Denne protokol beskriver mikrobielle eksperimenter under forhøjet tryk for at studere in situ biomining processer. Den eksperimentelle tilgang anvender en Rocking højtryks reaktor udstyret med en guld-titanium reaktions celle, der indeholder en mikrobiel kultur i et surt, jern rigt medium.
Laboratorieundersøgelser, der undersøger Mikrobielle processer under overfladen, såsom udvaskning af metal i dybe malmforekomster (biomining), deler fælles og udfordrende forhindringer, herunder de særlige miljøforhold, som skal gentages, f. eks. og i nogle tilfælde sure opløsninger. Førstnævnte kræver en eksperimentel opsætning egnet til trykdannelse op til 100 bar, mens sidstnævnte kræver en væskebeholder med høj kemisk resistens mod korrosion og uønskede kemiske reaktioner med beholderen væggen. For at opfylde disse betingelser for en applikation inden for in situ-biomining blev der anvendt en særlig fleksibel guld-titanium reaktions celle i en Rocking højtryks reaktor i denne undersøgelse. Det beskrevne system tillod simulering af in situ-biomining gennem svovl-drevet mikrobiel jern reduktion i et anoxisk, tryk kontrolleret, yderst kemisk inert forsøgsmiljø. Den fleksible guld-titanium reaktions celle kan rumme op til 100 mL prøveopløsning, som kan udtages på et givet tidspunkt, mens systemet bevarer det ønskede tryk. Eksperimenter kan udføres på tidshorisonter, der spænder fra timer til måneder. Montering af højtryks reaktoren system er temmelig tidskrævende. Ikke desto mindre, når komplekse og udfordrende (mikrobiologiske) processer, der forekommer i Jordens dybe underjordiske i kemisk aggressive væsker skal undersøges i laboratoriet, fordelene ved dette system opvejer ulemperne. Resultaterne viste, at selv ved højt tryk er det mikrobielle konsortium aktivt, men med betydeligt lavere stofskifte rater.
I løbet af det seneste årti er bestræbelserne på at minimere indvirkningen af minedrift på miljøet steget. Åben minedrift til råstofudvinding af malm (f. eks. kobber rige sulfid malm), påvirker det omgivende landskab ved udgravnings aktiviteterne og de store resterende mængder af affalds sten og rester af forarbejdet malm efter udvinding af ædle metaller som kobber. Udvinding af kobber direkte fra malm i underlaget vil reducere disse påvirkninger betydeligt. Teknologien til in situ-biomining er en lovende kandidat til denne proces1. Denne publikation beskriver brugen af stimuleret mikrobiel aktivitet til at udtrække de ædle metaller fra malm til en vandig opløsning i underlaget. Således kan en kobber-rige opløsning let pumpes tilbage til overfladen for yderligere at koncentrere metallet, for eksempel.
Aktiviteten af malm-udvaskning acidophilic mikroorganismer er blevet undersøgt i mange laboratorier for en bred vifte af parametre2,3,4,5,6. Imidlertid er trykpåvirkninger på den mikrobielle aktivitet som følge af forskellen mellem de omgivende overflade laboratorieforhold (nær 1 bar) og under overfladen i en dybde på 1.000 m med hydrostatiske forhold (~ 100 bar) ikke veldokumenterede. Derfor er virkningerne af presset på mikrobiel jern reduktion blevet undersøgt gennem forskellige eksperimentelle veje7. Her beskrives den mest velegnede teknik i detaljer.
Højtryksreaktorer er blevet brugt i udstrakt grad til at studere reaktioner ved tryk og temperaturer, der forekommer i Jordens under flade. Sådanne reaktorer består af et reaktor fartøj i bunden, der kan indeholde en væskeprøve med en mikrobiel kultur. På toppen af reaktorbeholderen tilbyder reaktor hovedet en bred vifte af tilslutninger og grænseflader til sikkerhedsforanstaltninger og overvågnings sensorer (f. eks. temperatur eller tryk). De fleste højtryks reaktorer er fremstillet af rustfrit stål. Dette materiale giver høj modstandsdygtighed og gode bearbejdningsegenskaber, men korrosions modstanden i den rustfri stål overflade er ikke tilstrækkelig til enhver applikation. For eksempel, hvis meget sure eller stærkt reducerende vandige opløsninger undersøges, signifikante reaktioner af de forbindelser af interesse med reaktoren væggen kan forekomme. En måde at undgå dette på er at indsætte en liner i reaktorbeholderen, for eksempel en liner fremstillet af borosilicat glas7. Det er let at rengøre og kan steriliseres ved autoclaving. Desuden er det ikke angrebet af sure eller reducere vandige opløsninger. Selv om en liner kan hjælpe med at forhindre kunstige reaktioner af opløsningen eller mikrober i opløsningen med den rustfri-stålreaktor væggen, flere problemer tilbage. For en, hvis en ætsende gas dannes, såsom hydrogensulfid produceret af sulfat-reducerende bakterier, denne gas kan reagere med den udækkede overflade af reaktoren hoved sidder over liner. En anden ulempe er, at det ikke er muligt at trække en prøve fra reaktoren tilbage og samtidig opretholde trykket.
For at overvinde disse begrænsninger, specialiserede fleksible reaktions celler inde i højtryksreaktorer er udviklet til en række forskellige anvendelser. En fleksibel polytetrafluorethylen (PTFE) celle8 blev designet til opløselighed undersøgelser af salte i stærkt saltvand. Men begrænsningen af dette system er, at nogle gasser let kan trænge ind i PTFE. Desuden har dette materiale stadig en relativ lav temperaturstabilitet. Således blev systemet forbedret ved at designe en fleksibel guld pose med et titanium hoved9 , der skulle anbringes i højtryks reaktoren i rustfrit stål. Guld overfladen er korrosionsbestandig mod sure eller reducerende opløsninger og gasser. Titanium overfladen er også meget inert, når passiveret grundigt at danne en kontinuerlig titandioxid lag. Under prøvetagning fra denne reaktions celle gennem et tilsluttet titanium prøvetagnings slange krymper guld posen i volumen. Systemets interne tryk opretholdes ved at pumpe den samme mængde vand, som trækkes tilbage ved prøvetagning, ind i den rustfri stål højtryks reaktor, der imødekommer reaktions cellen. Prøven inde i reaktions cellen holdes i bevægelse ved at Rocking eller vippe højtryks reaktoren med mere end 90 ° under forsøget.
Reaktions cellen består af de dele, som er afbildet i figur 1: guld posen, titanium krave, titanium hoved, rustfri stål skive, titanium kompressions bolt ring, titanium prøvetagnings slange med rustfrit kirtler og kraver til højtryks koned og gevindforbindelser på begge sider og Titanium ventilen. Guld posen er en cylindrisk guld (AU 99,99) celle med en vægtykkelse på 0,2 mm, en udvendig diameter på 48 mm og en længde på 120 mm.
Alle titanium dele er skræddersyet af workshoppen fra titanium Grade 2 stænger. Dimensionerne af kraven, hoved, Skive, og kompressions bolt ring er synlige i figur 2. Titanium prøvetagningsrøret er et kapillar af titanium med en udvendig diameter på 6,25 mm og en vægtykkelse på 1,8 mm, hvilket resulterer i en indvendig diameter på 2,65 mm. Det er fastgjort i titanium hovedet og Titanium ventilen ved højtryks koned og gevindforbindelser sikrer en forsegling af titanium-mod-titanium overflader. Højtryks titanium ventilen er udstyret med en langsom åbnings stilk for at give mulighed for meget kontrolleret åbning eller prøvetagning selv ved højt tryk. Dette system blev anvendt i talrige undersøgelser10,11,12.
Den præsenterede metode til højtryks eksperimenter med mikrobielle reaktioner i sure opløsninger var et effektivt værktøj til at simulere dybe, geomicrobiologiske processer i et laboratoriemiljø.
