Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Engineering

Använda flexibla reaktions celler i guld-Titan för att simulera tryck beroende mikrobiell aktivitet i samband med subsurface-Biomining

doi: 10.3791/60140 Published: October 5, 2019

Summary

Detta protokoll beskriver mikrobiella experiment under förhöjt tryck för att studera in situ biomining processer. Den experimentella metoden sysselsätter en gungande högtrycks reaktor utrustad med en guld-Titan reaktion cell som innehåller en mikrobiell kultur i ett surt, järnrikt medium.

Abstract

Laboratoriestudier som undersöker mikrobiella processer under ytan, såsom metall urlakning i djupa malmfyndigheter (biomining), delar gemensamma och utmanande hinder, inklusive de speciella miljöförhållanden som måste replikeras, t. ex. och i vissa fall sura lösningar. Den förstnämnda kräver en experimentell inställning som lämpar sig för trycksättning upp till 100 bar, medan den senare krav en vätskebehållare med hög kemisk resistens mot korrosion och oönskade kemiska reaktioner med container väggen. För att uppfylla dessa villkor för en ansökan inom området för in situ biomining, en speciell flexibel guld-Titan reaktion cell i en gungande högtrycks reaktor användes i denna studie. Det beskrivna systemet tillät simulering av in situ-biomining genom svavel driven mikrobiell järn reduktion i en anoxisk, tryckstyrd, mycket kemiskt inert experimentell miljö. Den flexibla reaktions cellen i guld-Titan rymmer upp till 100 mL provlösning, som kan provtas vid en given tidpunkt medan systemet bibehåller önskat tryck. Experiment kan utföras på tidsskalor som sträcker sig från timmar till månader. Att montera högtrycks reaktor systemet är ganska tidskrävande. Ändå, när komplexa och utmanande (mikrobiologiska) processer som förekommer i jordens djupa under ytan i kemiskt aggressiva vätskor måste undersökas i laboratoriet, fördelarna med detta system överväger nackdelarna. Resultaten fann att även vid högt tryck det mikrobiella konsortiet är aktiv, men till betydligt lägre metabolismpriser.

Introduction

Under det senaste decenniet har insatserna för att minimera gruvbrytningen på miljön ökat. Öppna grop som bryter för den rå materiella extraktionen av malm (e.g., koppar-rika sulfidmalm), påverkar det surrounding landskapet vid utgrävnings aktiviteterna och vid de stora resterande volymerna av förloradt vaggar och återstår av bearbetad malm efter extraktionen av dyrbart metaller som koppar. Utvinna koppar direkt från malm i underlaget skulle avsevärt minska dessa effekter. Tekniken för in situ biomining är en lovande kandidat för denna process1. Denna publikation beskriver användningen av stimulerad mikrobiell aktivitet för att extrahera ädelmetaller från malm till en vattenlösning i under ytan. Således kan en koppar-rik lösning lätt pumpas tillbaka till ytan för att ytterligare koncentrera metallen, till exempel.

Aktiviteten av malm-lakning sur mikroorganismer har studerats i många laboratorier för ett varierat utbud av parametrar2,3,4,5,6. Emellertid, Tryckeffekter på den mikrobiella aktiviteten till följd av skillnaden mellan omgivande ytan Lab villkor (nära 1 bar) och under ytan på ett djup av 1 000 m med hydrostatiska förhållanden (~ 100 bar), är inte väldokumenterade. Därför har effekterna av trycket på mikrobiell järn reduktion undersökts genom olika experimentella avenyer7. Här beskrivs den mest lämpade tekniken i detalj.

Högtrycks reaktorer har använts i stor utsträckning för att studera reaktioner vid tryck och temperaturer som inträffar i jordens under yta. Sådana reaktorer består av ett Reaktorkärl i botten som kan innehålla ett vätske prov med en mikrobiell kultur. Sitter ovanpå reaktorkärlet, reaktorn huvudet erbjuder ett varierat utbud av anslutningar och gränssnitt för säkerhetsåtgärder och övervakning sensorer (t. ex., temperatur eller tryck). De flesta högtrycks reaktorer är tillverkade i rostfrittstål. Detta material erbjuder hög motståndskraft och goda bearbetningsegenskaper, men korrosionsbeständigheten hos ytan av rostfrittstål är inte tillräcklig för varje applicering. Till exempel, om mycket sura eller mycket reducerande vattenlösningar undersöks, kan betydande reaktioner av föreningar av intresse med reaktor väggen uppstå. Ett sätt att undvika detta är att sätta in en liner i reaktorkärlet, till exempel en liner tillverkad av borosilikatglas7. Den är lätt att rengöra och kan steriliseras genom autoklavering. Dessutom är det inte attackeras av sura eller minska vattenlösningar. Även om en liner kan bidra till att förhindra konstgjorda reaktioner av lösningen eller mikrober i lösningen med rostfrittstål reaktor väggen, kvarstår flera problem. För en, om en frätande gas bildas, såsom vätesulfid produceras av sulfat-reducerande bakterier, denna gas kan reagera med den avtäckta ytan av reaktorn huvudet sitter ovanför liner. En annan nackdel är att det inte är möjligt att dra tillbaka ett prov från reaktorn samtidigt som trycket bibehålls.

För att övervinna dessa begränsningar har specialiserade flexibla reaktions celler i högtrycks reaktorerna utvecklats för en mängd olika tillämpningar. En flexibel polytetrafluoretylen (PTFE) cell8 utformades för löslighets studier av salter i mycket saltlösning brines. Men begränsningen av detta system är att vissa gaser lätt kan tränga igenom PTFE. Dessutom har detta material fortfarande en relativt låg temperatur stabilitet. Således förbättrades systemet genom att designa en flexibel guld påse med ett Titan huvud9 att placeras inuti rostfrittstål högtrycks reaktor. Guld ytan är korrosionsbeständig mot sura eller reducerande lösningar och gaser. Titan ytan är också mycket inert vid passiverat grundligt för att bilda ett kontinuerligt titandioxidskikt. Vid provtagning från denna reaktions cell genom ett anslutet Titan provtagningsrör krymper guld påsen i volym. Systemets inre tryck bibehålls genom att pumpa samma volym vatten, vilket tas ut genom provtagning, i den rostfria högtrycks reaktorn som rymmer reaktions cellen. Provet inuti reaktions cellen hålls i rörelse genom att man skakar eller lutar högtrycks reaktorn med mer än 90 ° under experimentet.

Reaktions cellen består av de delar som avbildas i figur 1: guld påsen, Titan krage, Titan huvud, rostfri bricka, Titan kompressions bultring, Titan provtagningsrör med rostfria körtlar och kragar för högtryck koned och gängade anslutningarna på båda sidor och Titan ventilen. Guld påsen är en cylindrisk guld (AU 99,99) cell med en väggtjocklek av 0,2 mm, en ytterdiameter på 48 mm, och en längd av 120 mm.

Alla Titan delar är skräddarsydda av workshopen från Titan grade 2 stavar. Dimensionerna på kragen, huvud, bricka och kompressions bult ringen är synliga i figur 2. Titan provtagnings röret är en kapillär av Titan med en ytterdiameter på 6,25 mm och en väggtjocklek på 1,8 mm, vilket resulterar i en innerdiameter på 2,65 mm. Den är fixerad i Titan huvudet och Titan ventilen genom högtrycks konade och gängade anslutningar som säkerställer en tätning av Titan-mot-Titan ytor. Högtrycks Titan ventilen är utrustad med en långsam öppnings stam för att möjliggöra mycket kontrollerad öppning eller provtagning även vid högt tryck. Detta system användes i talrika studier10,11,12.

Protocol

1. beredning av medel och inympning av den mikrobiella kulturen

  1. Förbered ett basalt salt medium för autotrofiska prokaryoter enligt publicerad teknik13. Lös upp och blanda kemikalierna nedan i destillerat vatten (mg/L):na 24· 10h2o (150) (NH4)24 (450), KCL (50), MGSO4· 7h2o (500), KH2Po4 (50) och ca (No 3) 2· 4h2O (7).
  2. Tillsätt 1 mL/L av en 1000X koncentrerad spårelement lösning som innehåller (g/L): ZnSO4· 7h2o (10), CuSO4· 5H2o (1), mnso4· H2o (0,76), COSO4· 7h2o (1), CRK (så4)2· 12h2o (0,4), H3BO3 (0,6), namoo4· 2H2o (0,5), Niso4· 6H2o (1), na 2 SeO4 (0,51), na2wo4· 2H2O (0,1), och Navo3 (0,1). Justera pH till 1,8 genom att tillsätta 5 M svavelsyra.
  3. Sterilisera mediet i en autoklav vid 121 ° c och 1,2 bar i 20 min och sterilisera järnlösning järn genom filtrering genom en 0,22 μm porstorlek spruta filter.
  4. Överför 50 mL av det steriliserade basala salt mediet till en serum flaska och tillsätt järnlösning av järn och Elementärt svavel till en slutlig koncentration på 50 mM respektive 10 g/L.
  5. Inokulera mediet med en blandad kultur som består av flera mesoacidos philic Iron-oxiderande prokaryoter14.
  6. Locket serum flaskan med steriliserade butylgummiproppar och tätning med aluminium crimps.
  7. Kraftigt bubbla odlingsmediet med N2 till band upplöst syre i 25 min. Använd två nålar, placera en djupare i flaskan huvudet, den andra en nära locket.
  8. Injicera CO2 för att få en 90% N2 och 10% Co2 atmosfär i headspace av serum flaskan. Inkubera kulturen utan omrörning vid 30 ° c i mörker.

2. beredning av guld-Titan reaktions cellen och högtrycks reaktorn

  1. Rengör guld-Titan reaktions cellen.
    1. Demontera reaktions cellen i de enskilda delarna för att undvika kontakt med syra med rostfria stål delar, eller exponeringen av de monterade delarna med olika termiska expansions egenskaper för att värma.
    2. Rengör ytorna som kommer i kontakt med provet under experimentet (t. ex. guld påsen, Titan huvudet, Titan provtagnings röret och Titan ventilen).
      1. Sätt guld påsen och Titan huvudet i en glasbägare.
      2. Lägg till tillräckligt med 10% HCl för att täcka alla delar.
      3. Värm syran på en värmeplatta till 50 ° c under 3 h under omrörning.
      4. Ta bort delar med PTFE pincett från Syralösningen och skölj dem med avjoniserat vatten.
      5. Skölj den inre ytan av guld påsen och Titan huvudet grundligt med 65% HNO3 och sedan med avjoniserat vatten.
      6. Skölj den inre ytan av Titan provtagnings röret och Titan ventilen med 10% HCl, följt av avjoniserat vatten, 65% HNO3, och sedan avjoniserat vatten igen.
      7. Rengör alla delar från organisk kontamination genom att skölja dem med aceton.
      8. Torka alla delar i ugnen vid 105 ° c i minst 1 h.
    3. Värm ytorna i guld påsen, Titan huvudet och Titan provtagnings röret genom att utsätta dem för en temperatur på 450 ° c för 4 h i en muffelugn i en luft atmosfär.
      Anmärkning: denna procedur steriliserar ytorna och resulterar i bildandet av en passivering titandioxid skikt på alla Titan ytor. Titan delarna bör ha en gul till blå färg efter värmebehandlingen.
    4. Anneal guld cellen för att öka flexibiliteten i guldet genom att återställa små kristallisation domäner genom att tillämpa värme med en propan ficklampa. Värm guld ytan runt för att minska Kinks i guldet som kan ha bildats under den sista krympningen av guld påsen volym i ett experiment. Se till att inte värma guldet för mycket på ett ställe för att undvika dess smältning.
      Obs: ett rött sken av guld ytan visar tillräcklig värme.
    5. Montera guld påsen i Titan krage, och Titan provtagnings slangen i Titan huvudet med ett vridmoment på 10 Nm för körtlar.
  2. Inspektera högtrycks reaktorn.
    1. Visuellt kontrollera reaktorn för eventuella skador, korrosion, och lösa delar.
      Obs: särskild uppmärksamhet bör ägnas åt tätningen och spåret där tätningen äger rum. Om en grafit packning tidigare användes för att täta reaktorn, rester av det kan fortfarande vara i spåret och bör avlägsnas med en plast stift innan nästa experiment.
    2. Applicera kopparsulfidpasta på tryckbultarna i högtrycks reaktor huvudet. Se till att fettet fördelas över hela tråden.
    3. Kontrollera skruven-passande kompressions tätning för längden på den återstående grafit packning.

3. fyllning och montering av guld-Titan reaktions cell under anoxiska förhållanden

