Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

מדידת פעילות השינואז בדגימות ביולוגיות

doi: 10.3791/60159 Published: August 22, 2019
* These authors contributed equally

Summary

מוצג כאן היא שיטה פשוטה למדוד פעילות chitinase בנוזלים ביולוגיים כגון שאיפה ברונבשיים או סרום.

Abstract

השינוסים הם האנזימים. שקליב כיגין גם בהיעדר כלאין, ממאנים יש כמויות משמעותיות של השטיות הקיימות בגוף, כולל בבסיס. התפקיד המדויק של chitinase אינו ידוע, אולם זה היה האמין לשחק תפקיד חשוב בעיכול והגנה מארחים נגד המזון המכיל מזון פתוגנים, בהתאמה. העבודה האחרונה, כולל שלנו, הראה תפקיד חשוב של מחלת המין הצ והחלבונים בחסינות המארחת ומחלות אלרגיות. חשוב מכך, פעילויות chitinase לשמש בסמנים חשובים של חומרת המחלה במגוון רחב של מחלות כולל סוג 2 מחלות דלקתיות כגון אסטמה פיברוזיס ריאתי. באופן דומה, חולים עם הפרעות גנטיות כמו מחלת Gaucher יש משמעותית רמות chitinase גבוהות, אשר לא רק לתאם עם חומרת המחלה אלא גם לשמש בסמנים אמין עבור יעילות טיפולית. הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את הדרך פשוטה, מהירה, וישירה כדי למדוד פעילות chitinase בדגימות בל או סרום של עכברים והוא יכול להיות מותאם באופן נרחב לנושאים בני אדם ואורגניזמים מודל אחרים בשל הטבע שימור מאוד של אנזימים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כיאין הוא הרב ביותר הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ לאחר תאית, המשמש כמרכיב המבני העיקרי של מגוון של אורגניזמים כולל שלד חיצוני של חרקים, פטריות, שמרים, אצות; בעלי חוליות מסוימים כוללים גם את הצ1. השינוסים הם משפחה של אנזימים המסוגלים לשבור את הצ ונשמרים מאוד במהלך האבולוציה במינים הנעים מחיידקים ליונקים2,3. בנוסף על כוונון, יונקים יש גם chitinases כמו חלבונים אשר דומים chitinases ביכולתם לאגד כיטין אבל שונים כי הם חסרי יכולת אנזימטית לקליב את הצ'יטוס4.

למרות שצ וכיטיות כבר נחקרו מזמן-בחקירות שראשיתה בתחילת 1900-המוקד העיקרי היה בתפקידם בחרקים ובחסרי חוליות אחרים. למעשה, זה לא היה עד שנות ה-60 כאשר נמצאו בעלי חוליות בכלל. באמצעות שימוש בשיטה המבוססת על צ'יטיואז, הוצגו השינוסים שנמצאו במערכת העיכול של מספר בעלי חוליות, כולל לטאות ועופות שחורות – תצפית המשוערות להיות בשל צריכת האורגניזמים המכילים כגון חרקים5 .

ליונקים יש שני צורות אנזימליות הפעילות של chitinase: מיונקים חומציים (AMCase; הידוע גם בשם CHIT2 ו-CHIA) ו chitotriosidase (CHIT1)4. שני החלבונים הללו מסוגלים. לעשות הידרוליזינג כיגין עם זאת, CHIT1 הוא הפעיל אנזימטי יותר בבני אדם, שם כמעט כל פעילות chitinase נגזרת מ CHIT1. 4 בעכברים, הן Chit1 ו-amcase כמעט באופן שווה לתרום פעילות chitinase הכולל6. מצד שני, חלבונים כמו...

Chit1 מופרש בעיקר על ידי מקרופאגים והוא נחשב לעתים קרובות להיות תגובה חיסונית כאשר המכיל פתוגנים המכילים7. האנזים הוכח גם להיות מעורב בהבשלה של מונוציטים לשני M1 ו M2 מקרופאג תת, גם ללא נוכחות של המצע כיטין8. יתר על כן, זה עשוי להיות גם מעורב בהבשלה של תאים חיסוניים אחרים כולל T מסייע סוג 2 (Th2) תאים ו אאוזינופילים-כפי שהוצג להיות במקרה של זיהום ריאות cryptococcal9. מחקרים אלה מצביעים על תפקיד מורכב של כביסים במערכת החיסונית.

