Detta protokoll beskriver mikrobiella experiment under förhöjt tryck för att studera in situ biomining processer. Den experimentella metoden sysselsätter en gungande högtrycks reaktor utrustad med en guld-Titan reaktion cell som innehåller en mikrobiell kultur i ett surt, järnrikt medium.
Laboratoriestudier som undersöker mikrobiella processer under ytan, såsom metall urlakning i djupa malmfyndigheter (biomining), delar gemensamma och utmanande hinder, inklusive de speciella miljöförhållanden som måste replikeras, t. ex. och i vissa fall sura lösningar. Den förstnämnda kräver en experimentell inställning som lämpar sig för trycksättning upp till 100 bar, medan den senare krav en vätskebehållare med hög kemisk resistens mot korrosion och oönskade kemiska reaktioner med container väggen. För att uppfylla dessa villkor för en ansökan inom området för in situ biomining, en speciell flexibel guld-Titan reaktion cell i en gungande högtrycks reaktor användes i denna studie. Det beskrivna systemet tillät simulering av in situ-biomining genom svavel driven mikrobiell järn reduktion i en anoxisk, tryckstyrd, mycket kemiskt inert experimentell miljö. Den flexibla reaktions cellen i guld-Titan rymmer upp till 100 mL provlösning, som kan provtas vid en given tidpunkt medan systemet bibehåller önskat tryck. Experiment kan utföras på tidsskalor som sträcker sig från timmar till månader. Att montera högtrycks reaktor systemet är ganska tidskrävande. Ändå, när komplexa och utmanande (mikrobiologiska) processer som förekommer i jordens djupa under ytan i kemiskt aggressiva vätskor måste undersökas i laboratoriet, fördelarna med detta system överväger nackdelarna. Resultaten fann att även vid högt tryck det mikrobiella konsortiet är aktiv, men till betydligt lägre metabolismpriser.
Under det senaste decenniet har insatserna för att minimera gruvbrytningen på miljön ökat. Öppna grop som bryter för den rå materiella extraktionen av malm (e.g., koppar-rika sulfidmalm), påverkar det surrounding landskapet vid utgrävnings aktiviteterna och vid de stora resterande volymerna av förloradt vaggar och återstår av bearbetad malm efter extraktionen av dyrbart metaller som koppar. Utvinna koppar direkt från malm i underlaget skulle avsevärt minska dessa effekter. Tekniken för in situ biomining är en lovande kandidat för denna process1. Denna publikation beskriver användningen av stimulerad mikrobiell aktivitet för att extrahera ädelmetaller från malm till en vattenlösning i under ytan. Således kan en koppar-rik lösning lätt pumpas tillbaka till ytan för att ytterligare koncentrera metallen, till exempel.
Aktiviteten av malm-lakning sur mikroorganismer har studerats i många laboratorier för ett varierat utbud av parametrar2,3,4,5,6. Emellertid, Tryckeffekter på den mikrobiella aktiviteten till följd av skillnaden mellan omgivande ytan Lab villkor (nära 1 bar) och under ytan på ett djup av 1 000 m med hydrostatiska förhållanden (~ 100 bar), är inte väldokumenterade. Därför har effekterna av trycket på mikrobiell järn reduktion undersökts genom olika experimentella avenyer7. Här beskrivs den mest lämpade tekniken i detalj.
Högtrycks reaktorer har använts i stor utsträckning för att studera reaktioner vid tryck och temperaturer som inträffar i jordens under yta. Sådana reaktorer består av ett Reaktorkärl i botten som kan innehålla ett vätske prov med en mikrobiell kultur. Sitter ovanpå reaktorkärlet, reaktorn huvudet erbjuder ett varierat utbud av anslutningar och gränssnitt för säkerhetsåtgärder och övervakning sensorer (t. ex., temperatur eller tryck). De flesta högtrycks reaktorer är tillverkade i rostfrittstål. Detta material erbjuder hög motståndskraft och goda bearbetningsegenskaper, men korrosionsbeständigheten hos ytan av rostfrittstål är inte tillräcklig för varje applicering. Till exempel, om mycket sura eller mycket reducerande vattenlösningar undersöks, kan betydande reaktioner av föreningar av intresse med reaktor väggen uppstå. Ett sätt att undvika detta är att sätta in en liner i reaktorkärlet, till exempel en liner tillverkad av borosilikatglas7. Den är lätt att rengöra och kan steriliseras genom autoklavering. Dessutom är det inte attackeras av sura eller minska vattenlösningar. Även om en liner kan bidra till att förhindra konstgjorda reaktioner av lösningen eller mikrober i lösningen med rostfrittstål reaktor väggen, kvarstår flera problem. För en, om en frätande gas bildas, såsom vätesulfid produceras av sulfat-reducerande bakterier, denna gas kan reagera med den avtäckta ytan av reaktorn huvudet sitter ovanför liner. En annan nackdel är att det inte är möjligt att dra tillbaka ett prov från reaktorn samtidigt som trycket bibehålls.
För att övervinna dessa begränsningar har specialiserade flexibla reaktions celler i högtrycks reaktorerna utvecklats för en mängd olika tillämpningar. En flexibel polytetrafluoretylen (PTFE) cell8 utformades för löslighets studier av salter i mycket saltlösning brines. Men begränsningen av detta system är att vissa gaser lätt kan tränga igenom PTFE. Dessutom har detta material fortfarande en relativt låg temperatur stabilitet. Således förbättrades systemet genom att designa en flexibel guld påse med ett Titan huvud9 att placeras inuti rostfrittstål högtrycks reaktor. Guld ytan är korrosionsbeständig mot sura eller reducerande lösningar och gaser. Titan ytan är också mycket inert vid passiverat grundligt för att bilda ett kontinuerligt titandioxidskikt. Vid provtagning från denna reaktions cell genom ett anslutet Titan provtagningsrör krymper guld påsen i volym. Systemets inre tryck bibehålls genom att pumpa samma volym vatten, vilket tas ut genom provtagning, i den rostfria högtrycks reaktorn som rymmer reaktions cellen. Provet inuti reaktions cellen hålls i rörelse genom att man skakar eller lutar högtrycks reaktorn med mer än 90 ° under experimentet.
Reaktions cellen består av de delar som avbildas i figur 1: guld påsen, Titan krage, Titan huvud, rostfri bricka, Titan kompressions bultring, Titan provtagningsrör med rostfria körtlar och kragar för högtryck koned och gängade anslutningarna på båda sidor och Titan ventilen. Guld påsen är en cylindrisk guld (AU 99,99) cell med en väggtjocklek av 0,2 mm, en ytterdiameter på 48 mm, och en längd av 120 mm.
Alla Titan delar är skräddarsydda av workshopen från Titan grade 2 stavar. Dimensionerna på kragen, huvud, bricka och kompressions bult ringen är synliga i figur 2. Titan provtagnings röret är en kapillär av Titan med en ytterdiameter på 6,25 mm och en väggtjocklek på 1,8 mm, vilket resulterar i en innerdiameter på 2,65 mm. Den är fixerad i Titan huvudet och Titan ventilen genom högtrycks konade och gängade anslutningar som säkerställer en tätning av Titan-mot-Titan ytor. Högtrycks Titan ventilen är utrustad med en långsam öppnings stam för att möjliggöra mycket kontrollerad öppning eller provtagning även vid högt tryck. Detta system användes i talrika studier10,11,12.
Den presenterade metoden för experiment med högt tryck av mikrobiella reaktioner inom sura lösningar var ett kraftfullt verktyg för att simulera djupa geomicrobiological processer under ytan i laboratoriemiljö.
Det finns många manuella arbetsmoment inblandade, av vilka vissa kräver särskild uppmärksamhet. Som en allmän anmärkning skall ingen överdriven kraft användas vid montering av de enskilda delarna av den flexibla guld-Titan cellen och reaktor huvudet (avsnitten 3 och 4). Om tillverkarens specifikationer (t. ex. för maximalt tryck, temperatur, vridmoment) ignoreras, kan läckage och/eller materialfel uppstå.
Rengöring av guld och Titan delar (avsnitt 2,2) är ett oumbärligt arbete steg, inte bara för detta experiment, men särskilt för experiment med (i-) organiska reaktioner. Rester från tidigare experiment i guld cellen kan orsaka oönskade reaktioner och därmed polarisering av resultat. När den sammansatta guld-Titan cellen är installerad i reaktor huvudet, är det bäst att arbeta snabbt och exakt, eftersom det vid denna tid små mängder syre kan komma in i guld cellen. Stänga provtagnings ventilen innan du lämnar glovebox är en bra första åtgärd för att minimera utbytet mellan den omgivande atmosfären med det inre av guld cellen.
När reaktorn är placerad i Gung anordningen, är det viktigt att ställa in den gungande rörelsehastigheten till ~ 170 °/min. Om högtrycks reaktorn rör sig för fort, kan bristning av guld cellen hända på grund av gravitationseffekter eller vassa kanter av sediment eller stenprover när de används.
Denna metod kan användas i ytterligare forskningsområden. Den flexibla reaktions cellen i guld-Titan har potential att användas för en mängd olika vetenskapliga undersökningar9 studera reaktioner vid förhöjt tryck och temperatur och i starkt korrosiva vätskor eller gaser.
Mikroorganismer i den djupa under ytan vid temperaturer över 70 ° c i närvaro av mineraliska ytor kan stimulera produktionen av molekylärt väte eller organiska syror som acetat även under förhöjt tryck16. Dessa produkter, och andra föreningar, kan framkalla förhöjd mikrobiell aktivitet under in situ bioprocesser, utöver de svavelföreningar som undersökts i denna studie.
Tillämpningar omfattar bestämning av löslighet av gaser och joner i vattenhaltiga vätskor, geokemiska reaktioner vid förhållanden i hydrotermiska ventilationssystem17, kvantifiering av isotop fraktionering18, geokemiska reaktioner vid samtidig 2 upptagning19, abiotiska processer under bildandet av olja och gas i käll stenar20, och mikrobiella reaktioner vid förhöjt tryck i under ytan21 som i den aktuella studien.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) för att dela hans expertis på den flexibla guld-Titan reaktions celler, och Georg Scheeder (BGR) för sin input under den inledande fasen av inrättandet av det modifierade systemet i Hannover. Vi vill tacka många forskare (inklusive Katja Heeschen, Andreas RISSE, Jens Gröger-Trampe, Theodor Alpermann) med hjälp av setup i Hannover i många projekt som bidrog i små förbättringar längs vägen och Christian Seeger för att utveckla en gungapparat för högtrycks reaktorerna. Vi tackar Laura Castro (Complutense-universitetet i Madrid) för SEM-observationer. Och slutligen vill vi uttrycka vår tacksamhet till Nils Wölki för att ha producerat denna högkvalitativa video för artikeln. Detta arbete stöddes av EU Horizon 2020 Project BIOMOre (bidragsöverenskommelse # 642456).
Acetone | Merck | 100013 | |
CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
Copper paste | Caramba | 691301 | |
Copper paste | CRC | 41520 | |
CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
HCl | Roth | 6331.3 | |
HNO3 | Fluka | 7006 | |
H3BO3 | Sigma | B6768 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
Light microscope | Leica DM3000 | ||
MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
NaO3V | Sigma | 590088 | |
Na2SO4 | Merck | 106649 | |
Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
pH meter | Mettler Toledo | ||
Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
Stoppers | Sigma | 27234 | |
Sulfur powder | Roth | 9304 | |
Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |