Imaging nanoscopico delle sezioni dei tessuti umani attraverso l'espansione fisica e isotropica
Summary
L’imaging su nanoscala di campioni di tessuto clinico può migliorare la comprensione della patogenesi della malattia. La patologia di espansione (ExPath) è una versione di microscopia di espansione (ExM), modificata per la compatibilità con campioni di tessuto clinico standard, per esplorare la configurazione su nanoscala delle biomolecole utilizzando microscopi tradizionali a diffrazione limitata.
Abstract
Nella moderna patologia, la microscopia ottica svolge un ruolo importante nella diagnosi della malattia rivelando strutture microscopiche di campioni clinici. Tuttavia, il limite fondamentale di diffrazione fisica impedisce l’interrogatorio dell’anatomia su nanoscala e dei sottili cambiamenti patologici quando si utilizzano approcci di imaging ottico convenzionali. Qui, descriviamo un protocollo semplice ed economico, chiamato patologia di espansione (ExPath), per l’imaging ottico su nanoscala di tipi comuni di campioni di tessuto primario clinico, inclusi sia tessuto incorporato di paraffina fissa-congelato o formalina (FFPE) Sezioni. Questo metodo aggira il limite di diffrazione ottica trasformando chimicamente i campioni di tessuto in ibrido di idrogel tissutale e espandendoli fisicamente isoquinamente su più scale in acqua pura. A causa dell’espansione, le molecole precedentemente irrisolvibili sono separate e quindi possono essere osservate utilizzando un microscopio ottico convenzionale.
Introduction
Lo studio dell’organizzazione molecolare dei tessuti in un contesto tridimensionale (3D) può fornire una nuova comprensione delle funzioni biologiche e dello sviluppo della malattia. Tuttavia, questi ambienti su nanoscala sono al di là delle capacità di risoluzione dei microscopi tradizionali a diffrazione limitata (200-300 nm), dove la distanza minima risolvibile, d è definita da d / <!–
–> /NA. Qui è la lunghezza d’onda della luce e NA è l’apertura numerica (NA) del sistema di imaging. Recentemente, la visualizzazione diretta delle molecole fluorescenti etichettate è stata resa possibile dalle tecniche di imaging a super-risoluzione di recente sviluppo1,2,3, compreso l’esaurimento stimolato delle emissioni (STED), microscopia di localizzazione ad attivazione fotofoto (PALM), microscopia da ricostruzione ottica stocastica (STORM) e microscopia ad illuminazione strutturata (SIM). Sebbene queste tecniche di imaging abbiano rivoluzionato la comprensione della funzione biologica su scala nanometrica, in pratica, spesso si basano su apparecchiature costose e/o specializzate e fasi di elaborazione delle immagini, possono avere tempi di acquisizione più lenti rispetto a l’imaging ottico convenzionale, richiedono fluorofori con caratteristiche specifiche (come la capacità di commutazione fotografica e/o l’elevata fotostabilità). Inoltre, rimane una sfida eseguire l’imaging 3D a super-risoluzione su campioni di tessuto.
La microscopia di espansione (ExM), introdotta per la prima volta nel 20154,fornisce un mezzo alternativo di imaging di funzionalità su nanoscala (<70 nm) espandendo fisicamente campioni conservati incorporati in un idrogel polielettrolitico gonfiabile. Qui, le biomolecole e/o le etichette chiave sono ancorate in situ a una rete polimerica che può essere espansa isotopicamente dopo l'elaborazione chimica. Poiché l'espansione fisica aumenta la risoluzione effettiva totale, le molecole di interesse possono essere risolte utilizzando sistemi di imaging convenzionali con diffrazione limitata. Dalla pubblicazione del protocollo originale, in cui le etichette fluorescenti sintetizzate personalizzate erano ancorate alla rete polimerica4, sono state utilizzate nuove strategie per ancorare direttamente le proteine (Protein retention ExM, o proExM)5, 6,7,8,9 e RNA9,10,11,12 all’idrogel, e aumentare l’ingrandimento fisico attraverso iterativo espansione13 o adattando la chimica del gel8,14,15.
Qui presentiamo una versione adattata di proExM, chiamata patologia di espansione (ExPath)16, che è stata ottimizzata per i formati di patologia clinica. Il protocollo converte campioni clinici, tra cui campioni di tessuto umano fissati in formalina (FFPE), ematossialina ed eosina (H&E) macchiati e campioni di tessuto umano appena congelati montati su vetrini di vetro, in uno stato compatibile con ExM. Le proteine sono poi ancorate all’idrogel e viene eseguita l’omogeneizzazione meccanica (Figura 1)16. Con un’espansione lineare di 4 volte dei campioni, le immagini a super-risoluzione multicolore (70 nm) possono essere ottenute utilizzando un microscopio confocale convenzionale con una risoluzione di soli 300 nm e possono anche essere combinate con altre tecniche di imaging a super-risoluzione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo il protocollo ExPath16, una variante di proExM5 che può essere applicata ai tipi più comuni di campioni di biopsia clinica utilizzati in patologia, tra cui FFPE, H&E macchiati, e campioni freschi congelati su vetrini di vetro. La conversione del formato, il recupero dell’antigene e l’immunostaining dei campioni seguono protocolli di uso comune che non sono specifici di ExPath. A differenza del protocollo proExM originale9, ExPath s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Faculty Start-up fund della Carnegie Mellon University (Yz) e dal NIH Director’s New Innovator Award (DP2 OD025926-01 a Yz).
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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