בשנים האחרונות, Chit1 רמות נמצאו לשמש ביוארקר חשוב של התקדמות עבור מעל 40 מחלות אנושיות שונות, כולל מחלות אחסון lysoזומלית, מחלות זיהומיות, מחלות נשימה, מחלות endocrinological, וכלי דם מחלות, מחלות נוירולוגיות ואחרות (נבדקו10). ברבים ממחלות אלה, רמות של Chit1 הם מנבא חזק של חומרת המחלה ואת האפקטיביות הטיפולית10.

כמו chitinases השיגו מוניטין כמו בסמנים עבור מצבים רפואיים רבים כולל מחלת gaucher, כלים בחני פותחו כדי להקל על בדיקות של נוכחות chitinases. שיטות מבוגרות יותר כוללות הליך של Schales, פרוטוקול המותאם מבדיקת הגלוקוז בדם, ואת 3, 5 dinitרוזלין חומצה (DNS) שיטה. עם זאת, שיטות אלה הן לעתים קרובות רגישות הזמן ומבחינה טכנית קשה11. ההליך עבור שני בדיקות אלה דורש הפחתת חמצון אורגניים, ferricyanide במקרה של ההליך של Schales למשל, הפקת שינוי צבע כי ניתן רק למדוד spectrophotometrically. בנוסף, שתי הבדיקות כרוכות בחימום או בצעד רותח שהוא זמן רב והכרחי לצבע לפתח12,13.

המתואר כאן הוא שיטה מהירה ופשוטה פלוורימטרית כדי לקבוע רמות של צ'יטאנאז בדגימות של ממיונקים14,15. שניים מהדגימות המשמשות כאן כוללות ששטיפה סרום וברונשיים (BAL); פעילות chitinase נמדדה גם בדגימות חלב ושתן, וניתן לבצע את הטכניקה בסוג זה של דגימות כמו גם בכל נוזל ביולוגי אחר16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הליכי בעלי החיים בוצעו תחת פרוטוקול מאושר IACUC בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל.

1. אוסף דוגמאות עכבר

  1. הרדמה
    1. עכברים מורדם באמצעות קטמין ו xylazine (100 מ"ג/ק ג של קטמין ו 10 מ"ג/ק"ג של xylazine).
  2. אוסף דגימות דם
    1. לאשר את עומק ההרדמה על ידי אי היענות לצביטה בבוהן.
    2. לפתוח בניתוח את חלל החזה. כדי לחשוף את הלב
    3. הכנס מחט 26.5 G לתוך החדר השמאלי ולאסוף דם לתוך מזרק.
      הערה: בדרך כלל, כ 0.5 – 1 מ ל של דם ניתן לקצור מן בריא 20-25 g העכבר.
    4. לאסוף את הדם בצינורות heparinized, עבור אוסף פלזמה, או צינורות שאינם heparinized עבור אוסף הנסיוב.
  3. אוסף של נוזל ברונמכתשי (בל)
    1. כדי לאסוף את בל, לעשות חתך אנכי על הצוואר כדי לחשוף את קנה הנשימה.
    2. צינורית קנה הנשימה עם קטטר G 22 ולאבטח אותו בחוזקה באמצעות מחרוזת כדי למנוע דליפה מתוך האף של העכבר.
    3. באיטיות להזריק שתי מנות של מלוחים סטרילית מחסני פוספט (PBS, 0.75 mL כל אחד) לתוך הריאות דרך קנה הנשימה ולאחזר חזרה.
    4. מאגר המים ולשמור על קרח לניתוח נוסף.
  4. . מעבד את הדגימות הביולוגי
    1. דגימת דם: טרי (פלזמה) או לאחר התרת קרישה עבור 4 שעות (סרום), צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות. קח את הסופרנאאנט והקפא לצורך אחסון או שימוש לצורך ניסוי.
    2. BAL: צנטריפוגה את המדגם ב 350 x g עבור 5 דקות. קח את הסופרנאאנט והקפא לצורך אחסון או שימוש לצורך ניסוי.

2. שיטת השינואז

הערה: המדע העומד מאחורי המנה הוא פשוט יחסית. מצע לא פלורסנט הוא ביקע על ידי chitinase הפעיל אנזימטי כדי לייצר מוצר פלורסנט, אשר נמדד אז כסמן עקיף של פעילות chitinase. השינוסים בתוך הדגימות לשבור את המצע 4-מתיונין-D-N, N'-diacetylchitobiose הנוכחי במאגר 1x McIlvain. מולקולת פלורסנט 4-מתיונין לומוליפראיל משתחררת. על ידי מדידת הקרינה הכוללת של כל באר, אנו משיגים מדידה מדויקת של השיאינטאז הפעיל בכל דוגמה. בגלל התמוטטות של כיצין ידי chitinase היא תגובה הידרוטית, מאגר לעצור, תערובת של 0.3 M גליצין ו NaOH (12.0 g/L ב-pH 10.6), מסיים את התמוטטות של כיסין על ידי יצירת סביבה כי הוא בסיסי מדי עבור האנזים לתפקד.

  1. הכן את הסובסטרטים, התקנים והפתרונות.
    1. . הכן מאגר מק מאגר McIlvain מורכב 0.1 M ציטראט ו 0.2 M פוספט ב-pH של 5.2. דלל את היחס של 1:1 עבור מאגר 1x McIlvain.
    2. מתמוסס הן 4-מתושלח-D-N, N'-diacetylchitobiose ו-4-מתיונין לומפרקסיל-D-N, N ', N '-triacetylchitotriose ב 1x מק מאגר לריכוז של 500 μM כל אחד.
      הערה: ניתן לאחסן פתרון מניות ב-20 ° צ' לשימושים נוספים; השמורים ביותר באליבטים.
    3. התמוססות תקן, 4-מתיונין, לריכוז של 0.1 מ"מ במאגר לעצור (התערובת של 0.3 M גליצין ו NaOH (12.0 g/L ב-pH 10.6)) כדי ליצור את הפתרון הרגיל מניות עקומת.
  2. ליצור ולוחית את פתרון העבודה.
    1. לשלב 1 x מאגר McIlvain ו-המצע כיאין 4-מתיונין-D-N, N'-diacetylchitobiose כדי ליצור את פתרון העבודה. עבור כל 10 דגימות, לערבב 100 μL של מצע עם 2.17 mL של מאגר 1x McIlvain. ראה טבלה 1 לחישובים נוספים בהתבסס על גודל המדגם.
      הערה: השתמש 4-מתיונין לפרקסיל-D-N, N ', N-triacetylchitotriose עבור דגימות אנושיות. בעוד מצעים ניתן לעבור על ידי או אנזימים האדם או העכבר, הם הוקצו עבור כל אחד או דגימות העכבר המבוסס על יעילות של מחשוף6.
    2. פיפטה 95 μL של פתרון עבודה לכל טוב של צלחת 96-באר.
  3. הוסף דגימות ביודגימה לפתרון העבודה.
    1. לאחר מכן, להוסיף 5 μL של דגימת הבדיקה (דם/BAL/רקמת ליפוסט/נוזל ביולוגי אחר) לכל טוב.
    2. ערבב את המדגם לתוך פתרון העבודה עבור התוצאות המדויקות והאמינות ביותר.
      הערה: יש להפעיל דגימות בכפילויות/טריליטים עם תשומת לב מיוחדת ששולמה לאפקטי קצה פוטנציאליים. כל הדגימות צריך להיות מחומם מראש כדי למזער את אפקט הקצה. כפי שהדוגמא כרוכה בתגובה בין כינויים במדגם ובמצע בפתרון העבודה, עדיף לעבוד במהירות יחסית כדי למזער את ההפרש בזמן בין כאשר המדגם הראשון מצופה והמדגם האחרון מצופה. מומלץ לעשות שפיפטה רב-ערוצי.
  4. מודטה ב 37 ° c.
    1. לכסות את הצלחת ולנער בקצרה (5 s).
    2. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור 15 דקות. זה מאפשר את התגובה האנזימטית להתרחש.
  5. הכן את העקומה הסטנדרטית.
    1. בעוד הדגימות הן מודדיקות, להכין דילול סדרתי של 4-מתיונין, רגיל המשמש לעתים קרובות בקביעת פלוורימטרית של פעילות אנזימים.
    2. לדלל את המניה של הפתרון הרגיל במאגר לעצור לריכוז של 5 μM.
    3. ביצוע סידרה של דילול כפי שמצוין בטבלה 2. הוסף את הרכיבים בסכום שצוין וערבב היטב.
      הערה: העקומה הסטנדרטית מסייעת להבטיח שדגימות מדודות יפלו בטווח הליניארי של העקומה הסטנדרטית.
  6. הפסק את התגובה באמצעות מאגר העצירה.
    1. הוסף 200 μL של מאגר העצירה לכל באר כדי לעצור את התגובה.
  7. . הצלחת בסטנדרטים
    1. הוסף 300 μL של כל תקן באופן כפילויות על אותה צלחת.
  8. לקרוא את הצלחת באמצעות קורא פלואורומטרי.
    1. קרא את הצלחת בעירור של 360 ננומטר, ו פליטה של 455 ננומטר.

3. ניתוח נתונים

  1. הפחת את החסר
    1. ממוצע הערכים של מדלל התקן הכפול שאין להם 4 מתיונין. הפחת ערך זה מכל שאר הערכים שנרשמו.
  2. לקחת ממוצע של משכפל טכני ולהתוות את הסטנדרטים.
    1. ממוצע שני הקריאות לכל ריכוז וגרף הקריאה הממוצעת בריכוז.
      הערה: העלילה המתקבלת אמורה להיראות קווית ויש לה ערך R2 קרוב ל-1. אם לא, ייתכן שיהיה צורך לבצע שוב את הסטנדרטים ולקרוא שוב את הצלחת כדי להבטיח איכות של ניתוח נתונים.
  3. לתקנן את ערכי הקריאה.
    1. צור קו התאמה מיטבית עבור נתוני התקנים המותווים. חלק את הפרטים של הדגימות לפי השיפוע של קו ההתאמה הטובה ביותר.
  4. השוואת ערכים מקבוצת הבקרה ומקבוצת המשתנים.
    1. השתמש במבחן t או ב-ANOVA, עבור יותר משתי קבוצות, כדי לקבוע אם ההפרש בין קבוצות הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית. הערכים יקחו את היחידות nmol/mL · h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התוצאות המוצגות כאן הם ממחקר מדידת הפעילות chitinase בסרום ודגימות BAL של סוג פראי (C57BL/6) ו Chit1 העכברים הטרנסגניים (על C57BL/6 רקע) כי overexpress הגן Chit1 על מקדם דוקסיציקלין. הנתונים שלנו מראים כי שני הנסיוב וגם הדגימות בל יש לגילוי פעילות chitinase בתוכנית הבסיסית 698.2 ± 189.9 nmol/mL · h ו 485.7 ± 114 nmol/ml · h, בהתאמה. ביטוי יתר של הגן Chit1 באמצעות דוקסיציקלין במים לשתייה עבור 4 שבועות הביא העלאת הפעילות של chitinase כי נצפתה בשני באל (4,575 ± 673.8 nmol/mL · h, p = 0.003) ו סרום 1556 ± 251.2 nmol/mL · h, p = 0.0272, בהשוואה לקו הבסיס דגימות.

באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, הבקשה מאשרת כי ביטוי יתר של הגן Chit1 בעכברים התוצאות פעילות chitinase מוגברת. מבחן t שימש כדי להשוות את האמצעים של שתי הקבוצות. כל קבוצה הכילה 5 עכברים.

Figure 1
איור 1: פעילות השינואז. פעילות chitinase נמדדה (A) סרום ו (ב) ברונמכתשיים נוזל מסוג פראי (WT) ו chitotriosidase (chittg) המבטא העכברים הטרנסגניים. כל נקודה מייצגת דגימת עכבר בודדת. (ג) ערכים היו מתוקננת באמצעות היניאריות של העקומה הסטנדרטית כפי שמתואר בפרוטוקול. רמות הזריחה נמדדו באמצעות קורא צלחת באורך הגל של 360 ננומטר עבור עירור ו 455 nm לפליטה והציג כמו AU. AU = יחידה שרירותית * p < 0.05, * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מספר בארות לדוגמה מצע (μL) מאגר מק (mL)
20 100 2.17
50 250 5.425
100 500 10.85

טבלה 1: חישובים לדוגמה ליצירת פתרון העבודה.

(μL) 1 2 3 4 מיכל 5 6 7 8
קונק (אן אם) 0 125 250 375 500 625 750 875
רגיל 0 20 40 60 80 100 120 140
2x מקאילאן 200 200 200 200 200 200 200 200
מזוקק H2O 200 180 160 140 120 100 80 60
עצור מאגר 400 400 400 400 400 400 400 400

טבלה 2: מדלל עבור מדידות עקומות סטנדרטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפעילות chitinase התפתחה בתור בסמנים חשוב לניבוי חומרת המחלה, התקדמות המחלה, היעילות הטיפולית ואת הנוכחות של פתוגנים ספציפיים18. למרות שרבות מן התיאוריות הארוכות-היסוד בנוגע לתפקיד השינוסים לא הוכחו בניסויים בגיל19, מחקרים חדשים סיפקו תובנות חשובות לתפקיד השינוסים והצ'יטונים כמו חלבונים במחלות שונות2, 9,20.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא דרך פשוטה, מהירה ויעילה למדוד פעילות chitinase בדגימות ביולוגיות. מעט לא שינוי נדרש כדי למדוד את הפעילות chitinase במגוון רחב של דגימות ביולוגיות ומינים בשל הטבע שימור מאוד של השינוסים. בפרוטוקול זה מפורטים שני מצעים, שאחד מהם מיועד לדגימות עכבר ואחד לדגימות אנושיות; עם זאת, ניתן להשתמש בשתי הסובסטרזה על שני המינים, כפי שהם המיועדים כגון מבוסס על הדגמה המסמכים הקודמים של היעילות שבה אנזימים יכולים לבקע את המצע.

בהשוואה לטכניקות קיימות בעבר, כגון הליך ' שיאלס ' ושיטת DNS, הבקשה המתוארים כאן מסירה את הצורך בצעדים עתירי זמן כגון הרתחה או חימום שהיו נחוצים בשיטות ישנות יותר. בנוסף, הבחינה טכנית היא פחות קשה ודורשת צעדים מסובכים פחות מאשר טכניקות המדידה הקודמות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר יש להשתמש בשכפל ביולוגי וטכני.

אם הפעילות chitinase הוא גבוה מדי, מדלל של המדגם הביולוגי מספיקים כדי להפחית את הפעילות chitinase למדידה, ואת הערכים האמיתיים ניתן לחשב בהתבסס על הדילול. בעת ביצוע ניסוי זה על דגימות ביולוגיות חדשות, ייתכן שיהיה מועיל לבצע מדידות חוזרות על אותה צלחת לאורך זמן עד רוויה כדי להבטיח זמן דגירה מתאים לתוצאות הטובות ביותר. בנוסף, ניתן לשנות את הפרוטוקול למעלה או למטה כל עוד העקביות בין הקבוצות נותרת. היישומים העתידיים של פרוטוקול זה הם הרבה להגיע כמו מחקר הוא רק לאסוף בתפקיד של פעילות chitinase במספר מחלות.

אחת הקטגוריה הראשונה של מחלות כי פעילות chitinase נמצא להיות רלוונטי היה ליסוזוממחלות אחסון כולל מחלת גוכר, נימן-פיק/B ו-C, GM-1 gangliosisis, ועוד רבים אחרים21. מחלת gaucher היא מחלת אחסון ליזוזומבית הנגרמת על ידי פעילות מספקת של גלוקוצרשנסדאז והוא מאופיין על ידי הצטברות של msm גלוקוסימיד, המצע של גלוקוצרשסיידאז, ב אנזימים של מקרופאגים15. זוהי מחלה גנטית, עם תסמינים קליניים הכוללים הגדלת טחול והכבד, ספירת טסיות נמוכה, אנמיה, עייפות, ובעיות עצם22. מחקר קליני הוכיחה כי רוב האנשים הסובלים ממחלת Gaucher יש פעילות כביאז חציון כי הוא מעל 600 פעמים את הערך החציוני של מתנדבים בשליטה רגילה; בנוסף, כאשר אנשים עם מחלת Gaucher היו לשים על טיפול בתוספי אנזים — הטיפול הנוכחי עבור המחלה — רמות הפעילות שלהם chitinase ירד באופן משמעותי ההלוואות chitinase הפעילות להיות סמן מצוין של שתי המחלות התקדמות וניטור טיפול15. עדיין לא נמצא תפקיד עבור Chit1 במחלה אולם. מחקר דומה הוביל ניטור פעילות Chit1 עבור רבים אחרים מחלות אחסון lysoזומלית10.

בנוסף, מחקר נוסף הצביע על תפקיד פוטנציאלי לפעילות Chit1 במהלך הדלקת הפתוגן השונים, כולל זיהום פטרייתי, מלריה, שחפת ו -K. הדלקת ריאות כדי לנקוב במספר2,3,10 . מחקר 2012 נמצא כי הפעילות chitinase היה מוגבה בחולים עם שחפת פעיל (TB) זיהום גם כאשר הכתם רוק היה שלילי, המציין כי הפעילות chitinase יכול לשמש בסמנים יעילים באבחון TB, במיוחד במהלך ה זמן לחכות זמן רב כי לעתים קרובות יש צורך לאבחן במדויק את המחלה23. ממצאים דומים נראו במהלך זיהום פלסטלינה falciparum , עם רמות הסרום chitotriosise גדל באופן משמעותי באלה עם זיהום אקוטי24. בעוד רבים של מחלות אלה לוקח ימים כדי לאבחן, מדידות מהירה של רמות הפעילות של chitinase בדם יכול לספק תובנות מועילות באבחנה. בנוסף, כמו טפילים מלריה וחיידק שחפת להיות עמידים יותר ויותר לטיפולים, מדידת רמות הפעילות chitinase בסרום עשוי לסייע עם ניטור הטיפול עבור יעילותו בזמן אמת.

יותר ויותר מחקר החלה להתמקד בתפקיד של chitinase ו chitinase כמו חלבונים בתגובה החיסונית, במיוחד תפקידה במסלולים דלקתיים. כמו מחקר זה ממשיך, פרוטוקול זה יאפשר מדידה מהירה ומדויקת של פעילות זו chitinase למחקר נוסף. הפרוטוקול מותאם בקלות לכל מספר דוגמאות של מינים, כולל העכבר והאדם, מה שהופך אותו לרלוונטי באופן נרחב.

בנוסף לטובת המחקר, שיטות טובות יותר לזיהוי ומדידת פעילות chitinase בדגימות יהיה מועיל בתחום הקליני. מחקרים אחרונים הפגינו את התפקיד של chitinase כמו בסמנים בפתולוגיה של מחלות כרוניות רבות כולל מחלת Gaucher, סוכרת, סרקואידוזיס, טרשת עורקים, מחלות מעי דלקתיות סרטן3, 21,25,26.

בגלל תפקיד זה כמו סמנים, מדידה מהירה ומדויקת של פעילות chitinase כפי שמוצג כאן הוא רלוונטי מאוד לתחום הרפואה, המאפשר לספקי הבריאות יש מידע נוסף עבור אבחנה נכונה תוכנית טיפול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא.

Acknowledgments

מחקר זה היה נתמך על ידי האגודה האמריקנית לריאות ופרסים האגודה האמריקנית לתרבות החזה LS. מחברים בכנות רוצה להודות ד ר ג ' ק אליאס וד ר צ'ון Geun לי על מתן זנים העכבר הטרנסגניים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2 Sigma M9763 fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3 Sigma M5639 fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate for use in McIlvain Buffer
Glycine for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O for use in McIlvain Buffer
NaOH for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate 4titude 4ti-0224

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5, (1), 21-29 (2013).
  2. Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201, (2), 615-626 (2018).
  3. Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/ 1-9 (2012).
  4. Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
  5. Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192, (4798), 135-136 (1961).
  6. Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276, (9), 6770-6778 (2000).
  7. Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
  8. Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36, (2), 482-492 (2013).
  9. Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11, (3), e1004701 (2015).
  10. Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
  11. Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7, (37), 1-8 (2014).
  12. Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623 78 (1945).
  13. Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42, (297), 1017-1029 (2011).
  14. Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304, (5677), 1678-1682 (2004).
  15. Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93, (3), 1288-1292 (1994).
  16. Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43, (2), 198-201 (2005).
  17. Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
  18. Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138, (4), 1183-1189 (2016).
  19. Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10, (1), 69-78 (2008).
  20. Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (22), e2891-e2899 (2015).
  21. Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88, (1), 69-78 (2016).
  22. Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30, (1), 82-87 (2019).
  23. Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
  24. Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331, (1-2), 79-85 (2003).
  25. Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183, (1), 313-325 (2013).
  26. Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
מדידת פעילות השינואז בדגימות ביולוגיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).More

Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter