Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

فحص لسلامة حاجز الدم في الدماغ في دروسوفيلا melanogaster

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60233
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Loyola University Chicago

Summary

سلامة حاجز الدم في الدماغ أمر بالغ الأهمية لوظيفة الجهاز العصبي. في دروسوفيلا melanogaster، يتكون حاجز الدم في الدماغ من الخلايا الغليفية أثناء تكوين الجنين في وقت متأخر. يصف هذا البروتوكول طرق اختبار تكوين حاجز الدم في الدماغ وصيانته في أجنة D. melanogaster واليرقات النجمية الثالثة.

Abstract

تطوير الجهاز العصبي السليم يشمل تشكيل حاجز الدم في الدماغ، وحاجز الانتشار الذي ينظم بإحكام الوصول إلى الجهاز العصبي ويحمي الأنسجة العصبية من السموم ومسببات الأمراض. وقد ارتبطت العيوب في تشكيل هذا الحاجز مع الاعتلال العصبي، وقد لوحظ انهيار هذا الحاجز في العديد من الأمراض العصبية. ولذلك، من الأهمية بمكان تحديد الجينات التي تنظم تشكيل وصيانة حاجز الدم في الدماغ لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة. من أجل فهم الأدوار الدقيقة التي تلعبها هذه الجينات في التنمية العصبية، فمن الضروري تقييم آثار التعبير الجيني المتغير على سلامة حاجز الدم في الدماغ. وقد تم العثور على العديد من الجزيئات التي تعمل في إنشاء حاجز الدم في الدماغ ليتم حفظها عبر الأنواع eukaryotic، بما في ذلك ذبابة الفاكهة، Drosophila melanogaster. وقد ثبت أن ذباب الفاكهة نظام نموذج ممتاز لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم تطوير الجهاز العصبي ووظيفته. يصف هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة للتدقيق في سلامة حاجز الدم في الدماغ خلال المراحل الجنينية واليرقات من تطور D. melanogaster.

Introduction

أثناء التنمية، والاتصالات الخلية والتفاعلات حاسمة لإنشاء هيكل الأنسجة والأعضاء والوظيفة. في بعض الحالات، هذه التفاعلات الخلية الخلية ختم الأجهزة من البيئة المحيطة لضمان وظيفة الجهاز السليم. هذا هو الحال بالنسبة للجهاز العصبي، الذي هو معزول عن طريق حاجز الدم في الدماغ (BBB). وقد تم ربط خلل في BBB في البشر إلى الاضطرابات العصبية بما في ذلك الصرع، وقد لوحظ انهيار الحاجز في الأمراض العصبية بما في ذلك التصلب المتعدد والتصلب الجانبي الضموري1. في الثدييات ، يتكون BBB من تقاطعات ضيقة بين الخلايا البطانية2،3. الحيوانات الأخرى، بما في ذلك ذبابة الفاكهة، دروسوفيلا melanogaster، لديها BBB تتألف من الخلايا الغليفية. هذه الخلايا الغليظة تشكل حاجزا نفاذيا انتقائيا للسيطرة على حركة المواد الغذائية، ومنتجات النفايات، والسموم، والجزيئات الكبيرة داخل وخارج الجهاز العصبي4. وهذا يسمح للحفاظ على التدرج الكهروكيميائي اللازم لإطلاق إمكانات العمل، مما يسمح للتنقل والتنسيق4. في D. melanogaster، وglia حماية الجهاز العصبي من الغنية بالبوتاسيوم ، مثل الدم الهيمولمف5.

في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والجهاز العصبي المحيطي (PNS) من D. melanogaster، طبقتين غليال الخارجي ، وglia subperineurial وglia العجان ، فضلا عن شبكة خارجية من المصفوفة خارج الخلية ، لاميلا العصبية ، تشكل الهيمولمفي الدماغ وحاجز العصب الهيمولمفي6, يشار إلى BBB في جميع أنحاء هذه المقالة. خلال التنمية subperineurial glia تصبح polyploidوتوسيع لتحيط الجهاز العصبي5،6،7،8،9،10،11 . وsubperineurial glia شكل تقاطعات الحاجز، والتي توفر حاجز الانتشار الرئيسي بين الهيمولمف والجهاز العصبي5،6،12. هذه التقاطعات هي مشابهة جزيئيا لتقاطعات تشبه الحاجز وجدت في paranodes من myelinating glia في الفقاريات، وأنها تؤدي نفس وظيفة تقاطعات ضيقة في BBB من الثدييات13،14، 15 , 16 سنة , 17.الفجوة غليا النجان، تنمو، والتفاف حول glia subperineurial لتنظيم انتشار الأيض والجزيئات الكبيرة6،10،18،19. اكتمال تشكيل BBB من قبل 18.5 ساعة بعد وضع البيض (AEL) في 25 درجة مئوية5،8. وقد حددت الدراسات السابقة الجينات التي هي المنظمين الحرجة لتشكيل BBB20،21،22. لفهم الأدوار الدقيقة لهذه الجينات بشكل أفضل، من المهم دراسة تأثير طفرة هذه المنظمين المحتملين على سلامة BBB. في حين حددت الدراسات السابقة نُهج اصالية في الأجنة واليرقات، إلا أن بروتوكولاً شاملاً لهذا الفحص لم يُوصف بعد5و7. يصف هذا البروتوكول خطوة بخطوة طرق لـ "وصف سلامة BBB" أثناء مراحل اليرقات الجنينية والثالثة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جمع العينات

