in ImageJ. È stata tracciata una linea verticale lungo la scala di profondità (mm) per calibrare il numero di pixel per m. Lo strumento poligono è stato utilizzato per tracciare il diametro interno ed esterno. Quindi sono state disegnate linee transmurali per calcolare lo spessore e la media (B). Questo è stato eseguito 3 volte. Un'immagine rappresentativa della cervice alla lunghezza e alla pressione scaricate (C). Lo spessore della parete è stato quindi calcolato utilizzando l'immagine J e lo strumento poligono in modo simile a quello della vagina (D). All'interno del complesso riproduttivo, il diametro esterno viene tracciato in due posizioni diverse (E). Durante tutto il processo di imaging, il trasduttore è stabilizzato da un supporto stampato 3D (F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Risultati rappresentativi per i test vaginali. I risultati dei test meccanici rappresentativi dei protocolli vaginali basali e passivi. Con i dati ottenuti dal sistema DMT, è possibile derivare diverse relazioni meccaniche. A) Basal Pressure-Diameter, B) Passivo Pressure-Diameter, C) Basal Force-Pressure, D) Passive Force-Pressure, E) Basal circumferenziale stress-circumferenziale stretch, F) Passivo tratto circoferenziale cirferenziale, G) Tratto basale plusale-circonferenzale, H) Tratto passivo assiale-circonferenzale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Risultati rappresentativi per i test cervicali. I risultati dei test meccanici rappresentativi dei protocolli basali e passivi cervicali. Con i dati ottenuti dal sistema DMT, è possibile derivare diverse relazioni meccaniche. A) Basal Pressure-Diameter, B) Passivo Pressure-Diameter, C) Basal Force-Pressure, D) Passive Force-Pressure, E) Basal circumferenziale stress-circumferenziale stretch, F) Passivo tratto circoferenziale cirferenziale, G) Tratto basale plusale-circonferenzale, H) Tratto passivo assiale-circonferenzale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Pressione In Vivo Pressione massima 1/3 Pressione massima 2/3 Pressione massima Allungamento assiale Dimensioni Cannula Numero consigliato
di suture
Vagina 7 mmHg 15 mmHg 5 mmHg 10 mmHg -2%, in vivo, 2% 3,75 mm 2-- in modo "X"
collo dell'utero 10 mmHg 200 mmHg 66 mmHg 133 mmHg -2%, in vivo, 2% 0,75 mm per l'estremità uterina
3,75 mm per estremità vaginale		 3 suture orizzontali su
la fine uterina
4 suture sul
os esterno vaginale

Tabella 1: Riepilogo delle informazioni per il ridimensionamento dei metodi di test meccanici per ogni organo. I valori di pressione scaricati sono stati misurati utilizzando tecniche di catherization in anestesia (4% isoflurane in 100% ossigeno). Un catetere a palloncino è stato utilizzato per le misurazioni vaginali e un catetere 2F per la cervice.

Vagina collo dell'utero
Basale
Circonferenziale (kPa)		 127.94 188
Basale
Assiale (kPa)		 56.8 75.44
passivo
Circonferenziale (kPa)		 246.03 61.26
passivo
Assiale (kPa)		 112.74 19.26

Tabella 2: I risultati rappresentativi per la modulitangente della vagina e della cervice. La tangente è stata calcolata sia per le condizioni basali che passive, sia per le direzioni circonferenziali che per quelli assiali. Tutte le misurazioni fornite sono in unità di kPa.

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Discussion

Il protocollo fornito in questo articolo presenta un metodo per determinare le proprietà meccaniche della vagina murina e della cervice. Le proprietà meccaniche analizzate in questo protocollo includono sia le condizioni di tono passivo che basale degli organi. Le condizioni di tono passivo e basale sono indotte alterando l'ambiente biochimico in cui l'organo è sommerso. Per questo protocollo, i media coinvolti nei test basali contengono calcio. Testare la condizione del tono basale permette l'isolamento del contributo meccanico delle cellule muscolari lisce all'interno degli organi riproduttivi femminili54,55. Quando si eseguono test meccanici passivi, il supporto non contiene calcio. La mancanza di calcio inibisce le cellule muscolari lisce di contrarsi. Ciò consente di chiarire altri componenti ECM, come il collagene e le fibre elastiche, che dettano in gran parte le proprietà meccaniche passive. In combinazione con l'analisi biochimica e istologica, questi risultati consentono di chiarire le relazioni tra la composizione microstrutturale ECM e la funzione meccanica. Ciò consente quindi di delineare i meccanismi strutturali e meccanici delle patologie rilevanti per la salute riproduttiva delle donne.

In precedenza, la vagina e la cervice sono state testate uniaxally27,28. La vagina e la cervice, tuttavia, dimostrano proprietà anisotropiche e sperimentano il carico multiassiale in vivo29,30 . Di conseguenza, i sistemi di miografo a pressione utilizzati nel presente documento forniscono informazioni quantitative sul carico multiassiale che possono aiutare a comprendere le eziologie delle patologie riproduttive, nonché la successiva progettazione di potenziali trattamenti. Inoltre, la miografia a pressione consente la valutazione delle proprietà multiassiali preservando la geometria dell'organo in vivo e l'interazione cella-matrice nativa56 . In vivo, le cellule rimodellano attivamente l'ECM circostante in risposta ai cambiamenti nei segnali biomeccanici e biochimici57,58,59. Il protocollo qui utilizzato è vantaggioso in quanto consente il monitoraggio dei successivi cambiamenti nelle proprietà degli organi sfusi in condizioni fisiologicamente rilevanti. Ciò facilita la fornitura di una piattaforma per generare set di dati sistematici di proprietà meccaniche attive e passive multiassiali. Inoltre, i dati raccolti in questi esperimenti possono essere sfruttati per formulare e convalidare modelli di stitutive non lineari microstrutturalmente motivati per descrivere e prevedere la risposta meccanica degli organi riproduttivi femminili in stati patologici16,60.

Un ulteriore componente del sistema che era vantaggioso per il protocollo è stato l'uso di imaging a ultrasuoni per misurare lo spessore delle pareti dell'organo. Lo spessore è un'informazione fondamentale per calcolare lo stress sperimentato durante i test.

Con qualsiasi configurazione sperimentale, ci sono alcune limitazioni a questa procedura. Questo protocollo attualmente considera solo la risposta elastica della vagina e della cervice e non la risposta viscoelastica. Un metodo potenziale per mitigare questa limitazione in futuro è quello di modificare il protocollo esistente per includere i test di rilassamento dello scorrimento e dello stress61. Una seconda limitazione presuppone che gli organi siano incomprimibili. All'interno di questo studio, lo spessore è stato misurato esclusivamente alla configurazione scaricata, come motivato da studi precedenti che dimostrano tessuto murino non incinta presenta variazioni minime di volume durante il carico osmotico62. Inoltre, ulteriori studi hanno operato secondo la stessa ipotesi di incomprimibilità44,60,63. Idealmente, un'ecografia sarebbe eseguita per l'intero esperimento al fine di eliminare la necessità di ipotesi di incomprimibilità e di informare meglio i modelli di elementi finiti. Un limite finale è la mancanza di una pressione cervicale in vivo quantificata per informare i protocolli di carico. La letteratura suggerisce che la pressione cervicale nelle donne umane è di 37 mmHg53. I topi, tuttavia, possono presentare una pressione cervicale diversa da quella degli esseri umani. Una differenza nella pressione vaginale è stata dimostrata tra i modelli di roditori e campioni umani64,65. Sono necessari ulteriori studi per quantificare la pressione nella cervice murina non incinta. A tal fine, la pressione intrauterina è stata recentemente riportata durante la gravidanza49.

Il sistema miografo a pressione disponibile in commercio utilizzato in questa procedura misura le proprietà di forza degli organi cavi elastici. Questo protocollo è facilmente adattabile ad altri vari organi e tessuti modificando gli additivi chimici nella vasca da bagno, le dimensioni della cannula e lo spessore della sutura.

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Disclosures

nessuno.

Acknowledgments

Il lavoro è stato finanziato dalla borsa di #1751050 di premiazione NSF CAREER.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer - 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

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White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

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