Der er talrige manuelle arbejdstrin involveret, hvoraf nogle kræver særlig opmærksomhed. Som generel bemærkning må der ikke anvendes overdreven kraft ved montering af de enkelte dele af den fleksible guld-titanium celle og reaktor hovedet (punkt 3 og 4). Hvis fabrikantens specifikationer (f. eks. for maksimalt tryk, temperatur, drejningsmoment) ignoreres, kan der opstå lækage og/eller materialefejl.
Rengøring af guld og Titanium dele (punkt 2,2) er et uundværligt arbejdstrin, ikke kun for dette eksperiment, men især for eksperimenter, der involverer (in-) organiske reaktioner. Rester fra tidligere eksperimenter i guld cellen kan forårsage uønskede reaktioner og derfor forspænde af resultater. Når den samlede guld-titanium celle er installeret i reaktoren hoved, er det bedst at arbejde hurtigt og præcist, fordi der på dette tidspunkt små mængder af ilt kan komme ind i guld cellen. Lukning af prøveudtagningsventilen, før du forlader handskerum er en god første foranstaltning for at minimere udvekslingen mellem den omgivende atmosfære med det indre af guld cellen.
Når reaktoren er placeret i Rocking-enheden, er det vigtigt at indstille gynge bevægelseshastigheden til ~ 170 °/min. Hvis højtryks reaktoren bevæger sig for hurtigt, kan Bristning af guld cellen ske på grund af gravitations effekter eller de skarpe kanter af sediment eller klippeprøver, når de anvendes.
Denne metode kan bruges i yderligere forskningsfelter. Den fleksible guld-titanium reaktions celle har potentialet til at blive brugt til et mangfoldigt sæt af videnskabelige undersøgelser9 studere reaktioner ved forhøjet tryk og temperatur og i meget ætsende væsker eller gasser.
Mikroorganismer i den dybe under flade ved temperaturer over 70 °C i tilstedeværelse af mineralske overflader kan stimulere produktionen af Molekylær hydrogen eller organiske syrer som acetat selv under forhøjet tryk16. Disse produkter og andre forbindelser kan fremkalde forhøjet mikrobiel aktivitet under in situ-bioudvasknings processer ud over de svovlforbindelser, der er undersøgt i dette studie.
Anvendelser omfatter bestemmelse af Opløselighed af gasser og ioner i vandige væsker, geokemiske reaktioner ved hydrotermiske ventilationssystemer17, kvantificering af isotop fraktionering18, GEOKEMISKE reaktioner under Co 2 binding19, abiotiske processer under dannelsen af olie og gas i kilde klipper20, og mikrobielle reaktioner ved forhøjet tryk i underlaget21 som i nærværende undersøgelse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) for at dele sin ekspertise på de fleksible guld-titanium reaktions celler, og Georg Scheeder (BGR) for hans input i den indledende fase af etableringen af det modificerede system i Hannover. Vi vil gerne takke mange videnskabsfolk (herunder Katja Heeschen, Andreas Risse, Jens Gröger-trampe, Theodor Alpermann) ved hjælp af opsætningen i Hannover i talrige projekter, der bidrog med små forbedringer undervejs, og Christian seeger for at udvikle gynge anordning til højtryksreaktorer. Vi takker Laura Castro (Complutense University of Madrid) for SEM observationer. Og endelig vil vi gerne udtrykke vores taknemmelighed over for Nils Wölki for at producere denne video af høj kvalitet til artiklen. Dette arbejde blev støttet af EU Horizon 2020 Project BIOMOre (tilskudsaftale # 642456).
Acetone | Merck | 100013 | |
CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
Copper paste | Caramba | 691301 | |
Copper paste | CRC | 41520 | |
CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
HCl | Roth | 6331.3 | |
HNO3 | Fluka | 7006 | |
H3BO3 | Sigma | B6768 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
Light microscope | Leica DM3000 | ||
MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
NaO3V | Sigma | 590088 | |
Na2SO4 | Merck | 106649 | |
Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
pH meter | Mettler Toledo | ||
Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
Stoppers | Sigma | 27234 | |
Sulfur powder | Roth | 9304 | |
Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |