Summary
Blut - Hirn-Schranke Integrität ist entscheidend für die Funktion des Nervensystems. Bei Drosophila melanogasterwird die Blut-Hirn-Schranke bei der späten Embryogenese durch Gliazellen gebildet. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Bildung und Erhaltung von Blut-Hirn-Barrieren bei D. melanogaster Embryonen und dritten Instarlarven.
Abstract
Die richtige Entwicklung des Nervensystems umfasst die Bildung der Blut- und Hirnschranke, der Diffusionsbarriere, die den Zugang zum Nervensystem streng reguliert und das Nervengewebe vor Giftstoffen und Krankheitserregern schützt. Defekte bei der Bildung dieser Barriere wurden mit Neuropathien korreliert, und der Abbau dieser Barriere wurde bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet. Daher ist es wichtig, die Gene zu identifizieren, die die Bildung und Aufrechterhaltung der Blut-Hirn-Schranke regulieren, um potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Um die genaue Rolle dieser Gene bei der neuronalen Entwicklung zu verstehen, ist es notwendig, die Auswirkungen der veränderten Genexpression auf die Integrität der Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen. Viele der Moleküle, die bei der Etablierung der Blut - Hirn-Schranke funktionieren, wurden gefunden, um über eukaryotische Arten konserviert werden, einschließlich der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster. Fruchtfliegen haben sich als ausgezeichnetes Modellsystem zur Untersuchung der molekularen Mechanismen zur Regulierung der Entwicklung und Funktion des Nervensystems erwiesen. Dieses Protokoll beschreibt ein Schrittweiseverfahren zur Untersuchung der Integrität der Blut- und Hirnschranke während der embryonalen und larven endenden Stadien der D. melanogaster Entwicklung.
Introduction
Während der Entwicklung sind Zell-Zell-Kommunikation und Wechselwirkungen entscheidend für die Etablierung von Gewebe- und Organstruktur und -funktion. In einigen Fällen versiegeln diese Zell-Zell-Wechselwirkungen Organe aus der Umgebung, um eine ordnungsgemäße Organfunktion zu gewährleisten. Dies gilt für das Nervensystem, das durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) isoliert wird. Dysfunktion der BBB beim Menschen wurde mit neurologischen Erkrankungen einschließlich Epilepsie verbunden, und Abbau der Barriere wurde bei neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Multipler Sklerose und amyotrophe Lateralsklerose beobachtet1. Bei Säugetieren wird das BBB durch enge Kreuzungen zwischen den Endothelzellen2,3gebildet. Andere Tiere, einschließlich der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, haben ein BBB, das aus Gliazellen besteht. Diese Gliazellen bilden eine selektiv durchlässige Barriere, um die Bewegung von Nährstoffen, Abfallprodukten, Toxinen und großen Molekülen in und aus dem Nervensystem zu kontrollieren4. Dies ermöglicht die Aufrechterhaltung des elektrochemischen Gradienten, der notwendig ist, um Einwirkungspotentiale abzufeuern, was Mobilität und Koordination ermöglicht4. In D. melanogasterschützen die Glia das Nervensystem vor der kaliumreichen, blutähnlichen Hämolymphe5.
Im Zentralnervensystem (ZNS) und peripheren Nervensystem (PNS) von D. melanogasterbilden zwei äußere Gliaschichten, die subperineuriale Glia und die perineuriale Glia, sowie ein äußeres Netzwerk extrazellulärer Matrix, die neuronale Lamelle, die Hämolymphe-Gehirn und Hämlymph-Nerven-Barriere6, in diesem Artikel als BBB bezeichnet. Während der Entwicklung subperineurialglia werden polyploid und vergrößern, um das Nervensystem zu umgeben5,6,7,8,9,10,11 . Die subperineurialen Glia bilden Septat-Kreuzungen, die die Hauptdiffusionsbarriere zwischen der Hämolymphe und dem Nervensystem5,6,12. Diese Kreuzungen ähneln molekular den septatartigen Kreuzungen, die an den Paranoden der myelinierenden Glia in Wirbeltieren gefunden werden, und sie erfüllen die gleiche Funktion wie enge Kreuzungen in der BBB von Säugetieren13,14, 15 , 16 , 17. Die perineuriale Glia teilen, wachsen und wickeln um die subperineuriale Glia, um die Diffusion von Metaboliten und großen Molekülenzuregulieren 6,10,18,19. Die BBB-Formation ist nach der Eiablage (AEL) bei 25 °C5,8um 18,5 h abgeschlossen. Frühere Studien haben Gene identifiziert, die kritische Regulatoren der BBB-Bildung20,21,22sind. Um die genauen Rollen dieser Gene besser zu verstehen, ist es wichtig, die Auswirkungen der Mutation dieser potenziellen Regulatoren auf die BBB-Integrität zu untersuchen. Während frühere Studien Ansätze für die Prüfung der BBB-Integrität in Embryonen und Larven skizziert haben, muss ein umfassendes Protokoll für diesen Test noch beschrieben werden5,7. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll beschreibt Methoden zur Prüfung der BBB-Integrität während der D. melanogaster embryonalen und dritten instar larval Enden.
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Protocol
1. Entnahme von Proben
- Embryo-Sammlung
- Verwenden Sie in jedem Embryo-Entnahmekäfig mindestens 50 jungfräuliche Weibchen mit 20 bis 25 Männchen für Sammlungen. Inkubieren Sie diese Fliegen in einer Flasche mit Maismehl-Agar-Lebensmittel (Tabelle der Materialien) für 1 bis 2 Tage vor Beginn der Sammlungen23.
HINWEIS: Es können mehr Fliegen verwendet werden, aber das Verhältnis zwischen Frau und Mann sollte bei 2:1 gehalten werden. - Vorwarme Apfelsaft-Agar-Teller (Tabelle 1) bei 25 °C über Nacht.
HINWEIS: Dies ist für die ordnungsgemäße Inszenierung von Embryonen erforderlich. Wenn Die Platten schnell austrocknen, fügen Sie eine Schüssel mit Wasser in den Inkubator, um die Feuchtigkeit der Kammer zu erhöhen. - Anästhesidien fliegen ab Schritt 1.1.1 mit CO2 und übertragen Fliegen in einen Sammelkäfig. Legen Sie einen vorgewärmten Apfelsaft Agar Teller mit einem kleinen Abstrich von Hefepaste auf dem offenen Ende und sichern Sie den Käfig mit der roten Hülse (Tisch der Materialien). Um ältere Embryonen zu löschen, lassen Sie Fliegen Embryonen/Eier 1 h bei 25 °C auf einen Apfelsaft-Agarteller legen.
- Entfernen Sie den Sammelkäfig aus dem Inkubator. Invertieren Sie das Käfignetz seite nach unten und tippen Sie auf den Boden des Käfigs. Ersetzen Sie den Apfelsaft-Agar durch einen neuen vorgewärmten Apfelsaft-Agarteller mit einem kleinen Abstrich aus Hefepaste. Entsorgen Sie die erste Platte.
- Lassen Sie Fliegen Embryonen/Eier auf den neuen Apfelsaft-Agarteller legen, 1 h bei 25 °C. Entsorgen Sie diese Platte nach der 1 h-Sammlung und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, um Embryonen zur Injektion zu sammeln.
- Um 17-Embryon im späten Stadium (20 bis 21 h AEL) zu sammeln, lassen Sie Fliegen des gewünschten Genotyps aus den Schritten 1.1.1-1.1.5 auf eine neue vorgewärmte Apfelsaft-Agarplatte mit einem kleinen Abstrich von Hefepaste bei 25 °C für 1 h legen. , so embryonen werden 20 bis 21 h alt zum Zeitpunkt der Bildgebung.
HINWEIS: Dieser Schritt kann wie gewünscht für mehrere Runden der Probenentnahme, Injektion und Bildgebung wiederholt werden. - Sammeln Sie Embryonen aus Platten zu einem Zellsieb mit 70 m Nylongewebe, indem Sie phosphatgepufferte Kochchen (PBS) mit 0,1% nichtionischem Tensid (PBTx; Tabelle 1) um die Oberfläche der Platte zu bedecken und Embryonen mit einem Pinsel von der Oberfläche zu lösen.
- Dechorionate Embryonen im Zellsieb in einer 50% Bleichlösung gesammelt (Tabelle 1) in einer 100 mm Petrischale für 5 min mit gelegentlicher Erregung bei Raumtemperatur. Spülen Sie Embryonen 3x, indem Sie das Zellsieb in PBTx in einer Petrischale wirbeln, wobei sie jedes Mal eine frische Schale PBTx verwenden.
- Wenn alle Embryonen vom richtigen Genotyp sind, fahren Sie direkt mit Schritt 1.1.10 fort. Wenn die Erzeugung von Embryonen des richtigen Genotyps ein Kreuz mit heterozygoten Fliegen erfordert, wählen Sie Embryonen des richtigen Genotyps unter Verwendung des Vorhandenseins oder Fehlens fluoreszierend markierter Balancer-Chromosomen aus. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit Fluoreszenzfunktionen für die Genotypauswahl.
HINWEIS: Balancer-Chromosomen, die mit deformiertem-gelbem fluoreszierendem Protein gekennzeichnet sind; Kruppel-Gal4,UAS-grünes fluoreszierendes Protein (GFP); und twist-Gal4, UAS-GFP funktionieren gut für die Genotyp-Auswahl in der späten Embryogenese (Tabelle 2)24,25,26. - Mit einer Glaspipette Embryonen in PBTx auf eine 2% Agarose-Gelplatte übertragen (Tabelle 1). Überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier entfernen. Richten Sie die Embryonen auf die 2% Agarose-Gelplatte mit hinterder nach rechts und dorsaler Seite nach oben aus (Abbildung 1B).
HINWEIS: Die Mikropyle, das kleine Loch, durch das Spermatozoen in das Ei gelangen, befindet sich am vorderen Ende des Embryos. Das hintere Ende ist runder. Die Luftröhre erscheint weiß und befindet sich dorsal im Embryo, so dass die Unterscheidung der dorsalen und ventralen Seiten des Embryos ermöglicht wird (Abbildung 1B). - Bereiten Sie eine Folie mit einem Stück doppelseitigem Klebeband vor. Drücken Sie die Folie fest auf die Embryonen, um sie auf das doppelseitige Band zu übertragen.
- Entibung von Embryonen durch Inkubation bei Raumtemperatur von 25 min (es wird kein Entsatikmittel verwendet). Nach der Austrocknung Embryonen mit Halocarbonöl bedecken.
HINWEIS: Die Austrocknungszeiten können je nach Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Belüftung im Raum variieren. Die Inkubationszeit sollte verwendet werden, um das Injektionsgerät und das konfokale Mikroskop für die Bildgebung einzurichten, wie in den Abschnitten 2 und 3 dieses Protokolls beschrieben.
- Verwenden Sie in jedem Embryo-Entnahmekäfig mindestens 50 jungfräuliche Weibchen mit 20 bis 25 Männchen für Sammlungen. Inkubieren Sie diese Fliegen in einer Flasche mit Maismehl-Agar-Lebensmittel (Tabelle der Materialien) für 1 bis 2 Tage vor Beginn der Sammlungen23.
- Larval-Sammlung
- Richten Sie ein Kreuz mit 5-10 jungfräulichen weiblichen Fliegen des gewünschten Genotyps und halb so vielen Männchen des gewünschten Genotyps in einer Durchstechflasche mit Maismehl-Agar-Nahrung ein und brüten bei 25 °C23.
- Nach 5 bis 7 Tagen, je nach Genotyp, wandernde dritte Instar Larven aus der Durchstechflasche sanft mit Zange sammeln. Spülen Sie Larven in 1x PBS, um Lebensmittel zu entfernen, die an den Larven kleben. Larven zur Genotypisierung, wie in Schritt 1.1.9 beschrieben, auf einen Apfelsaft-Agarteller übertragen.
- Rollen Sie Larven auf einem Gewebe mit einem Pinsel, um sie abzutrocknen. Übertragen Sie 6 x 8 Larven auf eine Folie, die mit doppelseitigem Klebeband mit Zangen vorbereitet wird.
2. Herstellung von Nadeln und Probeninjektion
- Ziehen Sie Nadeln auf einem Micropipette-Puller vor der Einführung dieses Protokolls. Kapillarrohre in den Nadelzieher sichern und nach der Standardnadelform und Parametern für D. melanogaster Injektionen ziehen (Tabelle 3)27. Bewahren Sie Nadeln in einer Petrischale auf, indem Sie sie in Ton verankern, bis sie zur Injektion verwendet werden.
- Laden Sie eine Nadel mit 5 l von 10 kDa dextran konjugiert zu Sulforhodamin 101 Säurechlorid(Materialtabelle) mit einer 20 L Gel-Ladepipettenspitze während der 25-min-Entweigungszeit für Embryonen (Schritt 1.1.12) oder unmittelbar nach der Übertragung von Larven zur Rutsche (Schritt 1.2.3).
- Laden Sie die Nadel in einen Nadelhalter und positionieren Sie sich in einem Mikromanipulator, der an einem Stahlsockel befestigt ist (Materialtabelle).
HINWEIS: Die Nadel sollte für die Embryoinjektion nahezu parallel zum Mikroskopstadium sein und für Larveninjektionen leicht nach unten gewinkelt sein. - Stellen Sie das Injektionsgerät (Materialtabelle) auf 50 psi, 5 x 10 ms mit einem Bereich von 10.
HINWEIS: Es kann notwendig sein, diese Einstellungen für das verwendete Injektionsgerät zu ändern. - Platzieren Sie die Folie auf der Bühne und bürsten Sie die Nadelkante gegen die Kante des doppelseitigen Bandes in einem 45°-Winkel, um eine abgewinkelte, gebrochene Spitze zu erstellen.
HINWEIS: Für Embryonen ist es nur notwendig, die Spitze so zu brechen, dass der Fluss der 10 kDa dextran möglich ist. Eine perfekte Nadel hat eine leicht abgewinkelte Spitze und nur ein kleiner Tropfen Farbstoff wird mit jeder Injektion herauskommen. Für Larven ist es notwendig, die Spitze mehr zu brechen, aber mit einer abgewinkelten Spitze, um die Larvenkörperwand zu durchdringen. Ein größerer Tropfen Farbstoff wird herauskommen. - Pumpen Sie das Fußpedal, bis sich der Farbstoff an der Spitze der Nadel befindet.
- Richten Sie die Nadel so aus, dass sie parallel zum Embryo ist oder leicht nach unten zur Larve abgewinkelt ist.
- Bewegen Sie die Nadel, um das hintere Ende der Probe zu durchstechen und injizieren Sie die Probe durch Pumpen des Fußpedals. Injizieren Sie 2 nL Farbstoff in Embryonen und 220 nL Farbstoff in Larven.
HINWEIS: Der Embryo oder die Larve sollte mit Farbstoff überfluten, wenn die Injektion erfolgreich ist. - Beachten Sie den Zeitpunkt der Injektion für Inkubationszwecke. Inkubieren Sie Embryonen für 10 min bei Raumtemperatur. Larven 30 min bei Raumtemperatur bebrüten.
- Fahren Sie auf der Folie fort, um zusätzliche Proben zu injizieren, wobei Sie die Injektionszeit für jede Probe notieren.
HINWEIS: Je nach Geschwindigkeit, mit der nachfolgende Sezier- und Bildgebungsschritte durchgeführt werden können, können 4-8 Proben gleichzeitig injiziert werden.
3. Vorbereitung von Proben für die Bildgebung
-
Bildgebung von Embryonen
- Bereiten Sie nach der Injektion Embryonen auf die Bildgebung vor. Tragen Sie Petroleumgelee mit einem baumwollgekippten Applikator auf der rechten und linken Seite der Proben auf der Rutsche als Abstandsraum auf, um Schäden an den Embryonen bei der Platzierung des Deckellipss zu verhindern.
- Bildproben mit einem konfokalen Mikroskop in der gesamten Tiefe des Embryos mit einem 20-fachen Objektiv. Berechnen Sie den Prozentsatz der Gesamtproben mit Farbstoff, der in der ventralen Nervenschnur (VNC) beobachtet wurde, mit der folgenden Gleichung: % der Proben mit kompromittiertem BBB = Anzahl der Proben mit Farbstoffakkumulation in der VNC/Gesamtanzahl der untersuchten Proben.
-
Zerlegung und Abbildung von Larven
- Bereiten Sie Folien für Larvenproben im Voraus vor. Montieren Sie zwei Abdeckungen, die etwa 0,5 cm voneinander entfernt sind, um die Rutsche mit Nagellack zu halten.
HINWEIS: Die Coverlips fungieren als Abstandshalter für das Gehirn, so dass es während des Montageprozesses nicht beschädigt wird. - Nach der 30 min Inkubation sezieren Sie die Larven in 1x PBS direkt auf dem Dia, das in der Bildgebung verwendet wird. Verwenden Sie zunächst ein Zangenpaar, um die Larve auf halbem Weg nach unten im Larvenkörper zu greifen, und verwenden Sie ein zweites Zangenpaar, um die vordere und die hintere Hälfte der Larve zu trennen.
- Als nächstes verwenden Sie ein Paar Zangen, um den vorderen Bereich an den Mundhaken zu greifen, und verwenden Sie ein zweites Zangenpaar, um die Körperwand über der Spitze der Zange umzukehren, die die Mundhaken packt. Das Gehirn und VNC werden exponiert.
- Trennen Sie das Gehirn und VNC von der Körperwand, indem Sie die Nerven trennen, und entfernen Sie die Körperwand von der Folie (Abbildung 1C,D). Entfernen Sie imaginäre Scheiben, falls gewünscht.
- Bedecken Sie die Probe mit 10 l 80 % Glycerin und legen Sie einen Deckelschlupf zur Bildgebung auf die Probe.
- Bild durch die Tiefe des Nervensystems Gewebe mit einem 20x Objektiv. Berechnen Sie den Prozentsatz der Gesamtproben mit Farbstoff, der im VNC beobachtet wurde.
- Bereiten Sie Folien für Larvenproben im Voraus vor. Montieren Sie zwei Abdeckungen, die etwa 0,5 cm voneinander entfernt sind, um die Rutsche mit Nagellack zu halten.
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Representative Results
Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die Visualisierung der Integrität des BBB im gesamten ZNS in D. melanogaster Embryonen und Larven (Abbildung 1). Nach Abschluss der BBB-Bildung in der späten Embryogenese funktioniert das BBB, um große Moleküle aus dem Gehirn und VNC5auszuschließen. Dieses Protokoll nutzt diese Funktion, um die BBB-Bildung zu assayen. Als Wildtyp (Oregon R) spätes Stadium 17 (20-21 h alt) Embryonen mit 10 kDa Dextran konjugiert zu Sulforhodamin 101 Säurechlorid fluoreszierenden Farbstoff injiziert wurden, wurde das große Dextranmolekül aus dem VNC ausgeschlossen, wie erwartet (Abbildung 2A). Um die Wirkung genetischer Mutationen auf die BBB-Integrität zu demonstrieren, wurden Embryonen mit Mutationen im Rohgen verwendet. Zuvor wurde gezeigt, dass das Rohegen die Retraktion des Keimbandes während der Embryogenese reguliert, und in jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass es in Glia funktioniert, um morphologische Veränderungen im VNC während der Entwicklung zu regulieren28. Heterozygote rohe1 mutierte Embryonen zeigten eine intakte BBB, ähnlich den Ergebnissen, die bei Wildtyp-Kontrollembryonen beobachtet wurden (Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu wiesen homozygote rohe1 mutierte Embryonen Defekte in der Integrität des BBB auf, wobei 10 kDa-Dextranfarbstoff in den VNC überschwappte, was darauf hindeutet, dass sich die BBB nicht bilden konnte (Abbildung 2C). Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit dieser Technik, die BBB-Bildung in embryonalen Stadien zu assayen.
Frühere Studien haben gezeigt, dass ein Defekt in der subperineurialen Gliapolyploidisierung zu einer Störung des BBB führt, die in dritten Insternlarvenstadien7,9beobachtet werden kann. So könnten Defekte bei der BBB-Bildung und/oder -wartung in späteren Entwicklungsstadien zu einer gefährdungen BBB führen, was es wünschenswert macht, die Integrität der Barriere im dritten Insternlarvenstadium zu untersuchen. Daher wurde das Protokoll, das für die Prüfung der BBB-Integrität in embryonalen Stadien verwendet wird, auch für den Einsatz in Larven optimiert. In Oregon R Kontrollproben, 10 kDa Dextran nicht in die BBB eindringen und ist aus dem Gehirn und VNC ausgeschlossen (Abbildung 2D,E). Der Farbstoff sammelt sich an der Peripherie des BBB an.
Abbildung 1: Das Nervensystem der Embryos im Stadium 17 und der dritten Insternlarve. (A) Schemat einer ventralen Ansicht eines embryonalen Zentralnervensystems (ZNS) im Stadium 17. Das ZNS besteht aus dem Gehirn (Br) und der ventralen Nervenschnur (VNC), die dorsoventrale Kanäle (ch) hat. Die Mikropyle (mp; Pfeilspitze) am vorderen Ende kann verwendet werden, um den Embryo zu orientieren. Hinter rechts. (B) Stadium 17 Embryo orientiert mit der rückenseitigen Seite nach oben und hinter rechts, wie in Schritt 1.1.10 empfohlen. Pfeile zeigen auf die Luftröhre. Pfeilspitze zeigt die mp. Hinter rechts. (C) Schematisches Nervensystem in der dritten Instarlarve. Das Gehirn (Br) und VNC bilden das ZNS, während die Nerven, die sich von der VNC-Synapse auf die Körperwandmuskulatur ausdehnen und Teil des PNS sind. Hinter rechts. (D) Seziert dritte instar Larvengehirn und VNC. Hinter rechts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Test für die Bildung der Blut- und Hirnschranke (BBB). (A-C) Spätstadium 17 Embryonen (20-21 h alt) nachträchsig mit 10 kDa Sulforhodamin 101 Säurechlorid dextran injiziert. Posterior nach unten. Skalenbalken = 20 m. Punkte, die in Kontrollen gesehen werden, sind dorsoventrale Kanäle, die die ventrale Nervenschnur (VNC) überspannen. (A) Oregon R-Steuerung. Farbaufnahme in 6,25% der Proben, n = 16. (B) roh1/+ Geschwister-Steuerelement. Farbaufnahme in 6,67% der Proben, n = 15. (C) Homozygot roh1/1 Mutant. Farbstoffaufnahme in 100% der Proben, n = 22. (D) Oregon R steuern dritte instar Larvengehirn. Farbstoff sammelt sich am BBB an, dringt aber nicht in das ZNS ein, n = 7. Skalenbalken = 50 m. (E) Oregon R Steuern dritte instar larval VNC. Farbstoff sammelt sich am BBB an, dringt aber nicht in das ZNS ein, n = 11. Die gestrichelte Linie umreißt den VNC. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Midgut-Morphologie in der späten embryonalen Entwicklung. Durchdeutes Lichtbilder von Embryon im Stadium 13 bis 17 ermöglichen die Visualisierung der Darmmorphologie (dunkelgraue Regionen in der hinteren Hälfte des Embryos). Midgut-Morphologie kann verwendet werden, um das Stadium der embryonalen Entwicklung zu bestimmen, was hilfreich ist, wenn bestimmt wird, ob Embryonen für eine Injektion entsprechend gereift werden. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| lösung | rezept |
| 2% Agarose Gel | 0,8 g Agarose zu 40 ml doppelt destilliertem H2O (ddH2O) in einen Erlenmeyerkolben und eine Mikrowelle geben, um Agar aufzulösen. Gießen Sie in ein Gelgusstablett und lassen Sie das Gel 30 min bei Raumtemperatur erstarren. |
| Apfelsaft Agar Teller | Messen Sie 45 g Agar und 1,5 l ddH2O in einen 4 L Kolben. Autoklav für 40 x 45 min bei 121 °C. 50 g Zucker und 0,5 l Apfelsaft in einen 1 L Becher rühren und bei niedriger Hitze (Einstellung 3) rühren, um Zucker aufzulösen, wobei darauf zu achten ist, ihn nicht zu verbrennen. Nach dem Autoklavieren den vorgewärmten Zucker und Apfelsaft in den Agar und das Wasser geben. Rühren Sie auf niedrig mit der Hitze aus, um abkühlen zu lassen, bis Sie es berühren können. 15 ml 70% Tegosept hinzufügen und zum Zerstreuen rühren. Gießen Sie in einen 0,5 L Becher. Sprühen Sie mit Ethanol, um Blasen oder Flammen mit einem Bunsenbrenner zu entfernen. In 60 mm Petrischalen gießen. Mindestens 24 h einstellen oder bis es eine minimale Kondensation auf den Deckeln der Petrischalen gibt und bei 4 °C lagern. |
| 50% Bleichmittel | 15 ml ddH2O und 15 ml Haushaltsbleichmittel in ein konisches Rohr geben. |
| 80% Glycerin | Für 10 ml 8 ml autoklaviertes ddH2O und 2 ml Glycerin zu einem 15 ml konischen Rohr hinzufügen. Inkubieren Sie auf einer Wippe, bis die Lösung homogen ist. |
| 1x PBS | Für 1 L 100 ml 10x PBS in 900 ml ddH2O verdünnen. |
| 10x PBS | Für 2 L folgendes in 1.600 ml ddH2O: 160 g NaCl, 4 g KCl, 28,8 g Na2HPO4und 4,8 g KH2PO4auflösen. PH mit HCl auf 7,5 einstellen. |
| PBTx (PBS + 0,1% nichtionisches Tensid) | Für 1 L 100 ml 10x PBS, 10 ml 10% nichtionisches Tensid und 890 ml ddH2O kombinieren. |
| 70% Tegosept | Mischen Sie 1 g p-Hydroxybenzoesäure, Methylester pro 10 ml 100% Ethanol. Bei -20 °C lagern. |
| 10% Nichtionisches Tensid | Für 50 ml 45 ml autoklaviertesddH 2O und 5 ml nichtionisches Tensid in ein konisches Rohr geben. Drehen Sie auf der Wippe, bis die Lösung homogen ist. |
| Hefepaste | Trockene aktive Hefe mit ddH2O in einem 50 ml Kunststoffbecher bis glatt mischen. |
Tabelle 1: Reagenzien und Puffer, die während dieses Protokolls verwendet werden.
| Genotyp | vorrat |
| w[1118]; ln(2LR)Gla, wg[Gla-1]/CyO, P'w[+mC]=GAL4-twi.G'2.2, P'w[+mC]=UAS-2xEGFP-AH2.2 | Bloomington #6662 |
| *]; sna[Sco]/CyO, P'w[+mC]=Dfd-EYFP'2 | Bloomington #8578 |
| *]; L[2] Pin[1]/CyO, P'w[+mC]=GAL4-Kr.C'DC3, P'w[+mC]=UAS=GFP. S65T-DC7 | Bloomington #5194 |
| Df(1)JA27/FM7c, P'w[+mC]=GAL4-Kr.C'DC1, P'w[+mC]=UAS-GFP. S65T-DC5, sn[+] | Bloomington #5193 |
| w[*]; ry[506] Dr[1]/TM6B, P'w[+mc]=Dfd-EYFP'3, Sb[1] Tb[1] ca[1] | Bloomington #8704 |
| y[1] w[*]; D[*] gl[3]/TM3, P'w[+mC]=GAL4-Kr.C'DC2, P'w[+mC]=UAS-GFP. S65T-DC10, Sb[1] | Bloomington #5195 |
| Oregon R | Mehrere Stämme verfügbar |
| raw[1] cn[1] bw[1] sp[1]/CyO | Bloomington #2749 |
| P-w[+mW.hs]=GawB-elav[C155] | Bloomington #458 |
| w[1118]; P-w[+m*]=GAL4-Repo/TM3, Sb[1] | Bloomington #7415 |
| P-UAS-GFP | Mehrere Stämme verfügbar |
Tabelle 2: Fliegenstämme. Fliegenstämme, die in diesem Protokoll diskutiert werden. Die Bloomington Drosophila Stock Center Aktiennummer wird ggf. zur Verfügung gestellt.
| radeln | hitze | ziehen | geschwindigkeit | zeit | druck | rampe |
| 1 | 590 | 115 | 15 | 250 | 600 | X |
| 2 | 575 | 130 | 60 | 250 | 600 | X |
Tabelle 3: Micropipette Puller Einstellungen. Micropipette Puller-Einstellungen verwendet, um Nadeln für die Injektion in diesem Protokoll zu generieren.
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Discussion
Dieses Protokoll enthält eine umfassende Beschreibung der Schritte, die erforderlich sind, um die BBB-Integrität während der späten embryonalen und dritten instar larvalen Stadien der D. melanogaster Entwicklung zu assay. Ähnliche Ansätze wurden an anderer Stelle beschrieben, um die Integrität des BBB während der Entwicklung sowie in erwachsenen Stadien5,7,29,30zu bewerten. Die Beschreibungen der Verfahren in Material- und Methodenabschnitten sind jedoch oft breit angelegt und verfügen nicht über ausreichende Details für eine einfache Implementierung, was eine erhebliche Fehlerbehebung im Namen des Forschers erforderlich macht. Dieses Protokoll enthält eine umfassende Beschreibung der Schritte, die erforderlich sind, um die BBB-Integrität in embryonalen und Larvenstadien zu erhalten. In jeder Phase müssen entscheidende Schritte unternommen werden, um sicherzustellen, dass das richtige Entwicklungsstadium untersucht wird und die Gewebearchitektur nicht gestört wird, was die BBB gefährden könnte. Um bei diesen Ansätzen erfolgreich zu sein, mussten mehrere Schritte des Protokolls behoben werden, um genaue Ergebnisse zu liefern. Kritische Schritte in den embryonalen und Larvenprotokollen werden unten beschrieben.
Frühere Studien haben die Gründung der BBB durch 18,5 h AEL5berichtet. Um ein genaues Entwicklungstiming zu gewährleisten, ist es wichtig, Proben während der Alterung bei konstanter Temperatur zu halten. Beim Sammeln von Embryonen sollten Apfelsaft-Agarplatten vor der Entnahme auf 25 °C gebracht werden. Die Verwendung von Apfelsaftplatten, die nicht vorgewärmt wurden, führt zu einer langsameren Entwicklung und kann Proben ergeben, die noch keine BBB etabliert haben und daher eine Ansammlung von 10 kDa Dextran im Nervensystem aufweisen würden. Daher ist es wichtig, dass man Proben injiziert, die älter als 18,5 h sind. Darüber hinaus ist es bei der Durchführung dieser Experimente an Embryonen notwendig, die Möglichkeit einer Entwicklungsverzögerung in Betracht zu ziehen, da eine solche Verzögerung einfach zu spätere Gründung der BBB. Um mögliche Entwicklungsverzögerungen zu berücksichtigen, wurden die Proben bei 20-21 h AEL, etwas nach der gemeldeten BBB-Bildung, untersucht. Die Verwendung der Morphologie anderer Gewebe, insbesondere des sich entwickelnden Mittelguts, kann dazu beitragen, das richtige Entwicklungsstadium des zu assayenden Embryos zu ermitteln (Abbildung 3). Umgekehrt kann unsachgemäßes experimentelles Timing zu Proben führen, die bereits motil sind und den Schraffurprozess begonnen haben. Um die Anzahl der Larven zu reduzieren, die bereits mit dem Schlüpfen begonnen haben, ist es wichtig, mindestens zwei 1-h-Sammlungen durchzuführen, um ältere Embryonen von Weibchen zu entfernen, bevor Embryonen zur Injektion gesammelt werden. Wenn eine Analyse des BBB in den ersten Instar-Larven gewünscht wird, kann eine kurze Inkubation von Larven in 1x PBS in einer 9-Well-Schale auf Eis verwendet werden, um die Beweglichkeit vor der Injektion zu reduzieren. Rutschen können auch während des Injektionsvorgangs auf einer Eispackung gehalten werden, um die Beweglichkeit zu reduzieren.
Um qualitativ hochwertige Bilder und genaue Ergebnisse in Bezug auf die Etablierung des BBB im Embryo zu gewährleisten, müssen während des gesamten Verfahrens zusätzliche Schritte sorgfältig befolgt werden. Beim Aufstellen von Embryonen auf der Agarplatte sollte die Luftröhre nach oben gerichtet sein, da dies die dorsale Seite des Embryos ist (Abbildung 1B). Wenn die Embryonen mit dem doppelseitigen Band auf das Dia übertragen werden, wird die ventrale Seite des Embryos nach oben gerichtet, was eine optimale Visualisierung der Nervenschnur während der konfokalen Bildgebung später im Protokoll ermöglicht. Embryonen müssen auch sicher am doppelseitigen Band haften, um die Bewegung während der Injektion zu hemmen. Die Verwendung eines flachen 2% Agarose-Pads ermöglicht es dem Forscher, den Schlitten mit dem doppelseitigen Klebeband während des Transferprozesses fest auf die Embryonen zu schieben, ohne Gefahr einer Schädigung der Embryonen zu haben. Nach der Übertragung auf den Schlitten ist eine Austrocknung erforderlich, um zu verhindern, dass der Embryo bei der Farbinjektion platzt. Die Injektion von zu viel Farbstoff kann auch dazu führen, dass der Embryo platzt. Es ist wichtig, die Nadel nur in den Embryo genug einzufügen, um den Farbstoff zu injizieren, aber nicht so sehr, dass die Nadel potenziell das Nervensystem durchbohrt, was ein falsch positives Ergebnis ergeben würde. Eine zu große Stichwunde kann auch dazu führen, dass hämische und farbstoffe Ausflutungen aus dem Embryo entstehen, was zu einem fehlgeschlagenen Experiment führt. Mit diesen potenziellen Fallstricken im Hinterkopf ist die Injektion am erfolgreichsten mit einer Nadel, die einen leichten Winkel zur Spitze hat, so dass es einen kleinen Punkt gibt, mit dem der Embryo sorgfältig durchbohrt werden kann.
Bei der Prüfung von Larven für die BBB-Integrität können Herausforderungen aufgrund der Beweglichkeit der Probe auftreten. Die Verwendung von hochwertigem doppelseitigem Klebeband ist entscheidend, da es bei der Immobilisierung von Larven zur Injektion wirksam sein sollte. Wenn die Larve sich löst, kann sie auf dem Band zurückgerollt und sanft nach unten gedrückt werden, um sie wieder zu sichern. Beim Transport von Larven zur Injektion ist es hilfreich, die Rutsche in einer Petrischale zu tragen, falls die Larven sich verkleben. Die Schritte nach der Injektion erfordern die größte Sorgfalt, um Störungen der BBB zu vermeiden. Um mögliche Schäden an der Probe zu minimieren, ist es am einfachsten, die Probe direkt auf den Dias zu sezieren, die für die Bildgebung verwendet werden. Wenn die Larve beim Übertragen der Probe zur Zerlegung stark am Band haftet, kann dem Band ein Tropfen von 1x PBS hinzugefügt werden, um die Haftung zu lösen und eine Übertragung auf das Dia zur Zerlegung zu ermöglichen. Nach der Zerlegung ist es wichtig, die Probe ausreichend zu verflachen, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden, aber nicht so sehr, dass die Probenintegrität beeinträchtigt wird. Das Sandwichen der Larve zwischen dem Deckelund dem Dia mit zusätzlichen Coverlips, da Abstandshalter verhindern, dass das Gehirn beschädigt wird, aber die Probe für eine effektive Bildgebung immobilisiert.
Um mit Protokollen für Embryonen und Larven erfolgreich zu sein, ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Injektionsgerät und das konfokale Mikroskop vor Beginn der Probenverarbeitung aufgestellt werden. Dies ermöglicht ein genaues Timing bei der Abbildung von Proben, das für den Probenvergleich erforderlich ist. Andere Ansätze haben fortschrittlichere Injektions-Setups verwendet, die ein invertiertes Mikroskop für die Embryoinjektion erfordern. Dieses Protokoll verwendet ein Standard-Sezieren-Mikroskop und Mikromanipulator mit einem Druckregler. In diesem Fall wurde eine Zebrafischinjektion einfach für die Injektion von Fliegenembryonen und Larven angepasst. Dieses Protokoll könnte weiter vereinfacht werden, um auch einen Mikromanipulator mit einer Spritze zur Injektion zu verwenden. Viele dieser Tools sind in den Biologieabteilungen leicht verfügbar und können sogar in Denlaborumgebungen im Klassenzimmer verfügbar sein, was eine maximale Einfache Protokollimplementierung ermöglicht.
Während des bildgebenden Verfahrens kann es hilfreich sein, die Zellen des Nervensystems zu beschriften, um den gewünschten Bereich für die Bildgebung leichter zu identifizieren. Insbesondere könnte man das GAL4/UAS-System verwenden, um GFP entweder in Neuronen oder Glia auszudrücken, mit den elav-Gal4 bzw. repo-Gal4 Stämmen bzw. (Tabelle 2)31,32,33. Eine solche Kennzeichnung würde einen Kontrast zu dem Sulforhodamin 101 Säurechlorid Dextran bieten, um die Integrität des Nervensystems zu visualisieren.
Während diese Methode auf die Prüfung der Integrität der BBB während der Entwicklung von D. melanogasterkonzentriert ist, könnte dieser Ansatz angepasst werden, um die Integrität anderer Barrieren über eine Vielzahl von Organismen und Geweben zu untersuchen. Zum Beispiel wurden ähnliche Protokolle für die Assaying der BBB in Mäusen 34veröffentlicht. Darüber hinaus nutzen die Durchlässigkeit der Blut-Augen-Barriere und die somatische Barriere um die Keimzellen während der Spermatogenese bei D. melanogaster einen ähnlichen Ansatz29,35. Das Protokoll könnte auch für den Einsatz in anderen Geweben angepasst werden, um die Durchlässigkeit zu testen, auch im Darm. Bei der Anpassung dieses Protokolls für die Verwendung in anderen Geweben oder Arten wird es notwendig sein, die Größe der Moleküle zu berücksichtigen, die die Barriere durchdringen können, da es möglich ist, dass 10 kDa Dextran klein genug sein kann, um einige Barrieren zu durchdringen. Insgesamt bietet dieses Protokoll ein Schritt-für-Schritt-Verfahren, um die BBB-Integrität während der D. melanogaster Entwicklung zu überprüfen, die leicht für den Einsatz in anderen Umgebungen angepasst werden kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. F. Bryan Pickett und Dr. Rodney Dale für die Verwendung von Injektionsgeräten. Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder von der Loyola University Chicago an M.D., D.T. und J.J. finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
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