Summary
Presenteras här är en enkel metod för att mäta Chitinase aktivitet i biologiska vätskor såsom bronalveolärt pumpning eller serum.
Abstract
Chitinases är de enzymer som klyva kitin. Även i avsaknad av Chitin, mammalianer har betydande mängder chitinases närvarande i kroppen, inklusive vid baseline. Den exakta roll Chitinase är inte känt, men det ansågs att spela viktig roll i matsmältningen och värd försvar mot Chitin-innehållande mat och patogener, respektive. Nyligen arbete, inklusive vår, har visat en viktig roll för Chitinase och Chitinase-liknande proteiner i Host immunitet och allergiska sjukdomar. Viktigare, Chitinase verksamhet fungera som viktiga biomarkörer för sjukdomens svårighetsgrad i ett brett spektrum av sjukdomar inklusive typ 2 inflammatoriska sjukdomar såsom astma och lungfibros. På samma sätt, patienter med genetiska sjukdomar som Gauchers sjukdom har signifikant förhöjda Chitinase nivåer, som inte bara korrelerar med sjukdoms svårighetsgrad utan också fungera som en pålitlig biomarkör för terapeutisk effektivitet. Det protokoll som beskrivs här beskriver ett enkelt, snabbt och enkelt sätt att mäta Chitinase aktivitet i BAL eller serum prover av möss och kan vara allmänt anpassade till människor och andra modellorganismer på grund av den mycket bevarade karaktären av enzymerna.
Introduction
Chitin är den näst vanligast förekommande polysackarid på jorden efter cellulosa, som fungerar som en viktig strukturell komponent i en mängd olika organismer, inklusive exoskelett av insekter, svampar, jäst, och alger; vissa ryggradsdjur har också Chitinen1. Chitinases är en familj av enzymer som kan bryta ner Chitinen och är mycket bevaras under hela evolutionen i arter som sträcker sig från bakterier till däggdjur2,3. Förutom chitinases, däggdjur har också Chitinase-liknande proteiner som liknar chitinases i sin förmåga att binda Chitinen men skiljer sig i att de saknar enzymatisk förmåga att klyva den Chitinen4.
Även om Chitinen och chitinases har länge studerats-med utredningar som går tillbaka till början av 1900-talet-har huvudfokus legat på deras roll i insekter och andra ryggradslösa djur. I själva verket var det inte förrän på 1960-talet när ryggradsdjur konstaterades ha chitinases alls. Med hjälp av en chitobiase-baserad analys, chitinases visades finnas i mag-tarmkanalen hos ett antal ryggradsdjur inklusive ödlor och koltrastar-en observation hypotes att bero på konsumtion av Chitin-innehållande organismer såsom insekter5 .
Däggdjur har två enzymatiskt aktiv bildar av Chitinase: surt däggdjur Chitinase (AMCase; också bekant som CHIT2 och CHIA) och chitotriosidas (CHIT1)4. Båda dessa proteiner kan hydrolysera kitin. Emellertid, CHIT1 är mer enzymatiskt aktiv hos människor, där nästan alla Chitinase aktivitet härleds från CHIT1. 4 i möss, både Chit1 och amcase nästan lika bidra till den totala Chitinase aktivitet6. Å andra sidan, Chitinase-liknande proteiner saknar Chitinase aktivitet.
Chit1 utsöndras huvudsakligen av makrofager och anses ofta vara ett immunsvar mot Chitin-innehållande patogener7. Enzymet har också visat sig vara inblandade i mogningen av monocyter i både M1 och m2 makrofage subtyper, även utan närvaro av substratet Chitinen8. Dessutom, det kan också vara inblandade i mogningen av andra immunceller inklusive T Helper typ 2 (TH2) celler och eosinofiler — som visades vara fallet i kryptokockmeningit lunginfektion9. Dessa studier pekar på en komplex roll av chitinases i immunförsvaret.
Under de senaste åren har Chit1 nivåer visat sig fungera som en viktig biomarkör för progression för över 40 olika mänskliga sjukdomar inklusive lysosomala lagrings sjukdomar, infektionssjukdomar, luftvägssjukdomar, endokrinologiska sjukdomar, kardiovaskulära sjukdomar, neurologiska sjukdomar och andra (Recenserad10). I många av dessa sjukdomar, nivåerna av Chit1 är en stark prediktor för sjukdomens svårighetsgrad och terapeutisk effektivitet10.
