A integridade da barreira hematoencefálica é fundamental para a função do sistema nervoso. Na Drosophila melanogaster, a barreira hematoencefálica é formada por células gliais durante a embriogênese tardia. Este protocolo descreve métodos para o ensaio para a formação e a manutenção da barreira do sangue-cérebro em embriões do melanogaster do D. e em larvas do terceiro instar.
O desenvolvimento do sistema nervoso adequado inclui a formação da barreira hemato-encefálica, a barreira de difusão que regula firmemente o acesso ao sistema nervoso e protege o tecido neural de toxinas e patógenos. Os defeitos na formação desta barreira foram correlacionados com os neuropathies, e a avaria desta barreira foi observada em muitas doenças neurodegenerativas. Portanto, é fundamental identificar os genes que regulam a formação e manutenção da barreira hemato-encefálica para identificar potenciais alvos terapêuticos. A fim compreender os papéis exatos que estes genes jogam no desenvolvimento neural, é necessário ensaiar os efeitos da expressão de gene alterada na integridade da barreira do sangue-cérebro. Muitas das moléculas que funcionam no estabelecimento da barreira hemato-encefálica foram encontradas para serem conservadas em espécies eucarióticas, incluindo a mosca da fruta, a Drosophila melanogaster. As moscas da fruta provaram ser um sistema modelo excelente para examinar os mecanismos moleculars que regulam o desenvolvimento e a função do sistema nervoso. Este protocolo descreve um procedimento passo a passo para o ensaio da integridade da barreira hematoencefálica durante os estágios embrionário e larval do desenvolvimento de D. melanogaster .
Durante o desenvolvimento, a comunicação celular e as interações são críticas para o estabelecimento da estrutura e função do tecido e do órgão. Em alguns casos, essas interações célula-célula selar fora órgãos do ambiente circundante para garantir a função adequada do órgão. Este é o caso para o sistema nervoso, que é isolado pela barreira sangue-cérebro (BBB). A disfunção do BBB em humanos tem sido associada a distúrbios neurológicos, incluindo epilepsia, e a quebra da barreira tem sido observada em doenças neurodegenerativas, incluindo esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica1. Nos mamíferos, o BBB é formado por junções apertadas entre as células endoteliais2,3. Outros animais, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, têm um BBB composto de células gliais. Estas células gliais formam uma barreira seletivamente permeável para controlar o movimento de nutrientes, produtos residuais, toxinas e grandes moléculas dentro e fora do sistema nervoso4. Isto permite a manutenção do gradiente eletroquímico necessário ao fogo potencial de ação, permitindo a mobilidade e coordenação4. Em D. melanogaster, o glia proteger o sistema nervoso do potássio-rico, sangue-como hemolinfa5.
No sistema nervoso central (SNC) e no sistema nervoso periférico (PNS) de D. melanogaster, duas camadas gliais exteriores, a glia subperinelares e o perinurais glia, bem como uma rede externa de matriz extracelular, a lamela neural, formam a hemolinfa-cérebro e hemolinfa-barreira nervosa6, referido como o BBB ao longo deste artigo. Durante o desenvolvimento subperinurais glia tornar-se poliploide e ampliar para cercar o sistema nervoso5,6,7,8,9,10,11 . As junções septadas do formulário do glia de subperinurais, que fornecem a barreira principal da difusão entre o hemolinfa e o sistema nervoso5,6,12. Estas junções são molecularmente similares às junções septate-like encontradas nos paranodes de glia de nos vertebrados, e executam a mesma função que junções apertadas no BBB dos mamíferos13,14, 15 anos de , 16 anos de , 17. o perinurais glia divide, cresce, e envolve em torno da glia subperinurais para regular a difusão de metabólitos e grandes moléculas6,10,18,19. A formação de BBB é completa por 18,5 h após a colocação do ovo (AEL) em 25 ° c5,8. Estudos prévios identificaram genes que são reguladores críticos da formação BBB20,21,22. Para compreender melhor os papéis exatos destes genes, é importante examinar o efeito da mutação destes reguladores potenciais na integridade de BBB. Embora estudos prévios tenham delineado abordagens para a integridade do BBB em embriões e larvas, um protocolo abrangente para este ensaio ainda não foi descrito5,7. Este protocolo passo a passo descreve métodos para ensaio a integridade BBB durante estágios larvares embrionário e terceiro instar D. melanogaster .
Este protocolo fornece uma descrição detalhada das etapas necessárias para o ensaio para a integridade BBB durante os estágios larvares embrionário e terceiro instar tardio do desenvolvimento de D. melanogaster . Abordagens semelhantes têm sido descritas em outro lugar para o ensaio da integridade do BBB durante o desenvolvimento, bem como em estágios adultos5,7,29,30. No entant…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem ao Dr. F. Bryan Pickett e ao Dr. Rodney Dale pelo uso de equipamentos para injeção. Este trabalho foi financiado por financiamento de pesquisa da Loyola University Chicago para M.D., D.T., e J.J.
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
Active Dry Yeast | Red Star | ||
Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
Light Source | Schott | Ace I | |
Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |