Summary
ここでは、気管支肺胞洗浄剤や血清などの生体液中のキチナーゼ活性を測定する簡単な方法を示す。
Abstract
チチナセは、チチンをクアッヒする酵素です。チチンが存在しない場合でも、哺乳類はベースラインを含む体内に大量のチチナラが存在する。キチナゼの正確な役割は知られていないが、キチン含有食品および病原体に対する消化および宿主防御において重要な役割を果たすと考えられていた。私たちをはじめとする最近の研究は、宿主免疫およびアレルギー疾患におけるチチナゼおよびチチラーゼ様タンパク質の重要な役割を示している。重要なことに、キチナゼ活性は、喘息や肺線維症などの2型炎症性疾患を含む広範囲の疾患における疾患重症度の重要なバイオマーカーとして機能する。同様に、ガウチャー病のような遺伝性疾患を有する患者は、病気の重症度と相関するだけでなく、治療効果のための信頼性の高いバイオマーカーとしても機能するチチラーゼレベルを有意に上昇させました。ここで概説するプロトコルは、マウスのBALまたは血清サンプルにおけるチチラーゼ活性を測定する簡単で迅速かつ簡単な方法を説明し、酵素の高度に保存された性質のためにヒト被験者および他のモデル生物に広く適応することができる。
Introduction
キチンは、セルロースに次いで地球上で2番目に豊富な多糖類で、昆虫、真菌、酵母、藻類の外骨格を含む様々な生物の主要な構造成分として機能します。一部の脊椎動物はまた、チチン1を持っています.チチナセは、チチンを分解することができる酵素のファミリーであり、細菌から哺乳類2、3に至るまで種の進化を通じて高度に保存されています。哺乳類は、チチナーゼに加えて、チチナーゼに似たチチナーゼ様タンパク質を持ち、チチナーゼを結合する能力はありますが、チチン4を包丁する酵素能力が欠如しているという点で異なります。
1900年代初頭にさかのぼる調査で、チチンとチチナセは長い間研究されてきましたが、主な焦点は昆虫や他の無脊椎動物における役割に焦点を当ててきました。実際、脊椎動物がチチナラを全く持つことが判明したのは1960年代になってからでした。キトビアスベースのアッセイを用いて、トカゲやブラックバードを含む多数の脊椎動物の消化管にキチナセが見つかることを示した。.
哺乳類は、酸性哺乳動物キチチナゼ(AMCase;CHIT2およびCHIAとも呼ばれる)とキトトリオシダーゼ(CHIT1)4の2つの酵素活性形態を有する。これらのタンパク質の両方が加水分解チチンが可能である。しかし、CHIT1はヒトにおいてより酵素的に活性であり、そこではほとんどすべてのチチナゼ活性がCHIT1に由来する。4マウスにおいて、Chit1およびAMCaseの両方が、全体的なチチナゼ活性6にほぼ等しく寄与する。一方、チチナゼ様タンパク質はチチナゼ活性を欠いている。
Chit1は主にマクロファージによって分泌され、しばしばチチン含有病原体7に対する免疫応答であると考えられている。この酵素はまた、基板キチン8の存在がなくても、M1およびM2マクロファージサブタイプの両方に単球の成熟に関与することが示されている。さらに、Tヘルパー2(Th2)細胞および好酸球を含む他の免疫細胞の成熟に関与し得る-クリプトコッカス肺感染症9の場合に示された。これらの研究は、免疫系におけるチチナセの複雑な役割を指摘している。
近年、Chit1レベルは、リソソーム貯蔵疾患、感染症、呼吸器疾患、内分泌疾患、心血管を含む40種類以上のヒト疾患の進行の重要なバイオマーカーとして機能することが見出されている。疾患、神経疾患、およびその他(レビュー10)。これらの疾患の多くにおいて、Chit1のレベルは、疾患の重症度および治療効果10の強力な予測変数である。
チチナゼは、ガウチャー病を含む多数の病状のバイオマーカーとしての評判を得ているように、ツールやアッセイは、チチラーゼの存在のためのテストを容易にするために開発されています。古い方法には、Schalesの手順、血糖試験から適応されたプロトコル、および3,5ジトロサルチル酸(DNS)法が含まれる。しかし、これらの方法は、多くの場合、時間に敏感で技術的に困難です 11.これらの試験の両方の手順は、無機酸化剤の減少を必要とし、例えばシェールの手順の場合にはフェリシアニドは、分光光量測定のみ測定することができる色の変化を生み出す。さらに、両方のテストは、時間がかかり、色が12、13を開発するために必要な加熱または沸騰ステップを伴います。
ここで説明する哺乳動物試料14,15におけるキチナゼレベルを決定するための迅速かつ簡単なフッ素測定アッセイである。ここで使用されるサンプルの2つは血清および気管支胞洗浄液(BAL)を含む;キチターゼ活性は母乳および尿試料でも測定されており、その技術は、これらのタイプのサンプルおよび他の生物学的流体16、17において行うことができる。
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Protocol
すべての動物の手順は、イェール大学医学部でIACUC承認プロトコルの下で行われました.
1. マウスサンプルコレクション
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麻酔
- ケタミンとキシラジンを使用してマウスを麻酔する (ケタミンの 100 mg/kg とキシラジンの 10 mg/kg).
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血液サンプル収集
- つま先のピンチに対する非応答性によって麻酔の深さを確認する。
- 胸腔を外科的に開き、心臓を露出させる。
- 左心室に26.5Gの針を挿入し、注射器に血液を集める。
注:典型的には、約0.5-1 mLの血液は、健康な20-25グラムのマウスから採取することができる。 - 血漿収集用のヘパリン化チューブ、または血清採取用の非ヘパリン化チューブで血液を採取する。
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気管支器洗浄液の回収(BAL)
- BALを収集するには、気管を露出させるために首に垂直カットを行います。
- 22Gカテーテルで気管をカニューレし、マウスの鼻から漏れないように紐でしっかりと固定します。
- 無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、各0.75mL)の2つのアリコートを気管を介して肺にゆっくりと注入し、取り戻します。
- プールアリコートとさらなる分析のために氷の上に保ちます。
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生体試料を処理する。
- 血液サンプル:新鮮な(血漿)または4時間(血清)の凝固を可能にした後、遠心分離機を10分間600xgで行う。 上清を取り、貯蔵または実験のために使用するために凍結します。
- BAL: サンプルを 350 x gで 5 分間遠心分離します。上清を取り、貯蔵または実験のために使用するために凍結します。
2. チチナゼアッセイ
注:アッセイの背後にある科学は比較的単純です。非蛍光基板は、酵素活性チチナゼによってcリーブされ、蛍光産物を生成し、次いでチチナゼ活性の間接マーカーとして測定される。試料内のキチナーゼは、1x McIlvainバッファー中に存在する基板4-メチルベルリフィル-D-N、N'-ジアセチルキトビオースを分解する。蛍光分子4-メチルランベルリライフリルが放出される。各ウェルの全蛍光を測定することにより、各試料中の活性チチナゼの正確な測定を得る。キシナーゼによるチチンの内訳は加水分解反応であるため、ストップバッファーは、0.3MグリシンとNaOH(pH10.6で12.0g/L)の混合物で、酵素が機能するにはあまりにも基本的な環境を作り出すことによって、チチンの分解を終了する。
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基板、規格、およびソリューションを準備します。
- McIlvain バッファを準備します。McIlvainバッファーは、pH 5.2で0.1Mクレートおよび0.2Mリン酸で構成される。1x McIlvainバッファーに対して1:1の比率で希釈する。
- 4-メチルベルライフリル-D-N、N'-ジアセチルキトビオースおよび4-メチルベルリフィルθ-N、N'、N'-トリアセチルキトトリオー症の両方を1xマチルバインバッファーに溶解し、それぞれ500μMμMの濃度にする。
注:ストックソリューションは、さらなる使用のために-20 °Cで保存することができます。最高のアリコートに保存されます。 - 標準、4-メチルルンベリフェロンを、ストップバッファー内の0.1mMの濃度(0.3MグリシンとNaOHの混合物(pH 10.6の12.0g/L))に溶解し、標準曲線ストック溶液を作成する。
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作業ソリューションを作成してプレートします。
- 1x McIlvainバッファーとキチン基板4-メチルベルライフリル-D-N、N'-ジアセチルキトビオースを組み合わせて作業溶液を作成します。10サンプルごとに、1x McIlvainバッファーの2.17 mLと基板の100 μLを混合します。サンプルサイズに基づく追加計算については、表 1を参照してください。
注:ヒトサンプルには4-メチルベルリフィルθ-D-N、N'、N"-トリアセチルキトトリオールを使用します。両方の基板は、ヒトまたはマウスの酵素のいずれかによって切断することができるが、それらは切断6の効率に基づいてヒトまたはマウスのサンプルのいずれかに割り当てられている。 - 96ウェルプレートの各ウェルに働く溶液のピペット95 μL。
- 1x McIlvainバッファーとキチン基板4-メチルベルライフリル-D-N、N'-ジアセチルキトビオースを組み合わせて作業溶液を作成します。10サンプルごとに、1x McIlvainバッファーの2.17 mLと基板の100 μLを混合します。サンプルサイズに基づく追加計算については、表 1を参照してください。
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生体試料サンプルを作動溶液に追加します。
- 次に、各ウェルに試験試料(血液/BAL/組織リサート/その他の生体液)の5μLを加えます。
- 最も正確で信頼性の高い結果を出すには、サンプルを作業ソリューションに混ぜます。
注:サンプルは、潜在的なエッジ効果に特別な注意を払って、複製/三つ複製で実行する必要があります。エッジ効果を最小限に抑えるには、すべてのサンプルを事前に温める必要があります。アッセイは、試料中のチチナセと作業溶液中の基板との間の反応を伴うので、最初のサンプルがめっきされ、最後のサンプルがめっきされた時の時間の差を最小限に抑えるために比較的迅速に作業することをお知りください。マルチチャンネルピペットをお勧めします。
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37 °Cでインキュベートします。
- プレートを覆い、短く振ります(5s)。
- プレートを37°Cで15分間インキュベートします。これにより、酵素反応が起こることができます。
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標準カーブを準備します。
- 試料がインキュベートされている間、酵素活性のフッ素測定でしばしば使用される標準である4-メチルムベリフェロンの連続希釈を調製する。
- ストップバッファー内の標準溶液のストックを5μMの濃度に希釈します。
- 表 2に示すように、一連の希釈を実行します。指定された量の成分を追加し、よく混ぜます。
注:標準曲線は、測定されたサンプルが標準曲線の線形範囲に収まります。
-
ストップ バッファでの反応を停止します。
- 各ウェルに200μLのストップバッファを追加し、反応を停止します。
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標準をプレートします。
- 同じプレート上の複製でウェルあたり各規格の300 μLを追加します。
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蛍束リーダーを使用してプレートを読みます。
- 360 nmの励起でプレートを読み取り、455 nmの放出を読みます。
3. データ分析
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ブランクを減算する
- 4-メチルランベリフェロンを持たない重複標準希釈の値を平均します。この値は、記録された他のすべての値から減算します。
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技術的な反復の平均を取り、標準をプロットします。
- 各濃度の 2 つの測定値を平均し、濃度による平均読み取り値をグラフ化します。
注:結果のプロットは線形に見え、R2値は 1 に近い値になります。そうでない場合は、標準を再行し、データ分析の品質を確保するためにプレートを再読み取る必要があります。
- 各濃度の 2 つの測定値を平均し、濃度による平均読み取り値をグラフ化します。
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読み出し値を標準化します。
- プロットされた標準データに最適な線を作成します。サンプルの読み出しを、最適な線の傾きで除算します。
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制御グループと変数グループの値を比較します。
- t 検定または分散分析を使用して、2 つ以上のグループに対して、グループ間の差が統計的に有意かどうかを判断します。値は単位 nmol/mL·h を取ります。
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Representative Results
ここで示す結果は、ドキシサイクリンプロモーター上でChit1遺伝子を過剰発現する野生型(C57BL/6)およびChit1トランスジェニックマウス(C57BL/6バックグラウンド上)の血清およびBALサンプルにおけるキチネーゼ活性を測定した研究から得られたものである。我々のデータは、血清およびBALサンプルの両方がベースライン698.2±189.9 nmol/mL·hおよび485.7 ±114 nmol/ml·hで検出可能なキチナーゼ活性を有することを示している。4週間の飲料水中のドキシサイクリンを用いたChit1遺伝子の過剰発現は、BAL(4,575 ±673.8 nmol/mL·h、p=0.003)および血清1556±251.2nmol/mLh、p=022と比較した場合に観察されたキチナーゼ活性の上昇をもたらした。)サンプル。
ここで説明するプロトコルを用いて、アッセイは、マウスにおけるChit1遺伝子の過剰発現がチチナゼ活性の増加をもたらすことを確認する。t検定を用い、2つのグループの平均を比較した。各群は5匹のマウスを含んでいた。
図1:チチナセ活性。キチナーゼ活性は、(A)血清および(B)野生型(WT)およびキトトリオシダーゼ(ChitTg)過剰発現トランスジェニックマウスの気管支アルベオロラー洗浄液で測定した。各ドットは、個々のマウス サンプルを表します。(C) 値は、プロトコルに記載されている標準曲線の線形性を用いて標準化された。蛍光レベルは、励起のための360nmの波長のプレートリーダーを用いて測定し、発光のために455 nmを測定し、AUとして提示した。AU = 任意の単位 *p < 0.05, ***p < 0.001.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| サンプルウェル数 | 基板(μL) | マクイルヴァン バッファー (mL) |
| 20 | 100 | 2.17 |
| 50 | 250 | 5.425 |
| 100 | 500 | 10.85 |
表 1: 作業ソリューションを作成するための計算例。
| (μL) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 簡潔 (nM) | 0 | 125 | 250 | 375 | 500 | 625 | 750 | 875 |
| 標準 | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | 120 | 140 |
| 2x マクイルビアン | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| 蒸留 H2O | 200 | 180 | 160 | 140 | 120 | 100 | 80 | 60 |
| バッファの停止 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 |
表 2: 標準曲線測定の希釈。
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Discussion
チチナゼ活性は、疾患の重症度、疾患の進行、治療効果および特定病原体の存在を予測するための重要なバイオマーカーとして出現している18。チチラーゼの役割に関する長い仮定理論の多くは実験的に証明されていないが、新しい研究は、様々な疾患におけるタンパク質のようなチチナゼとチチナゼの役割に重要な洞察を提供している2、 9,20.
ここで説明するプロトコルは、生物学的サンプル中のキチナゼ活性を測定する簡単で迅速かつ効果的な方法です。キチナセの保存性が非常に高いため、多種多様な生物学的サンプルおよび種におけるキチナゼ活性を測定するために、ほとんどまたは全く修飾が必要とされていない。このプロトコルにリストされているのは2つの基板で、そのうちの1つはマウスサンプル用に指定され、もう1つはヒトサンプル用です。しかし、両方の基板は、酵素が基板を包丁化できる効率の以前の論文のデモンストレーションに基づいて指定されているように、どちらの種でも使用することができます。
Schalesの手順やDNS法などの既存の手法と比較して、ここで概説するアッセイは、古い方法で必要とされていた沸騰や加熱などの時間のかかるステップの必要性を排除します。さらに、アッセイは技術的に難しくなく、前述の測定技術よりも複雑なステップが少なくて済みます。最良の結果を出すには、生物学的および技術的な複製の両方を使用する必要があります。
キチナゼ活性が高すぎる場合、生体試料の希釈は測定のためのキチナゼ活性を減少させるのに十分であり、希釈に基づいて真の値を計算することができる。新しい生物学的サンプルでこの実験を行う場合、最良の結果を得るために適切なインキュベーション時間を確保するために、飽和するまで同じプレート上で時間をかけて繰り返し測定を行うことが役立つことがあります。さらに、グループ間の整合性が維持されている限り、プロトコルをスケールアップまたはスケールダウンできます。このプロトコルの将来の応用は、研究が多くの疾患におけるチチナゼ活性の役割を持ち上げているので、はるかに達しています。
キチラーゼ活性が関連することが判明した疾患の最初のカテゴリーの1つは、ガウチャー病、ニーマンピックA/BおよびC、GM-1ギャングリオシダ症、および他の多くの21を含むリソソーム貯蔵疾患であった。ゴーシェ病は、グルコセロアブロシダーゼの不十分な活性によって引き起こされるリソソーム貯蔵疾患であり、グルコセルブロシダーゼの基質であるグルコセルセラミドの蓄積によって特徴付けられ、マクロファージ15のリソソーム中である。脾臓および肝臓の肥大、低血小板数、貧血、疲労、および骨の問題を含む臨床症状を伴う遺伝性疾患22である。臨床研究は、ゴーシェ病に苦しむ人々の大半が、通常のコントロールボランティアの中央値の600倍以上の中央値のチチラーゼ活性を有することを実証しました。さらに、ガウチャー病の人々が酵素補充療法(疾患の現在の治療)に置かれたとき、彼らのチチナゼ活性レベルは、両方の疾患の優れたマーカーとなるチチナゼ活性を有意に低下した。進行および治療モニタリング15.しかし、この病気におけるChit1の役割はまだ見つかっていない。同様の研究は、他の多数のリソソーム貯蔵疾患10に対するChit1活性モニタリングにつながっている。
さらに、真菌感染症、マラリア、結核、K.肺炎を含む様々な病原体感染中のChit1活性の潜在的な役割を示すさらなる研究は、いくつかの2、3、10を名にする.2012年の研究では、痰スミアが陰性であっても活動性結核(TB)感染患者においてチチナゼ活性が上昇していることが判明し、特に結核診断においてチチナゼ活性が有効なバイオマーカーとして使用できることを示した。病気23を正確に診断するためにしばしば必要な長い待ち時間。同様の所見は、プラズモジウムファルシパラム感染時に見られ、キトトリオシダーゼ血清レベルは急性感染症24で有意に増加した。これらの疾患の多くは診断に数日を要しますが、血液中のチチラーゼ活性レベルの迅速な測定は、診断に有益な洞察を提供することができます。さらに、マラリア原虫や結核菌が治療に対してますます耐性を増すにつれて、血清中のチチラーゼ活性レベルを測定することは、リアルタイムでの治療のモニタリングに役立つ可能性があります。
ますます多くの研究は、免疫応答におけるキチナゼおよびキチナセ様タンパク質の役割、特に炎症経路におけるその役割に焦点を当て始めている。この研究が続くにつれて、このプロトコルは、さらなる研究のために、このチチナゼ活性の迅速かつ正確な測定を可能にします。このプロトコルは、マウスとヒトの両方を含む任意の数の種サンプルに対して容易に調整され、広く適用可能です。
研究上の利点に加えて、サンプル中のチチナゼ活性を検出および測定するためのより良い方法は、臨床領域で有益になります。最近の研究は、ガウチャー病、糖尿病、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患および癌を含む多数の慢性疾患の病理学におけるバイオマーカーとしてのキチナゼの役割を実証している3、 21、25、26.
バイオマーカーとしてのこの役割のために、ここに示すようにチチナゼ活性の迅速かつ正確な測定は、医療の分野に非常に関連しており、医療従事者が適切な診断と治療計画のためのより多くの情報を持つことができます。
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Disclosures
なし。
Acknowledgments
この研究は、米国肺協会と米国胸部学会賞のLSに対する支援を受けました。著者は、トランスジェニックマウス株を提供してくれたジャック・イライアス博士とチュン・ジュン・リー博士に心から感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
References
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