Som chitinases har fått ett rykte som en biomarkör för många sjukdomstillstånd inklusive Gauchers sjukdom, verktyg och analyser har utvecklats för att underlätta testning för Chitinase närvaro. Äldre metoder inkluderar Schales förfarande, ett protokoll som anpassats från ett blodglukos test, och den 3, 5 dinitrosalicylsyra (DNS) metod. Dessa metoder är dock ofta tidskänsliga och tekniskt svåra11. Förfarandet för båda dessa tester kräver reduktion av oorganiska oxidanter, ferricyanid i fallet med Schales ' förfarande till exempel, som producerar en färgförändring som endast kan mätas spektrofotometriskt. Dessutom, båda testerna innebär ett värme-eller Kok steg som är både tidskrävande och nödvändigt för att färgen ska utveckla12,13.
Beskrivs här är en snabb och enkel fluorimetrisk analys för att bestämma Chitinase nivåer i däggdjurs prov14,15. Två av de prover som används här inkluderar serum och bronalveolär sköljning vätskor (BAL); chitinas aktivitet har också mätts i bröstmjölk och urinprov, och tekniken kan utföras i dessa typer av prover samt i någon annan biologisk vätska16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt ett IACUC-godkänt protokoll vid Yale University School of Medicine.
1. mus provsamling
-
Anesthetization
- Anesthetize möss med ketamin och xylazin (100 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin).
-
Blodprov samling
- Bekräfta djupet av anestesi genom bristande respons på en tå nypa.
- Kirurgiskt öppna brösthålan för att exponera hjärtat.
- Sätt i en 26,5 G nål i den vänstra ventrikeln och samla in blod i en spruta.
Anmärkning: Typiskt, ca 0.5 – 1 mL blod kan skördas från en hälsosam 20 – 25 g mus. - Samla in blod i hepariniserad rör, för plasma insamling, eller icke-hepariniserad rör för serum uppsamling.
-
Uppsamling av bronalveolär pumpning vätska (bal)
- För att samla in BAL, gör en vertikal klippa på halsen för att exponera luftstrupen.
- Kanylera luftstrupen med en 22 G kateter och säkra den stadigt med hjälp av en sträng för att förhindra läckage ur näsan av musen.
- Injicera långsamt två portioner av steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 0,75 mL vardera) i lungorna via luftstrupen och återhämtar sig.
- Pool alikvoter och hålla på is för vidare analys.
-
Bearbetning av de biologiska proverna.
- Blodprov: antingen färskt (plasma) eller efter att ha kunnat koagulera för 4 h (serum), Centrifugera vid 600 x g i 10 min. Ta supernatanten och antingen frysa för lagring eller använda för experiment.
- BAL: Centrifugera provet vid 350 x g i 5 min. Ta supernatanten och antingen frysa för lagring eller använda för experiment.
2. Chitinase analys
Anmärkning: Vetenskapen bakom analysen är relativt enkel. En icke-fluorescerande substrat klyvs av enzymatiskt aktiva Chitinase att producera en fluorescerande produkt, som sedan mäts som en indirekt markör för Chitinase aktivitet. Den chitinases inom proverna bryta ner substratet 4-methylumbelliferyl-D-N,, N'-diacetylchitobiose närvarande i 1x McIlvain buffert. En fluorescerande molekyl 4-methylumbelliferyl släpps. Genom att mäta den totala fluorescensen i varje brunn får vi en noggrann mätning av den aktiva chitinas i varje prov. Eftersom nedbrytningen av chitinen av Chitinase är en hydrolytisk reaktion, slutar bufferten, en blandning av 0,3 M glycin och NaOH (12,0 g/L vid pH 10,6), avslutar nedbrytningen av kitin genom att skapa en miljö som är alltför grundläggande för enzymet att fungera.
-
Förbered substrat, standarder och lösningar.
- Förbered McIlvain buffert. McIlvain buffert består av 0,1 M citrat och 0,2 M fosfat vid ett pH på 5,2. Späd med ett förhållande på 1:1 för 1x McIlvain buffert.
- Lös både 4-metylumbelliferyl-D-N,, N'-diacetylchitobiose och 4-methylumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetylchitotriose i 1x McIlvain buffert till en koncentration av 500 μM vardera.
Anmärkning: Stamlösning kan förvaras vid-20 ° c för vidare användning; bäst lagras i alikvoter. - Lös upp standard, 4-metylumbelliferone, till en koncentration av 0,1 mM i stoppbuffert (blandning av 0,3 M glycin och NaOH (12,0 g/L vid pH 10,6)) för att skapa standardkurvan stamlösning.
-
Skapa och platta arbetslösningen.
- Kombinera 1x McIlvain buffert och Chitinen substrat 4-methylumbelliferyl-D-N,, N'-diacetylchitobiose att skapa arbetslösning. För varje 10 prover, blanda 100 μL substrat med 2,17 mL 1x McIlvain buffert. Se tabell 1 för ytterligare beräkningar baserade på urvalsstorlek.
Anmärkning: Använd 4-metylumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetylchitotriose för humana prover. Medan båda substrat kan klyvas av antingen mänskliga eller mus enzymer, de har tilldelats för antingen människa eller mus prover baserat på effektiviteten i klyvning6. - Pipettera 95 μL arbetslösning i varje brunn på en 96-brunn-platta.
- Kombinera 1x McIlvain buffert och Chitinen substrat 4-methylumbelliferyl-D-N,, N'-diacetylchitobiose att skapa arbetslösning. För varje 10 prover, blanda 100 μL substrat med 2,17 mL 1x McIlvain buffert. Se tabell 1 för ytterligare beräkningar baserade på urvalsstorlek.
-
Tillsätt biospecimen prover till arbetslösningen.
- Tillsätt därefter 5 μL av provet (blod/BAL/vävnads-lysat/annan biologisk vätska) till varje brunn.
- Blanda provet i arbetslösningen för de mest exakta och pålitliga resultaten.
Anmärkning: Prover bör köras i dubbletter/triplicates med särskild uppmärksamhet ägnas åt potentiella kanteffekter. Alla prover ska förvärmas för att minimera kant effekten. Eftersom analysen innebär en reaktion mellan chitinases i provet och substrat i arbetslösningen, är det bäst att arbeta relativt snabbt för att minimera skillnaden i tid mellan när det första provet är pläterad och det sista provet är pläterad. Multikanalpipett rekommenderas.
-
Inkubera vid 37 ° c.
- Täck plattan och skaka kort (5 s).
- Inkubera plattan vid 37 ° c i 15 min. Detta gör att den enzymatiska reaktionen kan äga rum.
-
Förbered standardkurvan.
- Medan proverna inkuberar, förbereda en seriell utspädning av 4-metylumbelliferone, en standard som ofta används i fluorimetriska bestämning av enzymaktivitet.
- Späd ut beståndet av standardlösningen i stoppbuffert till en koncentration på 5 μM.
- Utför en serie utspädningar som anges i tabell 2. Tillsätt komponenterna i det angivna beloppet och blanda väl.
Anmärkning: Standardkurvan hjälper till att säkerställa att uppmätta prover faller inom den linjära räckvidden för standardkurvan.
-
Stoppa reaktionen med stoppbuffert.
- Tillsätt 200 μL av stoppbufferten till varje brunn för att stoppa reaktionen.
-
Plattan normerna.
- Tillsätt 300 μL av varje standard per brunn i dubbletter på samma platta.
-
Läsplattan med en fluorometriska läsare.
- Läsplattan vid en excitation av 360 nm, och ett utsläpp av 455 nm.
3. analys av data
-
Subtrahera de tomma
- Genomsnittet av de dubbla standardspädningar som inte har någon 4-methylumbelliferone. Subtrahera det här värdet från alla andra registrerade värden.
-
Ta genomsnittet av tekniska replikat och kartlägga standarderna.
- Genomsnittet de två avläsningar för varje koncentration och grafen den genomsnittliga behandlingen genom koncentration.
Anmärkning: Den resulterande tomten ska se linjär och ha ett R2 -värde nära 1. Om det inte gör det, kan det vara nödvändigt att göra om standarderna och läsa plattan för att säkerställa kvaliteten på dataanalys.
- Genomsnittet de två avläsningar för varje koncentration och grafen den genomsnittliga behandlingen genom koncentration.
-
Standardisera de avläsnings värden.
- Skapa en bäst lämpade linje för plottade standarddata. Dela upp avläsningar av proverna med lutningen på den bäst lämpade linjen.
-
Jämför värden från kontrollgrupp och Variabelgrupp.
- Använd ett t-test eller ANOVA, för mer än två grupper, för att avgöra om skillnaden mellan grupperna är statistiskt signifikant. Värdena kommer att ta enheterna nmol/mL · h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten som visas här är från en studie som mäter Chitinase aktivitet i serum och BAL prover av vildtyp (C57BL/6) och Chit1 transgena möss (på C57BL/6 bakgrund) som överuttrycker Chit1 genen på en doxycyklin promotor. Våra data visar att både serum och BAL prover har detekterbar Chitinase aktivitet vid baseline 698,2 ± 189,9 nmol/mL · h och 485,7 ± 114 nmol/ml · h, respektive. Överuttryck av Chit1 genen med doxycyklin i dricksvatten i 4 veckor resulterade i förhöjning av Chitinase aktivitet som observerades i både BAL (4 575 ± 673,8 nmol/mL · h, p = 0,003) och serum 1556 ± 251,2 nmol/mL · h, p = 0,0272, jämfört med baslinjen prover.
Med hjälp av det protokoll som beskrivs här, bekräftar analysen att överuttryck av Chit1 genen i möss resulterar i ökad Chitinase aktivitet. Ett t-test användes för att jämföra de två gruppernas medel. Varje grupp innehöll 5 möss.
Figur 1: Chitinase aktivitet. Chitinas aktivitet mättes i (a) serum och (B) bronkialveolär pumpning vätska av vildtyp (WT) och chitotriosidas (chittg) överuttrycker transgena möss. Varje punkt representerar ett enskilt mus prov. Cvärdena standardiserades med hjälp av Lineariteten hos standardkurvan enligt beskrivningen i protokollet. Fluorescensnivåer mättes med en Plattläsare vid våglängd på 360 Nm för excitation och 455 Nm för utsläpp och presenterades som AU. AU = godtycklig enhet * p < 0,05, * * * p < 0,001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antal Provbrunnar | Substrat (μL) | McIlvain buffert (mL) |
| 20 | 100 | 2,17 |
| 50 | 250 | 5,425 |
| 100 | 500 | 10,85 |
Tabell 1: exempel beräkningar för att skapa arbetslösningen.
| ΜL | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Konc. (nM) | 0 | 125 | 250 | 375 | 500 | 625 | 750 | 875 |
| Standard | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | 120 | 140 |
| 2x McIlvian | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| Destillerat H2O | 200 | 180 | 160 | 140 | 120 | 100 | 80 | 60 |
| Stoppbuffert | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 |
Tabell 2: spädningar för mätningar med standardkurva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chitinase aktivitet har vuxit fram som en viktig biomarkör för att förutsäga sjukdomens svårighetsgrad, sjukdomsprogression, terapeutisk effektivitet och förekomst av specifika patogener18. Även om många av de långpostulerade teorier om rollen som chitinases inte har experimentellt bevisat19, nya studier har gett viktiga insikter i rollen som chitinases och Chitinase som proteiner i olika sjukdomar2, 9,20.
Det protokoll som beskrivs här är ett enkelt, snabbt och effektivt sätt att mäta Chitinase aktivitet i biologiska prover. Liten eller ingen modifiering krävs för att mäta Chitinase aktivitet i en mängd olika biologiska prover och arter på grund av den mycket bevarade karaktären av chitinases. Som förtecknas i detta protokoll är två substrat, varav en har utsetts för musprover och en för Human prov. båda substrat kan dock användas på båda arterna, eftersom de har utsetts som sådana baserat på tidigare Papers demonstration av effektiviteten med vilken enzymerna kan klyva underlaget.
Jämfört med tidigare befintliga tekniker, såsom Schales förfarande och DNS-metoden, analysen beskrivs här tar bort behovet av tids intensiva steg som kokning eller uppvärmning som var nödvändiga i äldre metoder. Dessutom är analysen mindre tekniskt svår och kräver färre komplicerade steg än föregående mättekniker. För bästa resultat bör både biologiska och tekniska replikat användas.
Om Chitinase aktiviteten är för hög, spädningar av det biologiska provet är tillräckliga för att minska Chitinase aktivitet för mätning, och de sanna värdena kan beräknas baserat på utspädning. När du utför detta experiment på nya biologiska prover, kan det vara bra att utföra upprepade mätningar på samma platta över tiden tills mättnad för att säkerställa en ordentlig inkubationstid för bästa resultat. Protokollet kan dessutom skalas upp eller ned så länge konsekvensen mellan grupperna kvarstår. De framtida tillämpningarna av detta protokoll är långtgående eftersom forskning bara är att plocka upp i rollen som Chitinase aktivitet i ett antal sjukdomar.
En av de första kategorierna av sjukdomar som Chitinase aktivitet befanns vara relevant i var lysosomala lagring sjukdomar inklusive Gauchers sjukdom, Niemann-Pick A/B och C, GM-1 gangliosidos, och många andra21. Gauchers sjukdom är en lysosomala lagring sjukdom orsakad av otillräcklig aktivitet av glukocerebrosidas och kännetecknas av uppbyggnaden av glukosylceramid, substratet av glukocerebrosidas, i lysosomen av makrofager15. Det är en genetisk sjukdom, med kliniska symtom som inkluderar mjälte och leverförstoring, lågt antal blodplättar, anemi, trötthet, och problem med skelettet22. Klinisk forskning har visat att en majoritet av personer som lider av Gauchers sjukdom har en median Chitinase aktivitet som är över 600 gånger medianvärdet av den normala kontrollen frivilliga; Dessutom, när personer med Gauchers sjukdom sattes på enzym tillskott terapi-den nuvarande behandlingen för sjukdomen-deras Chitinase aktivitetsnivåer sjönk betydligt utlåning Chitinase aktivitet vara en utmärkt markör för både sjukdom progression och behandlings övervakning15. Ingen roll har ännu hittats för Chit1 i sjukdomen dock. Liknande forskning har lett till Chit1 aktivitetsövervakning för många andra lysosomala lagrings sjukdomar10.
Dessutom, ytterligare forskning har indikerat en potentiell roll för Chit1 aktivitet under olika patogener infektion inklusive svampinfektion, malaria, tuberkulos och K. pneumoniae för att nämna några2,3,10 . En 2012 studie fann att Chitinase aktivitet var förhöjd hos patienter med aktiv tuberkulos (TB) infektion även när sputum smeta var negativt, vilket tyder på att Chitinase aktivitet kan användas som en effektiv biomarkör i TB-diagnos, särskilt under lång väntetid som ofta är nödvändig för att exakt diagnostisera sjukdomen23. Liknande fynd sågs under Plasmodium falciparum infektion, med chitotriosidas serumnivåer ökade signifikant hos dem med akut infektion24. Medan många av dessa sjukdomar tar dagar att diagnostisera, snabba mätningar av Chitinase aktivitetsnivåer i blodet kan ge positiva insikter i diagnosen. Dessutom, som malariaparasiter och tuberkulos bakterien blir alltmer resistenta mot behandlingar, mäta Chitinase aktivitetsnivåer i serum kan hjälpa till med behandling övervakning för dess effektivitet i realtid.
Mer och mer forskning har börjat fokusera på rollen av Chitinase och Chitinase-liknande proteiner i immunförsvaret, särskilt dess roll i inflammatoriska vägar. Eftersom denna forskning fortsätter, detta protokoll kommer att möjliggöra snabb och noggrann mätning av denna Chitinase verksamhet för att ytterligare forskning. Protokollet är lätt justerat för ett antal artprover, inklusive både mus och människa, vilket gör det allmänt tillämpligt.
Förutom forsknings nyttan, bättre metoder för att upptäcka och mäta Chitinase aktivitet i prover kommer att vara fördelaktigt i den kliniska sfären. Ny forskning har visat rollen som Chitinase som en biomarkör i patologi många kroniska sjukdomar inklusive Gauchers sjukdom, diabetes mellitus, sarkoidos, åderförkalkning, inflammatorisk tarmsjukdom och cancer3, 21,25,26.
På grund av denna roll som en biomarkör, snabb och noggrann mätning av Chitinase aktivitet som visas här är oerhört relevant för området för medicin, så vårdgivare att ha mer information för en ordentlig diagnos och behandlingsplan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av American lung Association och American Thoracic Society Awards till LS. Författarna vill uppriktigt tacka Dr Jack Elias och Dr Chun Geun Lee för att ge transgena mus stammar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
References
- Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).
- Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).
- Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/ 1-9 (2012).
- Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
- Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).
- Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).
- Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
- Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).
- Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).
- Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
- Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).
- Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623 78 (1945).
- Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).
- Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).
- Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).
- Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).
- Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
- Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).
- Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).
- Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).
- Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).
- Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).
- Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
- Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).
- Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).
- Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