  1. جمع الأجنة
    1. في كل قفص لجمع الأجنة، استخدم ما لا يقل عن 50 أنثى عذراء مع 20-25 ذكرًا للمجموعات. احتضان هذه الذبابات في زجاجة مع طعام الذرة أجار(جدول المواد)لمدة 1-2 أيام قبل بدء المجموعات23.
      ملاحظة: ويمكن استخدام المزيد من الذباب، ولكن ينبغي الاحتفاظ بنسبة الإناث إلى الذكور في 2:1.
    2. قبل الدافئة أطباق عصير التفاح أجار(الجدول 1)في 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: وهذا مطلوب للتنظيم السليم للأجنة. إذا كانت لوحات تجف بسرعة، إضافة وعاء مع الماء إلى الحاضنة لزيادة الرطوبة من الغرفة.
    3. التخدير الذباب من الخطوة 1.1.1 مع CO2 ونقل الذباب إلى قفص جمع. وضع طبق أجار عصير التفاح المستحم مسبقا مع مسحة صغيرة من معجون الخميرة على نهاية مفتوحة وآمنة إلى القفص مع الأكمام الحمراء(جدول المواد). من أجل مسح الأجنة القديمة، والسماح للذباب لوضع الأجنة / البيض على طبق أجار عصير التفاح لمدة 1 ساعة في 25 درجة مئوية.
    4. إزالة قفص جمع من الحاضنة. عكس الجانب شبكة قفص أسفل والاستفادة الذباب وصولا الى الجزء السفلي من القفص. استبدل عصير التفاح بطبق أجار جديد من عصير التفاح المُسخّن مسبقاً بطبق صغير من عجينة الخميرة. تجاهل اللوحة الأولى.
    5. السماح للذباب لوضع الأجنة / البيض على طبق عصير التفاح الجديد أجار لمدة 1 ساعة في 25 درجة مئوية. تجاهل هذه اللوحة بعد جمع 1 ح والمضي قدما إلى الخطوة التالية لجمع الأجنة للحقن.
    6. لجمع 17 جنينًا في مرحلة متأخرة (20-21 ح AEL)، اسمح للذباب من النمط الجيني المطلوب من الخطوات 1.1.1−1.1.5 بوضع على أطباق أجار جديدة من عصير التفاح المُسخّن مسبقاً مع مسحة صغيرة من عجينة الخميرة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ، لذلك ستكون الأجنة 20-21 ساعة من العمر في وقت التصوير.
      ملاحظة: يمكن تكرار هذه الخطوة كما هو مطلوب لجولات متعددة من جمع العينات والحقن والتصوير.
    7. جمع الأجنة من لوحات في مصفاة الخلية مع شبكة النايلون 70 ميكرومتر عن طريق إضافة الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) مع 0.1٪ السطحي غير الأيونية (PBTx؛ الجدول 1) لتغطية سطح اللوحة وتخفيف الأجنة من السطح باستخدام فرشاة الطلاء.
    8. الأجنة Dechorionate التي تم جمعها في مصفاة الخلية في محلول التبييض 50٪(الجدول 1)في طبق بيتري 100 ملم لمدة 5 دقائق مع التحريض في بعض الأحيان في درجة حرارة الغرفة. شطف الأجنة 3X عن طريق دوامة مصفاة الخلية في PBTx في طبق بيتري، وذلك باستخدام طبق جديد من PBTx في كل مرة.
    9. إذا كانت جميع الأجنة من النمط الجيني الصحيح، انتقل مباشرة إلى الخطوة 1.1.10. إذا كان توليد الأجنة من النمط الجيني الصحيح يتطلب صليبمع الذباب heterozygous، حدد الأجنة من النمط الجيني الصحيح باستخدام وجود أو عدم وجود الكروموسومات موازن ملحوظ الفلورسنت. استخدام مجهر مجسم مع قدرات الفلورسنت لاختيار النمط الجيني.
      ملاحظة: الكروموسومات موازن ملحوظ مع بروتين الفلورسنت مشوهالأصفر. Kruppel-Gal4، بروتين الفلورسنت الأخضر UAS (GFP)؛ وتويست-Gal4، UAS-GFP تعمل بشكل جيد لاختيار النمط الجيني في وقت متأخر من التكوين الجنيني(الجدول 2)24،25،26.
    10. باستخدام ماصة زجاجية، نقل الأجنة في PBTx إلى لوح هلام أجاروز 2٪(الجدول 1). إزالة السائل الزائد مع ورقة فلتر. محاذاة ~ 6-8 الأجنة على لوح هلام أجاروز 2٪ مع الخلفي إلى الجانب الأيمن والظهري التي تواجه(الشكل 1B).
      ملاحظة: يقع الميكروبيل، وهو الثقب الصغير الذي تدخل من خلاله الحيوانات المنوية إلى البويضة، في الطرف الأمامي للجنين. النهاية الخلفية أكثر تقريبًا. تظهر القصبة الهوائية باللون الأبيض وتقع في الجنين، مما يسمح بالتمييز بين الجانبين الدسير والبطني للجنين(الشكل 1B).
    11. إعداد شريحة مع قطعة واحدة من الشريط على الوجهين. اضغط بقوة على الشريحة على رأس الأجنة لنقلها إلى الشريط على الوجهين.
    12. إزالة الأجنة عن طريق الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة ~ (لا يتم استخدام المجففة). بعد الجفاف، تغطية الأجنة مع زيت الهالوكربون.
      ملاحظة: قد تختلف فترات الجفاف حسب درجة الحرارة والرطوبة والتهوية في الغرفة. وينبغي استخدام فترة الحضانة لإعداد جهاز للحقن والمجهر البؤري للتصوير، على النحو المبين في القسمين 2 و 3 من هذا البروتوكول.
  2. جمع اليرقات
    1. إعداد صليب مع 5-10 الذباب الإناث العذراء من النمط الجيني المطلوب ونصف عدد الذكور من النمط الجيني المطلوب في قارورة مع دقيق الذرة أجار الغذاء والحضانة في 25 درجة مئوية23.
    2. بعد 5-7 أيام، اعتمادا ً على النمط الجيني، جمع يرقات النجوم الثالثة المتجولة من القارورة برفق مع ملقط. شطف اليرقات في 1X PBS لإزالة المواد الغذائية عالقة في اليرقات. نقل اليرقات إلى طبق أجار عصير التفاح للكتابة الجينية كما هو موضح في الخطوة 1.1.9 إذا لزم الأمر.
    3. لف اليرقات على الأنسجة باستخدام فرشاة الطلاء لتجفيفها. نقل 6-8 يرقات إلى شريحة تم إعدادها بشريط على الوجهين باستخدام ملقط.

2. إعداد الإبر وحقن العينات

  1. سحب الإبر على سحب micropipette قبل بدء هذا البروتوكول. أنابيب الشعرية الآمنة في سحب إبرة وسحب وفقا لشكل إبرة القياسية والمعلمات لحقن D. melanogaster (الجدول 3)27. تخزين الإبر في طبق بيتري عن طريق الرسو في الطين حتى استخدامها للحقن.
  2. تحميل إبرة مع 5 ميكرولتر من 10 kDa dextran المترافقة إلى sulforhodamine 101 كلوريد حمض(جدول المواد)باستخدام 20 ميكرولتر هلام تحميل ماصة تلميح خلال فترة جفاف 25 دقيقة للأجنة (الخطوة 1.1.12)، أو مباشرة بعد نقل اليرقات إلى الشريحة (الخطوة 1.2.3).
  3. تحميل الإبرة في حامل إبرة ووضع في micromanipulator المضمون إلى قاعدة الصلب(جدول المواد).
    ملاحظة: يجب أن تكون الإبرة موازية تقريبا لمرحلة المجهر لحقن الأجنة وزاوية إلى أسفل قليلا لحقن اليرقات.
  4. تعيين جهاز الحقن(جدول المواد)إلى 50 رطل لكل بوصة مربعة، 5-10 مللي ثانية مع مجموعة من 10.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري تغيير هذه الإعدادات لجهاز حقن معين قيد الاستخدام.
  5. ضع الشريحة على خشبة المسرح وفرشاة حافة الإبرة على حافة الشريط على الوجهين في زاوية 45 درجة لإنشاء طرف زاوية مكسورة.
    ملاحظة: بالنسبة للأجنة فمن الضروري فقط لكسر غيض بما فيه الكفاية للسماح لتدفق dextran 10 kDa. إبرة مثالية لديها طرف زاوية قليلا وفقط قطرة صغيرة من الصبغة سوف يخرج مع كل حقن. بالنسبة لليرقات ، من الضروري كسر الطرف أكثر ، ولكن مع طرف زاوية لاختراق جدار الجسم اليرقات. سوف يخرج قطرة أكبر من الصبغة.
  6. ضخ دواسة القدم حتى الصبغة في غيض من الإبرة.
  7. محاذاة الإبرة بحيث تكون موازية للجنين أو زاوية إلى الأسفل قليلا نحو اليرقة.
  8. نقل الإبرة لثقب الطرف الخلفي للعينة وحقن العينة عن طريق ضخ دواسة القدم. حقن ~ 2 مل من الصبغة في الأجنة، و ~ 220 نمل من الصبغة في اليرقات.
    ملاحظة: يجب أن يفيض الجنين أو اليرقة بالصبغة إذا كان الحقن ناجحاً.
  9. لاحظ وقت الحقن لأغراض الحضانة. احتضان الأجنة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اليرقات الحاضنة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. مواصلة أسفل الشريحة لحقن عينات إضافية، مشيرا إلى وقت الحقن لكل عينة.
    ملاحظة: اعتماداً على السرعة التي يمكن بها إجراء التشريح اللاحقة وخطوات التصوير، يمكن حقن 4-8 عينات في كل مرة.

3. إعداد عينات للتصوير

  1. تصوير الأجنة
    1. بعد الحقن، قم بإعداد الأجنة للتصوير. تطبيق هلام النفط مع قضيب القطن يميل على الجانبين الأيمن والأيسر من العينات على الشريحة كفاصل لمنع الأضرار التي لحقت الأجنة عند وضع غطاء.
    2. عينات من الصور باستخدام مجهر بؤري في جميع أنحاء عمق الجنين مع هدف 20X. حساب النسبة المئوية لمجموع العينات مع صبغ لوحظ في الحبل العصبي البطني (VNC) باستخدام المعادلة التالية: ٪ من العينات مع BBB للخطر = عدد العينات مع تراكم الصبغة في VNC / العدد الإجمالي للعينات التي تم فحصها.
  2. تشريح اليرقات وتصويرها
    1. إعداد الشرائح لعينات اليرقات في وقت مبكر. جبل اثنين من الأغطية متباعدة ما يقرب من 0.5 سم وبصرف النظر إلى الشريحة مع طلاء الأظافر.
      ملاحظة: تعمل الأغطية كفواصل للدماغ، لذلك لا يتم تلفها أثناء عملية التركيب.
    2. بعد الحضانة 30 دقيقة، تشريح اليرقات في 1X PBS مباشرة على الشريحة التي سيتم استخدامها في التصوير. أولا، استخدام زوج واحد من الملقط للاستيلاء على اليرقات في منتصف الطريق أسفل الجسم اليرقات، واستخدام زوج ثان من الملقط لفصل النصفين الأمامي والخلفي من اليرقات.
    3. بعد ذلك، استخدم زوج ًا واحدًا من الملقط للإمساك بالمنطقة الأمامية عند السنانير، واستخدم زوجًا ثانيًا من الملقط لعكس جدار الجسم على طرف الملقط الذي يستحوذ على السنانير الفمية. سوف يتعرض الدماغ وVNC.
    4. فصل الدماغ وVNC من جدار الجسم عن طريق قطع الأعصاب، وإزالة جدار الجسم من الشريحة(الشكل 1C، D). قم بإزالة الأقراص التخيلية إذا رغبت في ذلك.
    5. تغطية العينة مع 10 ميكرولتر من الجلسرين 80٪ ووضع غطاء على رأس العينة للتصوير.
    6. صورة من خلال عمق أنسجة الجهاز العصبي باستخدام هدف 20X. حساب النسبة المئوية لمجموع العينات مع صبغ لوحظ في VNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الطرق الموصوفة هنا تسمح بتصور سلامة BBB في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي في D. melanogaster الأجنة واليرقات(الشكل 1). عند الانتهاء من تشكيل BBB في وقت متأخر من تكوين الأجنة، يعمل BBB لاستبعاد جزيئات كبيرة من الدماغ وVNC5. يستفيد هذا البروتوكول من هذه الوظيفة لـ "تشكيل BBB". عندما تم حقن الأجنة من النوع البري (أوريغون R) في وقت متأخر من المرحلة 17 (20-21 ساعة) مع 10 kDa dextran المترافقة مع sulforhodamine 101 حمض كلوريد الفلورسنت صبغة، تم استبعاد جزيء dextran كبيرة من VNC، كما هو متوقع(الشكل 2A). من أجل إظهار تأثير الطفرات الوراثية على سلامة BBB، تم استخدام الأجنة مع الطفرات في الجينات الخام. في السابق، وقد ثبت الجين الخام لتنظيم تراجع الفرقة الجرثومية خلال تكوين الأجنة، ومؤخرا ثبت أن تعمل في glia لتنظيم التغيرات المورفولوجية في VNC خلال التنمية28. وقد أظهرت الأجنة المتحولة الخام Heterozygous BBB سليمة، على غرار النتائج التي لوحظت في الأجنة السيطرة من النوع البري(الشكل 2باء). وعلى النقيض من ذلك، أظهرت الأجنة المتحولة الخام المتجانسة 1 عيوبفي سلامة BBB، مع 10 كيلودا dextran صبغ الفيضانات في VNC، مما يشير إلى أن BBB فشلت في تشكيل(الشكل 2C). وتبين هذه النتائج قدرة هذه التقنية على تحديد تكوين BBB خلال المراحل الجنينية.

وقد أظهرت الدراسات السابقة أن وجود خلل في بوليا تحت النبر يؤدي إلى تعطيل BBB التي يمكن ملاحظتها في المراحل الثالثة اليرقات instar7،9. وهكذا، فإن العيوب في تكوين BBB و / أو الصيانة يمكن أن تؤدي إلى BBB للخطر خلال المراحل اللاحقة من التنمية، مما يجعل من المستحسن اختبار سلامة الحاجز في المرحلة الثالثة من اليرقات instar. ولذلك، فإن البروتوكول المستخدم في تقدير سلامة BBB في المراحل الجنينية قد تم تحسينه للاستخدام في اليرقات. في أوريغون R عينات التحكم، 10 kDa dextran فشل في اختراق BBB ومستبعد من الدماغ وVNC(الشكل 2D، E). تتراكم الصبغة في محيط BBB.

Figure 1
الشكل 1: الجهاز العصبي للمرحلة 17 الأجنة واليرقات instar الثالث. (أ)مخطط لطريقة عرض بطنية للمرحلة 17 الجهاز العصبي المركزي الجنيني (CNS). يتكون الجهاز العصبي الوطني من الدماغ (Br) والحبل العصبي البطني (VNC)، الذي يحتوي على قنوات دورسوفينترال (ch). يمكن استخدام micropyle (mp; arrowhead) في الطرف الأمامي لتوجيه الجنين. الخلفي إلى اليمين. (ب)المرحلة 17 الجنين الموجهة مع الجانب الظهري صعودا والخلفي إلى اليمين، على النحو الموصى به في الخطوة 1.1.10. الأسهم تشير إلى القصبة الهوائية. رأس السهم يشير إلى النائب. الخلفي إلى اليمين. (ج)مخطط الجهاز العصبي في يرقات النجمة الثالثة. الدماغ (Br) وVNC يؤلف الجهاز العصبي الوطني, في حين أن الأعصاب تمتد من متشابك VNC على عضلات جدار الجسم وهي جزء من PNS. الخلفي إلى اليمين. (د)تشريح الدماغ اليرقات النشودية الثالثة وVNC. الخلفي إلى اليمين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: اختبار لتشكيل حاجز الدم في الدماغ (BBB). (A-C) في مرحلة متأخرة 17 الأجنة (20-21 ح القديمة) حقن لاحق مع 10 kDa sulforhodamine 101 حمض كلوريد dextran. من الخلف للأسفل شريط مقياس = 20 ميكرومتر. النقاط التي ينظر إليها في الضوابط هي القنوات الـ dorsoventral التي تمتد الحبل العصبي البطني (VNC). (أ)ولاية أوريغون R السيطرة. صبغ الاستفادة في 6.25٪ من العينات، ن = 16. (B) الخام1/+ عنصر تحكم الأشقاء. صبغ الاستفادة في 6.67٪ من العينات، ن = 15. (ج)الإنسان الخام1/1 متحولة. صبغ الاستفادة في 100٪ من العينات، ن = 22. (د)أوريغون R السيطرة على الدماغ اليرقات instar الثالث. تتراكم الصبغة في BBB، ولكن لا تخترق الجهاز العصبي المركزي، ن = 7. شريط مقياس = 50 درجة مئوية. (E)أوريغون R السيطرة الثالثة إينستار & VNC اليرقات. تتراكم الصبغة في BBB، ولكن لا تخترق الجهاز العصبي المركزي، ن = 11. خط متقطع يحدد VNC. شريط مقياس = 50 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مورفولوجيا ميدغوت في التطور الجنيني المتأخر. تسمح الصور الخفيفة المنقولة للمرحلة 13-17 من الأجنة بتصور مورفولوجيا الأمعاء (المناطق الرمادية الداكنة في النصف الخلفي من الجنين). يمكن استخدام مورفولوجيا ميدغوت لتحديد مرحلة التطور الجنيني، وهو أمر مفيد عند تحديد ما إذا كانت الأجنة تتراوح أعمارهم بشكل مناسب للحقن. شريط مقياس = 100 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حل وصفه
2% جل أغاروز أضف 0.8 غرام من الأجاروز إلى 40 مل من H2O المقطر مرتين (ddH2O) في قارورة Erlenmeyer وميكروويف لإذابة أجار. صب في علبة صب هلام والسماح للهلام لتترسخ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
أطباق أجار عصير التفاح قياس 45 غرام من أجار و 1.5 لتر من ddH2O في قارورة 4 لتر. الأوتوكلاف لمدة 40-45 دقيقة عند 121 درجة مئوية. قياس 50 غرام من السكر و 0.5 لتر من عصير التفاح في كوب 1 لتر ويحرك على نار هادئة (الإعداد 3) لإذابة السكر، مع الحرص على عدم حرقه. بعد الأوتوكلاف، إضافة السكر والتفاح ساخنة مسبقا إلى أجار والماء. يُحرّك المزيج على نار خفيفة مع التخلص من الحرارة حتى يبرد حتى تتمكن من لمسه. يُضاف 15 مل من 70% من التاغوسبت ويُحرّك المزيج لتفريقه. صب في 0.5 L الكأس. رش مع الإيثانول لإزالة فقاعات أو لهب مع الموقد Bunsen. صب في أطباق بيتري 60 ملم. السماح لتعيين لمدة 24 ساعة على الأقل، أو حتى يكون هناك الحد الأدنى من التكثيف على أغطية أطباق بيتري وتخزينها في 4 درجة مئوية.
50٪ التبييض إضافة 15 مل من ddH2O و 15 مل من التبييض المنزلية في أنبوب مخروطي.
80% الجلسرين ل10 مل، إضافة 8 مل من الأوتوكلاف ddH2O و 2 مل من الجلسرين إلى أنبوب مخروطي 15 مل. احتضان على الروك حتى الحل متجانسة.
1x PBS ل1 لتر، تمييع 100 مل من 10X PBS في 900 مل من ddH2O.
10x PBS ل2 لتر، حل ما يلي في 1600 مل من ddH2O: 160 غرام من حمض الكلر، 4 غرام من كل كاف، 28.8 غرام من Na2HPO4،و 4.8 غرام من KH2PO4. ضبط الحموضة إلى 7.5 مع حمض الهيدروكلوريك.
PBTx (PBS + 0.1٪ السطحي غير الأيونية) ل1 لتر، والجمع بين 100 مل من 10X PBS، 10 مل من 10٪ السطحي غير الأيونية، و 890 مل من ddH2O.
70% تيغوسبت مزيج 1 غرام من حمض ب هيدروكسي بنزويك، إستر الميثيل لكل 10 مل من الإيثانول 100٪. تخزين في -20 درجة مئوية.
10٪ السطحي غير الأيونية ل50 مل، إضافة 45 مل من الأوتوكلاف ddH2O و 5 مل من السطحي غير الأيونية إلى أنبوب مخروطي. تدوير على الروك حتى الحل متجانسة.
معجون الخميرة اخلط الخميرة الجافة النشطة مع ddH2O في كوب بلاستيكي بـ 50 مل حتى يصبح ناعماً.

الجدول 1: الكواشف والمخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول.

الجيني الاسهم
ث[1118]; Ln(2LR)Gla, wg[Gla-1]/CyO, P{w[+mC]=GAL4-twi.G}2.2, P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH2.2 بلومينغتون #6662
ث {*]; sna[Sco]/CyO, P{w [+mC]=Dfd-EYFP}2 بلومينغتون #8578
ث {*]; L[2] Pin[1]/CyO, P{w [+mC]=GAL4-Kr.C}DC3, P{w[+mC]=UAS=GFP. S65T}DC7 بلومينغتون #5194
Df(1)JA27/FM7c, P{w [+mC]=GAL4-Kr.C}DC1, P{w[+mC]=UAS-GFP. S65T}DC5, sn[+] بلومينغتون #5193
ث [*]; ry[506] Dr[1]/TM6B, P{w[+mc]=Dfd-EYFP}3, Sb[1] Tb[1] ca[1] بلومينغتون #8704
y[1] ث [*]; D[*] gl[3]/TM3, P{w [+mC]=GAL4-Kr.C}DC2, P{w[+mC]=UAS-GFP. S65T}DC10, Sb[1] بلومينغتون #5195
أوريغون R سلالات متعددة متوفرة
الخام[1] cn[1] bw[1] sp[1]/CyO بلومينغتون #2749
P{w[+mW.hs]=GawB}elav[C155] بلومينغتون #458
ث[1118]; P{w [+m*]=GAL4} repo/TM3, Sb[1] بلومينغتون #7415
P{UAS-GFP} سلالات متعددة متاحة

الجدول 2: سلالات الطيران. سلالات الطيران التي نوقشت في جميع أنحاء هذا البروتوكول. يتم توفير رقم سهم مركز بلومينغتون دروسوفيلا للأوراق المالية حيثما ينطبق ذلك.

دوره الحراره سحب السرعه الوقت الضغط منحدر
1 590 115 15 250 600 عاشرا
2 575 130 60 250 600 عاشرا

الجدول 3: إعدادات سحب Micropipette. إعدادات سحب Micropipette المستخدمة لتوليد الإبر للحقن في هذا البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يقدم هذا البروتوكول وصفاً شاملاً للخطوات اللازمة للتدقيق في سلامة BBB خلال المراحل الجنينية المتأخرة والثالثة من تطور الميلانينوغاستر. وقد تم وصف نُهج مماثلة في أماكن أخرى للتحقق من سلامة BBB أثناء التنمية، وكذلك في مراحل البالغين5و7و29و30. ومع ذلك، فإن وصف الإجراءات في أقسام المواد والأساليب غالباً ما يكون واسع النطاق في طبيعته ويفتقر إلى التفاصيل الكافية لسهولة التنفيذ، مما يستلزم استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل كبير نيابة عن الباحث. يقدم هذا البروتوكول وصفاً شاملاً للخطوات اللازمة للتدقيق في سلامة BBB أثناء المراحل الجنينية واليرقاتية. وفي كل مرحلة، هناك خطوات حاسمة ينبغي اتباعها لضمان دراسة المرحلة الصحيحة من التطوير وعدم تعطيل بنية الأنسجة، مما قد يعرض مصرف البحرين المركزي للخطر. ومن أجل تحقيق النجاح في هذه النهج، كان من الضروري استكشاف أخطاء خطوات متعددة من البروتوكول وإصلاحها من أجل تحقيق نتائج دقيقة. ويرد أدناه وصف للخطوات الحاسمة في البروتوكولات الجنينية واليرقات.

وقد أفادت الدراسات السابقة إنشاء BBB بنسبة 18.5 ح AEL5. لضمان توقيت النمو الدقيق، من المهم الحفاظ على العينات في درجة حرارة ثابتة أثناء الشيخوخة. عند جمع الأجنة، يجب إحضار أطباق أجار عصير التفاح إلى 25 درجة مئوية قبل استخدامها لجمعها. باستخدام لوحات عصير التفاح التي لم تكن نتائج ساخنة مسبقا في التنمية أبطأ ويمكن أن تسفر عن العينات التي لم تنشئ بعد BBB وبالتالي سوف تظهر تراكم 10 kDa dextran في الجهاز العصبي. وعلى هذا النحو، من المهم التأكد من أن المرء هو حقن العينات التي هي أقدم من 18.5 ساعة. ال [ا] متأخّرة إقامة من ال [بّب]. ولحساب أي تأخيرات محتملة في النمو، تم فحص العينات في 20-21 ساعة من AEL، بعد فترة ما تم الإبلاغ عنها عن تشكيل BBB. استخدام مورفولوجيا الأنسجة الأخرى، ولا سيما منتصف القناة النامية، يمكن أن تساعد في تحديد المرحلة الصحيحة من تطور الجنين يجري فحص(الشكل 3). وعلى العكس من ذلك، يمكن أن يؤدي التوقيت التجريبي غير السليم إلى عينات من الموليبالفعل وبدأت عملية الفقس. للحد من عدد اليرقات التي بدأت بالفعل الفقس، من المهم إجراء ما لا يقل عن مجموعتين 1 ساعة لمسح الأجنة القديمة من الإناث قبل جمع الأجنة للحقن. إذا كان من المرغوب فيه تحليل BBB في اليرقات instar الأولى، يمكن استخدام حضانة قصيرة من اليرقات في 1X PBS في طبق 9 بئر على الجليد للحد من الحركة قبل الحقن. كما يمكن الاحتفاظ بالشرائح على حزمة ثلج أثناء إجراء الحقن لتقليل الحركة.

من أجل ضمان جودة الصور والنتائج الدقيقة فيما يتعلق بإنشاء BBB في الجنين، يجب اتباع خطوات إضافية بعناية طوال الإجراء. عند اصطفاف الأجنة على بلاطة أجار، يجب أن تواجه القصبة الهوائية، لأن هذا هو الجانب الأبهري من الجنين(الشكل 1ب). عندما يتم نقل الأجنة إلى الشريحة مع الشريط على الوجهين، فإن الجانب البطني من الجنين سوف تواجه بعد ذلك، مما يسمح للتصور الأمثل للسلك العصبي أثناء التصوير البؤري في وقت لاحق في البروتوكول. كما يجب الالتزام بالأجنة بشكل آمن بالشريط ذي الوجهين لمنع الحركة أثناء الحقن. استخدام لوحة أغاروز مسطحة 2٪ يسمح للباحث لدفع الشريحة مع الشريط على الوجهين بحزم على الأجنة خلال عملية نقل دون خطر الإضرار بالأجنة. بعد نقل إلى الشريحة ، من الضروري جفاف لمنع الجنين من الانفجار عند حقن الصبغة. حقن الكثير من الصبغة يمكن أن يسبب أيضا الجنين لتنفجر. من المهم فقط إدخال الإبرة في الجنين بما فيه الكفاية لحقن الصبغة، ولكن ليس كثيرا أن الإبرة يحتمل أن ثقوب الجهاز العصبي، والتي من شأنها أن تعطي نتيجة إيجابية كاذبة. كبير جدا من جرح ثقب يمكن أن يؤدي أيضا إلى الهيمولمفي وصبغ الفيضانات من الجنين، مما يؤدي إلى تجربة فاشلة. مع هذه المزالق المحتملة في الاعتبار، والحقن هو الأكثر نجاحا مع إبرة التي لديها زاوية طفيفة إلى الطرف، بحيث أن هناك نقطة صغيرة التي لثقب الجنين بعناية.

في حالة فحص اليرقات لسلامة BBB ، يمكن أن تنشأ تحديات بسبب حركية العينة. استخدام شريط عالي الجودة على الوجهين أمر بالغ الأهمية، كما ينبغي أن يكون فعالا في تعطيل اليرقات للحقن. إذا أصبحت اليرقة غير عالقة، فإنه يمكن أن توالت مرة أخرى على الشريط ودفع بلطف إلى أسفل لإعادة تأمينه. عند نقل اليرقات للحقن ، من المفيد حمل الشريحة في طبق بيتري في حالة عدم تعثر اليرقات. الخطوات التالية حقن تتطلب معظم الرعاية لتجنب اضطراب BBB. من أجل تقليل الضرر المحتمل للعينة، فمن الأسهل لتشريح العينة مباشرة على الشرائح التي سيتم استخدامها للتصوير. إذا تم الالتزام بشدة اليرقة إلى الشريط عند نقل العينة للتشريح، يمكن إضافة قطرة من 1X PBS إلى الشريط لتخفيف التصاق والسماح لنقلها إلى الشريحة للتشريح. بعد تشريح، من المهم تسوية العينة بما فيه الكفاية لتجنب نتائج إيجابية كاذبة، ولكن ليس كثيرا أن يتم اختراق سلامة العينة. إن وضع اليرقات بين غطاء الغلاف والشريحة باستخدام الأغطية الإضافية حيث أن الفواصل تمنع تلف الدماغ، ومع ذلك تعطل العينة من أجل التصوير الفعال.

من أجل تحقيق النجاح مع بروتوكولات لكل من الأجنة واليرقات، فمن الأهمية بمكان للتأكد من أن يتم إعداد جهاز الحقن والمجهر البؤري قبل بدء معالجة العينة. وهذا يسمح لتوقيت دقيق في تصوير العينات، وهو أمر ضروري لمقارنة العينة. وقد استخدمت نُهج أخرى عمليات حقن أكثر تقدماً، مما يتطلب مجهراً مقلوباً تم إعداده لحقن الأجنة. يستخدم هذا البروتوكول مجهر تشريح قياسي وmicromanipulator مع منظم الضغط. في هذه الحالة، تم ببساطة تكييف حقن سمك الحمار الوحشي التي أنشئت لحقن الأجنة يطير واليرقات. ويمكن تبسيط هذا البروتوكول أكثر لاستخدام المتلاعب المجهري مع حقنة للحقن أيضا. وكثير من هذه الأدوات متاح بسهولة في أقسام البيولوجيا، بل قد يكون متاحا ً في الفصول الدراسية المختبرية، مما يسمح بأقصى قدر من السهولة في تنفيذ البروتوكول.

أثناء إجراء التصوير، يمكن أن يكون من المفيد تسمية خلايا الجهاز العصبي لتحديد المنطقة المطلوبة للتصوير بسهولة أكبر. على وجه التحديد، يمكن للمرء أن يستخدم نظام GAL4 /UAS للتعبير عن GFP في الخلايا العصبية أو glia، وذلك باستخدام سلالات elav-Gal4أو repo-Gal4،على التوالي(الجدول 2)31،32،33. ومن شأن وضع العلامات هذه أن يوفر تناقضاً مع حمض الكلوريد 101 لتصور سلامة الجهاز العصبي.

في حين أن هذه الطريقة تركز على تقدير سلامة BBB أثناء تطوير D. melanogaster، يمكن تكييف هذا النهج لدراسة سلامة الحواجز الأخرى عبر مجموعة متنوعة من الكائنات الحية والأنسجة. على سبيل المثال، تم نشر بروتوكولات مماثلة لـ bBB في الفئران34. وبالإضافة إلى ذلك، نفاذية حاجز العين في الدم والحاجز الجسدي المحيط بالخلايا الجرثومية أثناء تكوين الحيوانات المنوية في D. melanogaster استخدام نهج مماثل29،35. ويمكن أيضا تكييف البروتوكول للاستخدام في الأنسجة الأخرى لاختبار النفاذية، بما في ذلك في الأمعاء. عند تكييف هذا البروتوكول للاستخدام في الأنسجة أو الأنواع الأخرى، سيكون من الضروري النظر في حجم الجزيئات التي يمكن أن تخترق الحاجز، حيث أنه من الممكن أن 10 kDa dextran قد تكون صغيرة بما يكفي لتتخلل بعض الحواجز. بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لفحص سلامة BBB أثناء تطوير D. melanogaster التي يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام في إعدادات أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويشكر المؤلفان الدكتور ف. براين بيكيت والدكتور رودني دايل على استخدام معدات للحقن. تم تمويل هذا العمل من خلال تمويل البحوث من جامعة لويولا شيكاغو إلى دكتوراه في الد، D.T.، وJ.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran ThermoFisher Scientific D1863 Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips Eppendorf 22351656
100% Ethanol (200 proof) Pharmco-Aaper 11000200
Active Dry Yeast Red Star
Agar Fisher Scientific BP1423
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Air Compressor DeWalt D55140
Apple Juice Mott's Natural Apple Juice
Bleach Household Bleach 1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Bottle Plugs Fisher Scientific AS-277
Cell Strainers BD Falcon 352350
Confocal Microscope Olympus FV1000 Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator Puritan 19-062614
Double-Sided Tape 1/2" Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip Roboz RS-5015
Fly Food Bottles Fisher Scientific AS-355
Fly Food Vials Fisher Scientific AS-515
Foot Pedal Treadlite II T-91-S
Gel Caster Bio-Rad 1704422
Gel Tray Bio-Rad 1704436
Glass Pipette VWR 14673-010
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Granulated sugar Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil Lab Scientific, Inc. FLY-7000
Light Source Schott Ace I
Manipulator Stand World Precision Instruments M10
Micromanipulator World Precision Instruments KITE-R
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Needle Holder World Precision Instruments MPH310
Nightsea Filter Sets Electron Microscopy Science SFA-LFS-CY For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head Electron Microscopy Science SFA-RB For visualization of GFP
Paintbrush Simply Simmons Chisel Blender #6
Pipetter Fisher Scientific 13-683C
Pneumatic Pump World Precision Instruments PV830 This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Small Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-100
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Steel Base Plate World Precision Instruments 5052
Stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000 Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source Baytronix Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) Genesee Scientific 20-258
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 Nonionic surfactant
Vial Plugs Fisher Scientific AS-273

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  2. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  3. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
  4. Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
  5. Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
  6. Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
  7. Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
  8. Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
  9. Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
  10. von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
  11. Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
  12. Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
  13. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  14. Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
  15. Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
  16. Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
  17. Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
  18. von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
  19. Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
  20. Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
  21. Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
  22. DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
  23. BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
  24. Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
  25. Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
  26. Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
  27. Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
  28. Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
  29. Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
  30. Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
  31. Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
  32. Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
  33. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  34. Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
  35. Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).

Tags

علم الأحياء التنموية العدد 151 دروسوفيلا ميلانوجاستر,حاجز الدم في الدماغ glia الجهاز العصبي الحبل العصبي البطني الجنين اليرقات
فحص لسلامة حاجز الدم في الدماغ في <em>دروسوفيلا melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J.… More

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233, doi:10.3791/60233 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter