Summary
Présenté ici est une méthode simple pour mesurer l'activité chitinase dans les fluides biologiques tels que le lavage bronchoalvéolaire ou le sérum.
Abstract
Les chitinases sont les enzymes qui cisaillent la chitine. Même en l'absence de chitine, les mammifères ont des quantités significatives de chitinases présentes dans le corps, y compris à la ligne de base. Le rôle précis de la chitinase n'est pas connu, mais on croyait qu'il jouait un rôle important dans la digestion et la défense de l'hôte contre les aliments contenant de la chitine et les agents pathogènes, respectivement. Des travaux récents, y compris le nôtre, ont montré un rôle important de protéines chitinase et chitinase-like dans l'immunité de l'hôte et les maladies allergiques. Fait important, les activités de chitinase servent de biomarqueurs importants de la gravité de la maladie dans un large éventail de maladies, y compris les maladies inflammatoires de type 2 comme l'asthme et la fibrose pulmonaire. De même, les patients atteints de troubles génétiques comme la maladie de Gaucher ont des niveaux de chitinase significativement élevés, qui non seulement sont en corrélation avec la gravité de la maladie, mais servent également de biomarqueur fiable pour l'efficacité thérapeutique. Le protocole décrit ici une façon simple, rapide et directe de mesurer l'activité chitinase dans les échantillons de bal ou de sérum de souris et peut être largement adapté aux sujets humains et à d'autres organismes modèles en raison de la nature hautement conservée des enzymes.
Introduction
La chitinestine est le deuxième polysaccharide le plus abondant sur la terre après la cellulose, servant de composant structurel majeur d'une variété d'organismes, y compris l'exosquelette des insectes, des champignons, des levures et des algues; certains vertébrés ont également chitin1. Chitinases sont une famille d'enzymes qui sont capables de décomposer la chitine et sont très conservés tout au long de l'évolution des espèces allant des bactéries aux mammifères2,3. En plus des chitinases, les mammifères ont également des protéines chitinase-comme qui sont semblables aux chitinases dans leur capacité à lier la chitine mais diffèrent en ce qu'ils manquent de capacité enzymatique de cencouper la chitine4.
Bien que la chitine et les chitinases aient été étudiées depuis longtemps, avec des études remontant au début des années 1900, l'accent a été mis sur leur rôle dans les insectes et autres invertébrés. En fait, ce n'est que dans les années 1960 que l'on a découvert que les vertébrés avaient des chitinases. À l'aide d'un étosay à base de chitobiase, il a été démontré que des chitinases se trouvaient dans le tube digestif d'un certain nombre de vertébrés, y compris des lézards et des merles, une observation qui est présumée être due à la consommation d'organismes contenant de la chitine comme les insectes5. .
Les mammifères ont deux formes enzymatiquement actives de chitinase : la chitinase acide de mammifères (AMCase ; égalementconnue sous le nom chIT2 et CHIA) et la chitotriosidase (CHIT1) 4. Ces deux protéines sont capables d'hydrolyser la chitin. Cependant, CHIT1 est plus enzymatiquement actif chez l'homme, où presque toute l'activité chitinase est dérivée de CHIT1. 4 Chez la souris, Chit1 et AMCase contribuent presque également à l'activité chitinase globale6. D'autre part, les protéines chitinase-comme manquent d'activité chitinase.
Chit1 est principalement sécrété par les macrophages et est souvent considérécomme une réponse immunitaire aux agents pathogènes contenant de la chitin7 . L'enzyme a également été montré pour être impliqué dans la maturation des monocytes dans les deux sous-types de macrophage M1 et M2, même sans la présence du substrat chitin8. En outre, il peut également être impliqué dans la maturation d'autres cellules immunitaires, y compris les cellules de type 2 (Th2) d'aide T et les éosinophiles, comme cela s'est avéré être le cas dans l'infection pulmonaire cryptococcique9. Ces études indiquent un rôle complexe des chitinases dans le système immunitaire.
Ces dernières années, les niveaux de Chit1 ont été trouvés pour servir de biomarqueur important de la progression pour plus de 40 maladies humaines différentes, y compris les maladies de stockage lysosomal, les maladies infectieuses, les maladies respiratoires, les maladies endocriologiques, maladies neurologiques, et d'autres (révisé10). Dans beaucoup de ces maladies, les niveaux de Chit1 sont un prédicteur fort de la sévérité de la maladie et de l'efficacité thérapeutique10.
Comme les chitinases ont acquis une réputation de biomarqueur pour de nombreuses conditions médicales, y compris la maladie de Gaucher, des outils et des essais ont été développés pour faciliter les tests de présence de chitinase. Les méthodes plus anciennes incluent la procédure de Schales, un protocole adapté d'un essai de glucose sanguin, et la méthode de 3,5 acide dinitrosalicolilique (DNS). Cependant, ces méthodes sont souvent sensibles au temps et techniquement difficiles11. La procédure pour ces deux tests nécessite la réduction des oxydants inorganiques, ferricyanide dans le cas de la procédure des Schales par exemple, produisant un changement de couleur qui ne peut être mesuré spectrophotométriquement. En outre, les deux tests impliquent une étape de chauffage ou d'ébullition qui est à la fois long et nécessaire pour la couleur de se développer12,13.
Décrit ici est un test fluorémétrique rapide et simple pour déterminer les niveaux de chitinase dans les échantillons de mammifères14,15. Deux des échantillons utilisés ici comprennent le sérum et les liquides de lavage bronchoalvéolaire (BAL); l'activité de chitinase a également été mesurée dans le lait maternel et les échantillons d'urine, et la technique peut être exécutée dans ce type d'échantillons aussi bien que dans n'importe quel autre fluide biologique16,17.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont été exécutées selon un protocole approuvé par l'IACUC à l'école de médecine de l'Université Yale.
1. Collection d'échantillons de souris
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Anesthésie
- Anesthésiez les souris à l'aide de kétamine et de xylazine (100 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine).
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Collecte d'échantillons de sang
- Confirmer la profondeur de l'anesthésie par la non-réactivité à une pincée d'orteil.
- Ouvrez chirurgicalement la cavité thoracique pour exposer le cœur.
- Insérez une aiguille de 26,5 G dans le ventricule gauche et collectez le sang dans une seringue.
REMARQUE: Typiquement, environ 0,5 à 1 ml de sang peut être récolté à partir d'une souris saine de 20 à 25 g. - Recueillir le sang dans des tubes héparinisés, pour la collecte de plasma, ou des tubes non héparinisés pour la collecte de sérum.
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Collection de liquide de lavage bronchoalveolar (BAL)
- Pour recueillir le BAL, faire une coupe verticale sur le cou pour exposer la trachée.
- Cannuer la trachée à l'aide d'un cathéter de 22 G et la fixer fermement à l'aide d'une ficelle afin d'éviter les fuites du nez de la souris.
- Injectez lentement deux aliquots de saline stérile tamponnée par phosphate (PBS, 0,75 ml chacun) dans les poumons par la trachée et récupérez-la.
- Mettre en commun les aliquots et rester sur la glace pour une analyse plus approfondie.
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Traitement des échantillons biologiques.
- Échantillon de sang : frais (plasma) ou après avoir permis la coagulation pendant 4 h (sérum), centrifugeuse à 600 x g pendant 10 min. Prenez le supernatant et congelez-le pour le stockage ou utilisez-le pour l'expérience.
- BAL: Centrifuger l'échantillon à 350 x g pendant 5 min. Prenez le supernatant et congelez-le pour le stockage ou utilisez-le pour l'expérience.
2. Assay chitinase
REMARQUE: La science derrière l'exemple est relativement simple. Un substrat non fluorescent est clivé par la chitinase enzymatiquement active pour produire un produit fluorescent, qui est alors mesuré comme marqueur indirect de l'activité chitinase. Les chitinases dans les échantillons décomposent le substrat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose présent dans le tampon 1x McIlvain. Une molécule fluorescente 4-methylumbelliferyl est libérée. En mesurant la fluorescence totale de chaque puits, nous obtenons une mesure précise de la chitinase active dans chaque échantillon. Parce que la dégradation de la chitine par chitinase est une réaction hydrolytique, le tampon d'arrêt, un mélange de 0,3 M de glycine et de NaOH (12,0 g/L au pH 10,6), met fin à la dégradation de la chitine en créant un environnement trop basique pour que l'enzyme fonctionne.
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Préparer les substrats, les normes et les solutions.
- Préparer le tampon McIlvain. Le tampon McIlvain est composé de 0,1 M de citrate et de 0,2 M de phosphate à un pH de 5,2. Diluer à un rapport de 1:1 pour 1x tampon McIlvain.
- Dissoudre à la fois 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose et 4-methylumbelliferyl -D-N, N', N"-triacetylchitotriose en 1x McIlvain Buffer à une concentration de 500 M chacun.
REMARQUE: La solution de stock peut être stockée à -20 oC pour d'autres utilisations ; mieux stocké sain d'aliquots. - Dissoudre la norme, 4-méthylumbelliferone, à une concentration de 0,1 mM dans le tampon d'arrêt (mélange de 0,3 M de glycine et de NaOH (12,0 g/L au pH 10,6)) pour créer la solution standard de stock courbe.
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Créez et plaquez la solution de travail.
- Combinez 1x McIlvain Buffer et le substrat de chitin 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose pour créer la solution de travail. Pour chaque 10 échantillons, mélanger 100 l de substrat avec 2,17 ml de tampon McIlvain de 1 x 1x. Voir tableau 1 pour des calculs supplémentaires basés sur la taille de l'échantillon.
REMARQUE: Utilisez 4-methylumbelliferyl MD-D-N, N', N"-triacetylchitotriose pour les échantillons humains. Bien que les deux substrats peuvent être clivés par des enzymes humaines ou de souris, ils ont été attribués pour des échantillons humains ou de souris en fonction de l'efficacité du clivage6. - Pipette 95 l de solution de travail dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.
- Combinez 1x McIlvain Buffer et le substrat de chitin 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose pour créer la solution de travail. Pour chaque 10 échantillons, mélanger 100 l de substrat avec 2,17 ml de tampon McIlvain de 1 x 1x. Voir tableau 1 pour des calculs supplémentaires basés sur la taille de l'échantillon.
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Ajouter des échantillons de biospécimens à la solution de travail.
- Ensuite, ajoutez 5 ll de l'échantillon d'essai (sang/BAL/lysate tissulaire/autre liquide biologique) à chaque puits.
- Mélangez l'échantillon dans la solution de travail pour obtenir les résultats les plus précis et les plus fiables.
REMARQUE: Les échantillons doivent être exécutés en doublons/triplicates avec une attention particulière accordée aux effets de bord potentiels. Tous les échantillons doivent être réchauffés à l'avance afin de minimiser l'effet de bord. Comme l'analyse implique une réaction entre les chitinases dans l'échantillon et le substrat dans la solution de travail, il est préférable de travailler relativement rapidement pour minimiser la différence de temps entre le moment où le premier échantillon est plaqué et le dernier échantillon est plaqué. Pipette multicanal est recommandée.
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Incuber à 37 oC.
- Couvrir la plaque et secouer brièvement (5 s).
- Incuber la plaque à 37 oC pendant 15 min. Cela permet à la réaction enzymatique d'avoir lieu.
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Préparer la courbe standard.
- Pendant que les échantillons couvent, préparez une dilution en série de 4-méthylumbelliferone, une norme souvent utilisée dans la détermination fluormétrique de l'activité enzymatique.
- Diluer le stock de la solution standard dans le tampon d'arrêt à une concentration de 5 M.
- Effectuer une série de dilutions comme indiqué dans le tableau 2. Ajouter les composants dans la quantité indiquée et bien mélanger.
REMARQUE: La courbe standard permet de s'assurer que les échantillons mesurés tombent dans la plage linéaire de la courbe standard.
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Arrêtez la réaction avec le tampon d'arrêt.
- Ajouter 200 l de tampon d'arrêt à chaque puits pour arrêter la réaction.
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Plaquer les normes.
- Ajouter 300 L de chaque norme par puits en doublons sur la même plaque.
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Lisez la plaque à l'aide d'un lecteur fluorométrique.
- Lire la plaque à une excitation de 360 nm, et une émission de 455 nm.
3. Analyse des données
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Soustrayez les blancs
- Moyenne des valeurs des dilutions standard en double qui n'ont pas de 4-méthylumbelliferone. Soustrayez cette valeur de toutes les autres valeurs enregistrées.
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Prenez la moyenne des répliques techniques et tracez les normes.
- Moyenne des deux lectures pour chaque concentration et graphique de la lecture moyenne par concentration.
REMARQUE: L'intrigue résultante doit sembler linéaire et avoir une valeur R2 proche de 1. Si ce n'est pas le cas, il peut être nécessaire de refaire les normes et de relire la plaque pour assurer la qualité de l'analyse des données.
- Moyenne des deux lectures pour chaque concentration et graphique de la lecture moyenne par concentration.
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Normaliser les valeurs de lecture.
- Créez une ligne de choix pour les données de normes tracées. Divisez les suites des échantillons par la pente de la ligne la mieux adaptée.
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Comparez les valeurs du groupe témoin et du groupe variable.
- Utilisez un test t ou ANOVA, pour plus de deux groupes, pour déterminer si la différence entre les groupes est statistiquement significative. Les valeurs prendront les unités nmol/mL-h.
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Representative Results
Les résultats présentés ici proviennent d'une étude mesurant l'activité chitinase dans des échantillons de sérum et de BAL de type sauvage (C57BL/6) et de souris transgéniques Chit1 (sur le fond C57BL/6) qui surexpriment le gène Chit1 sur un promoteur de doxycycline. Nos données montrent que les échantillons de sérum et de BAL ont une activité de chitinase détectable à la ligne de base 698,2 - 189,9 nmol/mL-h et 485,7 - 114 nmol/mlâh, respectivement. La surexpression du gène Chit1 à l'aide de la doxycycline dans l'eau potable pendant 4 semaines a entraîné l'élévation de l'activité chitinase qui a été observée à la fois dans bal (4 575 - 673,8 nmol/mLh, p - 0,003) et le sérum 1556 - 251,2 nmol/mL-h, p - 0,0272, par rapport à la ligne de base ) échantillons.
En utilisant le protocole décrit ici, l'analyse confirme que la surexpression du gène Chit1 chez les souris entraîne une activité chitinase accrue. Un test t a été utilisé pour comparer les moyens des deux groupes. Chaque groupe contenait 5 souris.
Figure 1 : Activité chitinase. L'activité chitinase a été mesurée dans le (A) sérum et leliquidede lavage bronchoalvéolaire (WT) et la chitotriosidase (ChitTg) surexprimant sur exprimant. Chaque point représente un échantillon de souris individuel. (C) Les valeurs ont été normalisées en utilisant la linéarité de la courbe standard décrite dans le protocole. Les niveaux de fluorescence ont été mesurés à l'aide d'un lecteur de plaque à une longueur d'onde de 360 nm pour l'excitation et de 455 nm pour l'émission et présentés comme AU. Au ' unité arbitraire 'p 'lt; 0.05, 'p 'lt; 0.001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Nombre de puits d'échantillons | Substrat (L) | Tampon McIlvain (mL) |
| 20 | 100 | 2.17 |
| 50 | 250 | 5.425 |
| 100 | 500 | 10.85 |
Tableau 1 : Exemples de calculs pour la création de la solution de travail.
| L) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Conc. (nM) | 0 | 125 | 250 | 375 | 500 | 625 | 750 | 875 |
| standard | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | 120 | 140 |
| 2x McIlvian | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| Distillé H2O | 200 | 180 | 160 | 140 | 120 | 100 | 80 | 60 |
| Arrêter buffer | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 |
Tableau 2 : Dilutions pour les mesures de courbe standard.
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Discussion
L'activité chitinase est apparue comme un biomarqueur important pour prédire la gravité de la maladie, la progression de la maladie, l'efficacité thérapeutique et la présence d'agents pathogènes spécifiques18. Bien que beaucoup de théories longtemps postulées sur le rôle des chitinases n'ont pas été expérimentalementprouvé19, de nouvelles études ont fourni des idées importantes sur le rôle des chitinases et chitinase comme les protéines dans diverses maladies2, 9,20.
Le protocole décrit ici est un moyen simple, rapide et efficace de mesurer l'activité chitinase dans les échantillons biologiques. Peu ou pas de modification est nécessaire pour mesurer l'activité chitinase dans une grande variété d'échantillons biologiques et d'espèces en raison de la nature hautement conservée des chitinases. Ce protocole contient deux substrats, dont l'un a été désigné pour les échantillons de souris et l'autre pour les échantillons humains; cependant, les deux substrats peuvent être utilisés sur l'une ou l'autre espèce, car ils ont été désignés comme tels sur la base de la démonstration des documents précédents de l'efficacité avec laquelle les enzymes peuvent couper le substrat.
Par rapport aux techniques existantes, telles que la procédure Schales et la méthode DNS, l'analyse décrite ici élimine le besoin d'étapes chronofinsurles telles que l'ébullition ou le chauffage qui étaient nécessaires dans les méthodes plus anciennes. En outre, l'analyse est moins techniquement difficile et nécessite moins d'étapes compliquées que les techniques de mesure précédentes. Pour de meilleurs résultats, des répliques biologiques et techniques doivent être utilisées.
Si l'activité chitinase est trop élevée, les dilutions de l'échantillon biologique sont suffisantes pour réduire l'activité chitinase pour la mesure, et les vraies valeurs peuvent être calculées en fonction de la dilution. Lors de l'exécution de cette expérience sur de nouveaux échantillons biologiques, il peut être utile d'effectuer des mesures répétées sur la même plaque au fil du temps jusqu'à la saturation pour assurer un temps d'incubation approprié pour de meilleurs résultats. En outre, le protocole peut être mis à l'échelle vers le haut ou vers le bas tant que la cohérence entre les groupes reste. Les applications futures de ce protocole sont d'une grande portée, car la recherche ne fait que reprendre le rôle de l'activité chitinase dans un certain nombre de maladies.
L'une des premières catégories de maladies que l'activité chitinase s'est avérée pertinente dans était les maladies de stockage lysosomal, y compris la maladie de Gaucher, Niemann-Pick A / B et C, GM-1 gangliosidose, et beaucoup d'autres21. La maladie de Gaucher est une maladie de stockage lysosomal causée par une activité insuffisante de glucocerebrosidase et se caractérise par l'accumulation de glucosylceramide, le substrat de glucocerebrosidase, dans le lysosome des macrophages15. Il s'agit d'une maladie génétique, avec des symptômes cliniques qui comprennent la rate et l'agrandissement du foie, faible numération plaquettaire, l'anémie, la fatigue, et les problèmes osseux22. La recherche clinique a démontré qu'une majorité de personnes souffrant de la maladie de Gaucher ont une activité chitinase médiane qui est plus de 600 fois la valeur médiane des volontaires normaux de contrôle ; en outre, quand les personnes avec la maladie de Gaucher ont été mises sur la thérapie de supplémentation enzymatique-le traitement courant pour la maladie-leurs niveaux d'activité chitinase ont chuté de manière significative prêtant l'activité chitinase pour être un excellent marqueur des deux maladies suivi de la progression et du traitement15. Aucun rôle n'a encore été trouvé pour Chit1 dans la maladie cependant. Des recherches similaires ont conduit à la surveillance de l'activité Chit1 pour de nombreuses autres maladies de stockage lysosomal10.
En outre, d'autres recherches ont indiqué un rôle potentiel pour l'activité Chit1 au cours de diverses infections pathogènes, y compris l'infection fongique, le paludisme, la tuberculose et K. pneumoniae pour n'en nommer que quelques-uns2,3,10 . Une étude de 2012 a révélé que l'activité chitinase était élevée chez les patients atteints d'infection tuberculeuse active (TB) même lorsque le frottis d'écrachats était négatif, ce qui indique que l'activité chitinase pourrait être utilisée comme biomarqueur efficace dans le diagnostic de la tuberculose, en particulier pendant le long temps d'attente qui est souvent nécessaire pour diagnostiquer avec précision la maladie23. Des résultats semblables ont été vus pendant l'infection de Falciparum de Plasmodium, avec des niveaux de sérum de chitotriosidase sensiblement augmentédans ceux avec l'infection aigue24. Tandis que beaucoup de ces maladies prennent des jours pour diagnostiquer, des mesures rapides des niveaux d'activité chitinase dans le sang peuvent fournir des perspicacités salutaires dans le diagnostic. En outre, comme les parasites du paludisme et la bactérie de la tuberculose deviennent de plus en plus résistants aux traitements, la mesure des niveaux d'activité chitinase dans le sérum peut aider à la surveillance du traitement de son efficacité en temps réel.
De plus en plus de recherches ont commencé à se concentrer sur le rôle des protéines chitinase et chitinase-like dans la réponse immunitaire, en particulier son rôle dans les voies inflammatoires. Au fur et à mesure que cette recherche se poursuit, ce protocole permettra de mesurer rapidement et avec précision cette activité chitinase pour poursuivre la recherche. Le protocole est facilement ajusté pour un certain nombre d'échantillons d'espèces, y compris la souris et l'homme, ce qui le rend largement applicable.
En plus de l'avantage de recherche, de meilleures méthodes pour détecter et mesurer l'activité de chitinase dans les échantillons seront salutaires dans le domaine clinique. Des recherches récentes ont démontré le rôle de la chitinase comme biomarqueur dans la pathologie de nombreuses maladies chroniques, y compris la maladie de Gaucher, le diabète sucré, la sarcoïdose, l'athérosclérose, les maladies inflammatoires de l'intestin et les cancers3, 21,25,26.
En raison de ce rôle en tant que biomarqueur, la mesure rapide et précise de l'activité chitinase comme indiqué ici est incroyablement pertinente pour le domaine de la médecine, permettant aux fournisseurs de soins de santé d'avoir plus d'informations pour un diagnostic et un plan de traitement appropriés.
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Disclosures
aucun.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par l'American Lung Association et l'American Thoracic Society Awards à LS. Les auteurs veulent sincèrement remercier le Dr Jack Elias et le Dr Chun Geun Lee d'avoir fourni des souches de souris transgéniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
References
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