  1. Lägg i handskfacket.
    1. Förbered odlingsmediet i serum flaskorna enligt avsnitt 1.
    2. Linda de delar av goldtitanium reaktions cellen som senare kommer att vara i kontakt med provet i aluminiumfolie för att minimera eventuella föroreningar.
    3. Öppna och lås upp förrum i handskfacket, Fyll på allt inkommande material på det rörliga magasinet och Stäng och lås den främre luckan.
    4. Evakuera förrum 3x och översvämma den med hög renhet kväve.
    5. Bär ett par handskar och få så nära som möjligt till den inre luckan. Lås upp och öppna det inre höljet för att ta bort det inkommande materialet från det flyttbara facket.
    6. Stäng och lås den inre luckan.
  2. Fyll guld cellen.
    1. Packa upp den rena guld påsen och stå upp med en glasbägare, till exempel. Öppna serum flaskan som innehåller 100 mL bakteriekultur och Elementärt svavel.
    2. Skaka försiktigt serum flaskan och överför bakteriekulturen till guld påsen.
  3. Montera reaktions cellen.
    1. Sätt i Titan huvudet med den bifogade Titan provtagnings röret i Titan krage innesluter den övre kanten av guld påsen.
      Obs: se till att tätningsytan på den koniska nedre delen av Titan huvudet passar smidigt genom att vrida den 90 ° fram och tillbaka.
    2. Skjut brickan och kompressions bulten ringen över Titan provtagnings röret på Titan huvudet.
      Obs: Vrid kompressions ringen i Titan kragen med 30 ° för att rikta in flänsarna på Titan kragen och framstötbultringen.
    3. Fäst de sex insexskruvarna i samma utsträckning för att säkerställa en jämn tryckfördelning av Titan huvudet på den översta kanten av guld påsen i Titan kragen (dvs. tätningsytan av reaktions cellen).
      Anmärkning: fäst insexskruvarna i kompressions bulten ringen tills hand-tight så att vridmomentet för de motsatta skruvarna ökas först (crisscrossing) innan du fortsätter medurs.
  4. Montera provtagnings ventilen på ovansidan av Titan röret. Fäst anslutningen hand-tight och se till att stänga ventilen.
  5. Ta bort alla delar från handskfacket.

4. montering av högtrycks reaktorn med reaktions cellen

  1. Montera reaktions cellen i reaktor huvudet.
    Anmärkning: installationen av högtrycks reaktorn kommer med en mycket kort exponering av den öppna änden av provtagnings röret till den omgivande atmosfären, eftersom provtagnings ventilen måste avlägsnas för att vägleda röret genom skruv tätningen i reaktor huvudet. För installationen bör reaktor huvudet redan placeras i en bänk vise. En 45 ° vinkel möjliggör enklare hantering. Kompressions tätningen (placerad i det centrala läget av reaktor huvudets Gage-blockenhet), som håller provtagnings röret på plats, måste vara öppet.
    1. Ta bort Titan provtagnings ventilen, skruven och halsbandet ovanpå provtagnings röret.
    2. Vägleda röret med reaktions cellen fäst genom det centrala hålet i reaktor huvudet tills ca 5 cm av röret passera. Skjut den stora skruven över röret och fäst den lilla kragen.
      Obs: nu reaktionen cell sammansättningen inte kan glida tillbaka genom reaktorn huvudet och båda händerna är fria att installera provtagnings ventilen.
    3. Sätt tillbaka Titan ventilen.
    4. Dra åt kompressions tätningen.
    5. Ta bort reaktor huvudet från bänken vise för att installera det på reaktorkärlet.
  2. Förbered för att täta reaktorn.
    1. Sätt grafittätning på spåret av reaktorkärlet.
    2. Placera försiktigt reaktor huvudet med den bifogade reaktions cellen på reaktorkärlet.
      Anmärkning: reaktor huvudet, inklusive termoelement, måste placeras försiktigt på reaktorkärlet för att inte skada guld påsen eller termoelement.
  3. Fyll reaktorkärlet med en blandning av avjoniserat och kranvatten (ungefär i förhållandet 1:1).
  4. Försegla reaktorn.
    1. Kontrollera kragen för att säkerställa att de nedre ändarna av kompressions bultar inte sticker ut från sina trådar. Annars kommer tryckkärlet inte att installeras korrekt.
    2. Lyft kragen och placera den runt de utskjutande kanterna på reaktorns headvessel gränssnitt. Försiktigt flytta kragen på det kommer att resultera i en ordentlig passform. Stäng fästlåsen som håller kragen på plats.
    3. Fäst kompressions skruvarna efter ett korsmönster och öka vridmomentet i måttliga steg tills det slutliga värde som rekommenderas av tillverkaren uppnås.
      Obs: olika högtrycksreaktorsystem kan ha olika moment värden.
    4. Skruva slutligen fast kompressions skruvarna medurs.
  5. Installera högtrycks reaktorn i Gung anordningen.
    Obs: installationen av högtrycks reaktorn i Gung anordningen beskrivs för en skräddarsydd modell som tillverkats vid Federal Institute for geosciences and Natural Resources i Hannover, Tyskland. Därför är den beskrivna installationen en allmän riktlinje för enheter med jämförbar design.
    1. Montera reaktorn försiktigt i Gung anordningen.
      Obs: det är bäst att hålla högtrycks reaktorn av Gage block församling delar (t. ex., manometer eller provtagningsrör skruvar) samtidigt sänka den i Gung anordningen.
    2. Fixera reaktorn med två klämmor över ett par långa skruvar.
    3. Placera brickor på varje skruv och dra åt klämmorna med skruv muttrar.
    4. Anslut manöverenheterna för termoelementet, tryckgivaren och värmeelement.
      Obs: det är viktigt att se till att alla ledningar är tillräckligt långa för den gungande rörelsen och förhindra kontakt med de uppvärmda ytorna.
    5. Skjut värmeelement över reaktorkärlet och dra åt dess skruv lås.
      Obs: vattnet för att pressa systemet tas från en reservoar med en högtryckspump. Det överförs genom rostfrittstål kapillärer i högtrycks reaktorn.
      Anmärkning: gungning av högtrycks reaktorn garanterar en grundlig blandning av reaktions cellens innehåll (dvs. gasen, vätskan och alla fasta faser i den). En långsam gunga hastighet är viktigt att förhindra skador på guld påsen genom att snabbt flytta fasta ämnen eller genom deformation på grund av gravitationens effekter på det flexibla guldet vid förhöjda temperaturer. Det gungande systemet kan rotera med nära 180 °.

5. Starta experimentet

  1. Kontrollera om temperatur-och tryck gränserna i övervakningsprogrammet är inställda på önskade värden.
    Anmärkning: i detta experiment sattes de till 70 ° c och 25 MPa.
  2. Utför en läckagekontroll.
    1. Anslut tryckröret, ett rostfrittstål kapillär, till reaktor huvudet.
    2. Höj trycket till mål trycket med distinkta intervaller samtidigt som du kontinuerligt söker efter läckage.
    3. Håll tryckkonstanten tills pumpens flödeshastighet är nästan noll.
      Obs: Akta dig för att compressible, upplöst luft i vatten är synlig under en lång tid i subtila flödes avläsningar.
  3. Starta uppvärmningen efter en lyckad läckagekontroll.
    1. Starta loggning av tryck sättnings pumparna.
    2. Justera Ställ punkten för uppvärmningen till önskat värde och starta uppvärmningen med programvaran.
    3. Kontrollera regelbundet alla parametrar och systemstatus.
    4. Dra åt tryckröret efter att ha nått måltemperaturen.
    5. Starta Gung anordningen.

6. provtagning av högtrycks reaktorn i driftläge

  1. För att ta ett prov, bifoga en 5 mL spruta till luer lock-kontakten på provtagnings ventilen på toppen av högtrycks reaktorn.
  2. Öppna ventilen försiktigt och låt vätske provet pressa in sprutan genom trycket inuti högtrycks reaktorn. Stäng ventilen efter provvolymen når 1 mL. Ta loss sprutan.
  3. Överför proverna i sprutan omedelbart till en 2 mL tub i ett draghuv för bearbetning.

7. Analys av vätske prov

Anmärkning: endast stegen för den mindre vanliga fotometriska ferrozine-analysen (dvs. avsnitt 7,1) beskrivs här i detalj och nämns i videon, eftersom de andra stegen är standard Operations procedurer i mikrobiologi.

  1. Använd en ferrozinanalys för att fotometriskt bestämma koncentrationen av upplöst järnjärn (FE2 +(AQ)) och totalt järn (FEtot)15.
    1. Förbered en serie järnhaltiga järn standardlösningar genom att lösa kända mängder av FeSO4· 7 H2O i vatten.
    2. Blanda 50 μL av dessa standardnivåer med 1 mL av en 1 M ferrozinlösning.
      Anmärkning: reaktionen av ferrozine med upplöst järn järn bildar ett lila komplex. Intensiteten av färgen korrelerar till järn järnkoncentrationen.
    3. Upprätta en kalibreringskurva mellan järn-ferrozine-koncentrationens järn koncentration och absorbans.
    4. Beräkna koncentrationen av järnjärn i ett prov från två parallella mätningar enligt den fastställda standardkurvan.
  2. Analysera pH-värdet och oxidations-/reduktions potentialen (ORP) med digitala pH/redoxmätare med semimicro pH-elektroder, respektive en silverkloridelektrod.
  3. Räkna Planktoniska celler direkt med hjälp av ett lätt Mikroskop med en Thoma kammare.
  4. Undersök cellmorfologin genom att skanna elektronmikroskopi (SEM).
    1. Filtrera Planktoniska celler som odlas under olika förhållanden genom ett filter med 0,1 − 0,2 μm porstorlek.
    2. Dehydrera prover med aceton och förvara dem över natten vid 4 ° c i 90% aceton.
    3. Torka proverna med kritisk punkt torkning och belägga dem med grafit eller guld.
    4. Undersök prover med ett fält avgas söknings elektronmikroskop (FE-SEM) vid 10 kV.

Representative Results

Resultaten av högtrycks reaktor experimentet med den speciella Gold-Titanium-reaktionscellen visar att den mikrobiella blandade kulturen hos sur philes oxiderade svavel och reducerade järnjärn till järn (figur 3).

Vid både 1 bar eller 100 bar tryckförhållanden, hade kulturerna en fördröjning fas när odlas i guld-Titan reaktions cellen. Efter denna period skedde en snabb ökning av järn järnhalten från ca 9 mM till 31 mM i den odlade kulturen vid 1 bar. Under inkubationstiden på 22 dagar upptäcktes ~ 31 mM och 13 mM järnjärn i analyserna vid 1 bar respektive 100 bar. Detta visar tydligt att de mikrobiella cellerna var aktiva på 100 bar, men deras järnreducerande järns aktivitet var signifikant lägre vid förhöjt tryck. Abiotisk kontroll experiment som utförs i Hungate rör och serum flaskor visade inte järn minskning järnet på 1 bar och 100 bar.

Bilderna på scanningelektronmikroskopi (figur 4) visar stavformade celler som odlas i experiment vid låga och höga tryck. Ingen signifikant förändring i cellmorfologin observerades vid 1 bar kontra 100 bar. Emellertid, celltillväxt var uppenbarligen hämmas av förhöjt tryck, som cell nummer var 1,3 x 108 celler/ml vid 1 bar i jämförelse med 4,5 x 107 celler/ml vid 100 bar7. Dessa data är jämförbara med testerna utförda i Hungate Tubes7. Således hade den flexibla guld-Titan reaktions cellen själv ingen effekt på celltillväxt och var lämplig för mikrobiell tillväxt tester.

Resultaten visar att bio mikroorganismer är aktiva även vid ett högt tryck på 100 bar, som är mycket relevant för in situ biomining eftersom sådana förhållanden förekommer i djupa malmfyndigheter på ett djup under 1 000 m7.

Figure 1
Figur 1: översikt över reaktions cells delarna. Från botten till toppen: guld påsen, Titan krage, Titan huvud, bricka, Titan kompression bult ring, Titan provtagning röret med rostfritt körtlar och kragar för högtryck koned och gängade anslutningar på båda sidor, och Titan ventilen med en adapter för anslutning av en Luer-Låsspruta. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: dimensions ritningar av Titan delar bearbetade från stavar av Titan grade 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: förändringar av järnjärnskoncentrationerna i den guld-Titan reaktions cellen med järn-oxiderande kulturen. Celler odlades anaerobt vid 30 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: morfologi av järn-oxiderande kultur odlas på 1 bar och 100 bar. Celler odlades anaerobt vid 30 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den presenterade metoden för experiment med högt tryck av mikrobiella reaktioner inom sura lösningar var ett kraftfullt verktyg för att simulera djupa geomicrobiological processer under ytan i laboratoriemiljö.

Det finns många manuella arbetsmoment inblandade, av vilka vissa kräver särskild uppmärksamhet. Som en allmän anmärkning skall ingen överdriven kraft användas vid montering av de enskilda delarna av den flexibla guld-Titan cellen och reaktor huvudet (avsnitten 3 och 4). Om tillverkarens specifikationer (t. ex. för maximalt tryck, temperatur, vridmoment) ignoreras, kan läckage och/eller materialfel uppstå.

Rengöring av guld och Titan delar (avsnitt 2,2) är ett oumbärligt arbete steg, inte bara för detta experiment, men särskilt för experiment med (i-) organiska reaktioner. Rester från tidigare experiment i guld cellen kan orsaka oönskade reaktioner och därmed polarisering av resultat. När den sammansatta guld-Titan cellen är installerad i reaktor huvudet, är det bäst att arbeta snabbt och exakt, eftersom det vid denna tid små mängder syre kan komma in i guld cellen. Stänga provtagnings ventilen innan du lämnar glovebox är en bra första åtgärd för att minimera utbytet mellan den omgivande atmosfären med det inre av guld cellen.

När reaktorn är placerad i Gung anordningen, är det viktigt att ställa in den gungande rörelsehastigheten till ~ 170 °/min. Om högtrycks reaktorn rör sig för fort, kan bristning av guld cellen hända på grund av gravitationseffekter eller vassa kanter av sediment eller stenprover när de används.

Denna metod kan användas i ytterligare forskningsområden. Den flexibla reaktions cellen i guld-Titan har potential att användas för en mängd olika vetenskapliga undersökningar9 studera reaktioner vid förhöjt tryck och temperatur och i starkt korrosiva vätskor eller gaser.

Mikroorganismer i den djupa under ytan vid temperaturer över 70 ° c i närvaro av mineraliska ytor kan stimulera produktionen av molekylärt väte eller organiska syror som acetat även under förhöjt tryck16. Dessa produkter, och andra föreningar, kan framkalla förhöjd mikrobiell aktivitet under in situ bioprocesser, utöver de svavelföreningar som undersökts i denna studie.

Tillämpningar omfattar bestämning av löslighet av gaser och joner i vattenhaltiga vätskor, geokemiska reaktioner vid förhållanden i hydrotermiska ventilationssystem17, kvantifiering av isotop fraktionering18, geokemiska reaktioner vid samtidig 2 upptagning19, abiotiska processer under bildandet av olja och gas i käll stenar20, och mikrobiella reaktioner vid förhöjt tryck i under ytan21 som i den aktuella studien.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) för att dela hans expertis på den flexibla guld-Titan reaktions celler, och Georg Scheeder (BGR) för sin input under den inledande fasen av inrättandet av det modifierade systemet i Hannover. Vi vill tacka många forskare (inklusive Katja Heeschen, Andreas RISSE, Jens Gröger-Trampe, Theodor Alpermann) med hjälp av setup i Hannover i många projekt som bidrog i små förbättringar längs vägen och Christian Seeger för att utveckla en gungapparat för högtrycks reaktorerna. Vi tackar Laura Castro (Complutense-universitetet i Madrid) för SEM-observationer. Och slutligen vill vi uttrycka vår tacksamhet till Nils Wölki för att ha producerat denna högkvalitativa video för artikeln. Detta arbete stöddes av EU Horizon 2020 Project BIOMOre (bidragsöverenskommelse # 642456).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Merck 100013
CaN2O6 Fluka 31218
Conax compression seal fittings Conax Technologies PG2-250-B-G sealant could be selected according to temperatures in experiment
Copper paste Caramba 691301
Copper paste CRC 41520
CoSO4x7H2O Sigma 10026-24-1
CrKO8S2x12H2O Roth 3535.3
CuSO4x5H2O Riedel de Haen 31293
Disposable cuvettes Sigma z330388
Ethanol absolute Roth 9065.3
FE-SEM JEOL model no. JSM-6330F
Ferrozine Aldrich 180017
Fe2(SO4)3x7H2O Alfa Aesar 33316
FeSO4x7H2O Merck 103965
Gold cell Hereaus GmbH manufactured according to dimensions supplied by customer
High-pressure reactor PARR Instruments model no. 4650 Series reactors from other vendors could be used, too
High-pressure syringe pump Teledyne ISCO DM-100
HCl Roth 6331.3
HNO3 Fluka 7006
H3BO3 Sigma B6768
KCl Sigma P9541
KH2PO4 Merck 104873
L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C Applichem A1052
Light microscope Leica DM3000
MgSO4x7H2O Merck 105886
(NH4)2SO4 Sigma A4418
NaMoO4x2H2O Sigma 331058
NaO3Sex5H2O Sigma 00163
NaO3V Sigma 590088
Na2SO4 Merck 106649
Na2WO4x2H2O Sigma 72069
NiSO4x6H2O Sigma 31483
Omnifix Luer BRAUN 4616057V
pH meter Mettler Toledo
Redox potential meter WTW ORP portable meter
Safe-Lock Tubes, 2 mL Eppendorf 0030120094
Serum bottle Sigma 33110-U
Spectrophotometer Thermo Scientific model no. GENESYS 10S
Sterican Hypodermic needle BRAUN 4657519
Stoppers Sigma 27234
Sulfur powder Roth 9304
Thoma Chamber Hecht-Assistent
Titanium parts of reaction cell Titan-Halbzeug GmbH 121-238 manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH
Titanium valve Nova Swiss Technologies ND-5002
Whatman membrane filters nylon Sigma WHA7402004
ZnSO4x7H2O Sigma Z4750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, D. B. Biomining goes underground. Nature Geoscience. 8, (3), 165-166 (2015).
  2. Bellenberg, S., et al. Manipulation of pyrite colonization and leaching by iron-oxidizing Acidithiobacillus species. Applied Microbiology and Biotechnology. 99, (3), 1435-1449 (2014).
  3. Christel, S., Fridlund, J., Watkin, E. L., Dopson, M. Acidithiobacillus ferrivorans SS3 presents little RNA transcript response related to cold stress during growth at 8 °C suggesting it is a eurypsychrophile. Extremophiles. 20, (6), 903-913 (2016).
  4. Dopson, M., Ossandon, F. J., Lovgren, L., Holmes, D. S. Metal resistance or tolerance? Acidophiles confront high metal loads via both abiotic and biotic mechanisms. Frontiers in Microbiology. 5, 157 (2014).
  5. Schippers, A., et al. Biomining: metal recovery from ores with microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 141, 1-47 (2014).
  6. Shiers, D., Ralph, D., Bryan, C., Watling, H. Substrate utilisation by Acidianus brierleyi, Metallosphaera hakonensis and Sulfolobus metallicus in mixed ferrous ion and tetrathionate growth media. Minerals Engineering. 48, 86-93 (2013).
  7. Zhang, R., Hedrich, S., Ostertag-Henning, C., Schippers, A. Effect of elevated pressure on ferric iron reduction coupled to sulfur oxidation by biomining microorganisms. Hydrometallurgy. 178, 215-223 (2018).
  8. Dickson, F., Blount, C. W., Tunell, G. Use of hydrothermal solution equipment to determine the solubility of anhydrite in water from 100 degrees C to 275 degrees C and from 1 bar to 1000 bars pressure. American Journal of Science. 261, (1), 61-78 (1963).
  9. Seyfried, W., Gordon, P., Dickson, F. A new reaction cell for hydrothermal solution equipment. American Mineralogist. 64, (5-6), 646-649 (1979).
  10. Cross, M. M., Manning, D. A., Bottrell, S. H., Worden, R. H. Thermochemical sulphate reduction (TSR): experimental determination of reaction kinetics and implications of the observed reaction rates for petroleum reservoirs. Organic Geochemistry. 35, (4), 393-404 (2004).
  11. Frerichs, J., Rakoczy, J., Ostertag-Henning, C., Krüger, M. Viability and adaptation potential of indigenous microorganisms from natural gas field fluids in high pressure incubations with supercritical CO2. Environmental Science & Technology. 48, (2), 1306-1314 (2014).
  12. Heeschen, K., Risse, A., Ostertag-Henning, C., Stadler, S. Importance of co-captured gases in the underground storage of CO2: Quantification of mineral alterations in chemical experiments. Energy Procedia. 4, 4480-4486 (2011).
  13. Wakeman, K., Auvinen, H., Johnson, D. B. Microbiological and geochemical dynamics in simulated-heap leaching of a polymetallic sulfide ore. Biotechnology and Bioengineering. 101, (4), 739-750 (2008).
  14. Pakostova, E., Grail, B. M., Johnson, D. B. Indirect oxidative bioleaching of a polymetallic black schist sulfide ore. Minerals Engineering. 106, 102-107 (2017).
  15. Lovley, D. R., Phillips, E. J. Rapid assay for microbially reducible ferric iron in aquatic sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53, (7), 1536-1540 (1987).
  16. Parkes, R. J., et al. Prokaryotes stimulate mineral H2 formation for the deep biosphere and subsequent thermogenic activity. Geology. 39, (3), 219-222 (2011).
  17. McCollom, T. M. Abiotic methane formation during experimental serpentinization of olivine. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 113, (49), 13965-13970 (2016).
  18. Pester, N. J., Conrad, M. E., Knauss, K. G., DePaolo, D. J. Kinetics of D/H isotope fractionation between molecular hydrogen and water. Geochimica et Cosmochimica Acta. 242, 191-212 (2018).
  19. Rosenbauer, R. J., Thomas, B., Bischoff, J. L., Palandri, J. Carbon sequestration via reaction with basaltic rocks: Geochemical modeling and experimental results. Geochimica et Cosmochimica Acta. 89, 116-133 (2012).
  20. Knauss, K. G., Copenhaver, S. A., Braun, R. L., Burnham, A. K. Hydrous pyrolysis of New Albany and Phosphoria Shales: production kinetics of carboxylic acids and light hydrocarbons and interactions between the inorganic and organic chemical systems. Organic Geochemistry. 27, (7-8), 477-496 (1997).
  21. Parkes, R. J., et al. Culturable prokaryotic diversity of deep, gas hydrate sediments: first use of a continuous high-pressure, anaerobic, enrichment and isolation system for subseafloor sediments (DeepIsoBUG). Environmental Microbiology. 11, (12), 3140-3153 (2009).
Använda flexibla reaktions celler i guld-Titan för att simulera tryck beroende mikrobiell aktivitet i samband med subsurface-Biomining
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ostertag-Henning, C., Zhang, R., Helten, O., Weger, T., Schippers, A. Using Flexible Gold-Titanium Reaction Cells to Simulate Pressure-Dependent Microbial Activity in the Context of Subsurface Biomining. J. Vis. Exp. (152), e60140, doi:10.3791/60140 (2019).More

Ostertag-Henning, C., Zhang, R., Helten, O., Weger, T., Schippers, A. Using Flexible Gold-Titanium Reaction Cells to Simulate Pressure-Dependent Microbial Activity in the Context of Subsurface Biomining. J. Vis. Exp. (152), e60140, doi:10.3791/60140 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter