Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60233
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Loyola University Chicago

Summary

שלמות מכשול הדם במוח. היא קריטית לתפקוד מערכת העצבים בדרוזופילה מלאנוסטר, מכשול המוח בדם נוצר על ידי תאי גלאל במהלך הembryogenesis המאוחרות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיפול בתפקוד ותחזוקה של מחסומי מוח בדם בד. מלאנוגסטר עוברים והזחלים השלישי.

Abstract

התפתחות מערכת העצבים הנכונה כוללת את היווצרות מכשול הדם-מוח, מכשול הדיפוזיה המסדיר את הגישה למערכת העצבים ומגן על רקמת העצבים מפני רעלים ופתוגנים. פגמים בהיווצרות מכשול זה היו מתואמים neuropathies, ואת התמוטטות של מכשול זה נצפתה במחלות ניווניות רבות. לכן, חיוני לזהות את הגנים המסדירים את היווצרות והאחזקה של מחסום הדם-מוח כדי לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות. כדי להבין את התפקידים המדויקים גנים אלה לשחק בהתפתחות העצבית, יש צורך לעבד את ההשפעות של ביטוי גנים שונה על השלמות של מכשול המוח בדם. רבים מהמולקולות הפועלות בהקמת המכשול ממוח הדם נמצאו להיות שמרו על פני מינים איקריוטית, כולל זבוב הפירות, drosophila ילה מלאנוגסטר. זבובי פירות הוכחו כמערכת מודל מצוינת לבדיקת המנגנונים המולקולריים המסדירים פיתוח ותפקוד של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר הליך צעד-אחר-צעד לצורך שלמות מכשול המוח בדם במהלך השלבים העובריים והזחל של ד. מלאנוגסטר פיתוח.

Introduction

במהלך הפיתוח, תקשורת תא תא ואינטראקציות הן קריטיות להקמת מבנה רקמות ואיברים ותפקוד. במקרים מסוימים, אינטראקציות תא תא אלה ממקכבות איברים מהסביבה הסובבת כדי להבטיח את תפקוד האיברים התקין. זהו המקרה של מערכת העצבים, אשר מבודדת על ידי מכשול הדם-מוח (BBB). תפקוד של BBB בבני אדם נקשר הפרעות נוירולוגיות כולל אפילפסיה, ואת התמוטטות של המכשול נצפתה מחלות נוירוניווניות כולל טרשת נפוצה amyotrophic לרוחב1. ב יונקים, bbb נוצר על ידי הצמתים הדוקים בין תאים אנדותל2,3. בעלי חיים אחרים, כולל זבוב הפירות, דרוזופילה מלאנוסטר, יש bbb מורכב מתאי גלאל. אלה תאים גליה טופס מכשול חדיר סלקטיבי לשלוט בתנועה של חומרים מזינים, פסולת מוצרים, רעלים, ומולקולות גדולות לתוך ומתוך מערכת העצבים4. הדבר מאפשר שמירה על מעבר אלקטרוכימי הנחוץ לירי בפוטנציאל הפעולה המאפשר ניידות ותיאום4. ב D. melanogaster, the glia להגן על מערכת העצבים מן האשלגן עשיר, כמו דם המוליקמ5.

במערכת העצבים המרכזית (cn) ומערכת העצבים ההיקפית (היקפית) של D. melanogaster, שתי שכבות גליה החיצוני, את subperineurial glia ואת perineurial glia, כמו גם רשת חיצונית של מטריצה החילוץ, הנוירולה העצבי, הטופס המוליקמ-המוח המוליש-מחסום העצב6, המכונה bbb לאורך מאמר זה. במהלך פיתוח subperineurial glia להיות פוליפואיד ולהגדיל כדי להקיף את מערכת העצבים5,6,7,8,9,10,11 . הצמתים subperineurial glia טופס septate, אשר מספקים את מכשול הדיפוזיה העיקרי בין המוליקמ ומערכת העצבים5,6,12. הצמתים הללו דומים מאוד לצמתים בעלי החוליות הדומות, שנמצאו בפרפודות של המייאלוציה של גליה, והוא מבצע את אותו התפקיד כצמתים הדוקים ב-bbb של יונקים13,14, מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , 17. perineurial glia הפער, לגדול, ולעטוף סביב subperineurial glia כדי לווסת את הדיפוזיה של מטבוליטים ומולקולות גדולות6,10,18,19. היווצרות bbb הושלם על ידי 18.5 h לאחר הנחת ביצה (ח) ב -25 ° c5,8. מחקרים קודמים זיהו גנים כי הם הרגולטורים קריטיים של היווצרות bbb20,21,22. כדי להבין טוב יותר את התפקידים המדויקים של גנים אלה, חשוב לבחון את ההשפעה של מוטציה של הרגולטורים הפוטנציאליים האלה על שלמות BBB. בעוד שמחקרים קודמים מתארים גישות למתן שלמות bbb בעוברים ובזחלים, פרוטוקול מקיף לצורך שיטת מחקר זו טרם תואר5,7. פרוטוקול זה, שלב אחר שלב, מתאר שיטות לגבי שלמות BBB במהלך שלבי הזחל העובריים והשלישי של מלאנוגסטר .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. אוסף דגימות

  1. אוסף עובר
    1. בכל כלוב של אוסף העובר, השתמש במינימום של 50 נקבות בתולה עם 20-25 זכרים לגבייה. מודיית אלה זבובים בבקבוק עם אוכל תירס-אגר מזון (שולחן חומרים) עבור 1 על 2 ימים לפני תחילת אוספים23.
      הערה: ניתן להשתמש בזבובים נוספים, אך יש לשמור על היחס הנשי לזכר ב-2:1.
    2. לוחות תפוח מחמם לחות (שולחן 1) ב -25 ° c ללילה.
      הערה: זה נדרש עבור ההיערכות הנכונה של עוברים. אם הצלחות מתייבשות במהירות, הוסיפו קערה עם מים לחממה כדי להגביר את הלחות של החדר.
    3. מעבר בין שלב 1.1.1 באמצעות CO2 והעברת זבובים לכלוב הגבייה. מניחים לפני מחמם מיץ תפוחים צלחת אגר עם מכתם קטן של שמרים להדביק על הקצה הפתוח בטוח לכלוב עם השרוול האדום (לוח חומרים). כדי לנקות עוברים מבוגרים, לאפשר זבובים להטיל העוברים/ביצים על צלחת התפוח אגר הלוח עבור 1 h ב 25 ° c.
    4. הסר את כלוב הגבייה מהאינקובטור. להפוך את הכלוב שינוי בצד למטה ולהקיש זבובים למטה לתחתית הכלוב. החלף את מיץ התפוחים אגר עם צלחת חדשה לקדם חמם תפוח לוחית עם מכתם קטן של שמרים להדביק. . להשליך את הצלחת הראשונה
    5. אפשר זבובים להטיל העוברים/ביצים על הצלחת החדש של מיץ התפוח אגר עבור 1 h ב 25 ° c. למחוק את הצלחת הבאה בעקבות אוסף 1 h ולהמשיך לשלב הבא כדי לאסוף עוברים להזרקה.
    6. כדי לאסוף את השלב המאוחר 17 עוברי (20-21 h), לאפשר זבובים של גנוטיפ הרצוי משלבים 1.1.1-1.1.5 לשכב על מחמם חדש מחומם תפוח לוחות עם מכתם קטן של שמרים להדביק ב 25 ° צ' עבור 1 h. צלחת גיל עבור 19 h ב חממה 25 ° c , כך שעוברים יהיו 20 עד 21 מגיל בזמן ההדמיה.
      הערה: ניתן לחזור על שלב זה בהתאם לצורך עבור סיבובים מרובים של איסוף, הזרקה והדמיה של דוגמה.
    7. לאסוף את העוברים מן הצלחות לתוך מסננת תא 70 עם רשת PBTx יקרומטר ניילון על ידי הוספת מלוחים מואגור פוספט (PBS) עם 0.1% nonionic חומרים (; שולחן 1) לכסות את פני הצלחת ולשחרר את העוברים מהמשטח באמצעות מברשת צבע.
    8. עוברים deכורonate שנאספו בתוך מסננת התא בתמיסה 50% אקונומיקה (טבלה 1) בצלחת פטרי 100 מ"מ עבור 5 דקות עם עצבנות מדי פעם בטמפרטורת החדר. לשטוף את העוברים 3x על ידי מתערבל תא מסננת ב PBTx בצלחת פטרי, באמצעות מאכל טרי של PBTx בכל פעם.
    9. אם כל העוברים הם מסוג גנוטיפ הנכון, המשיכו ישירות לשלב 1.1.10. אם הדור של העוברים של גנוטיפ נכון דורש צלב עם זבובים heterozygous, לבחור עוברים של גנוטיפ נכון באמצעות נוכחות או העדר של כרומוזומים מאזן המסומנים באור פלואורוסקופים. השתמש בstereomicroscope עם יכולות פלורסנט עבור בחירת גנוטיפ.
      הערה: כרומוזומים מאזן המסומנים עם חלבון פלורסנט מעוות-צהוב; קרופל-Gal4, חלבון פלורסנט ירוק (gfp); טוויסט-Gal4, uas-gfp לעבוד היטב עבור בחירת גנוטיפ ב מאוחר embryogenesis (שולחן 2)24,25,26.
    10. באמצעות פיפטה זכוכית, העברת עוברים ב PBTx 2% agarose לוח ג'ל (שולחן 1). הסר את הנוזל העודף באמצעות נייר סינון. יישר ~ 6-8 עוברים על הלוח השני% ג'ל עם האחוריים לימין והצד האחורי כלפי מעלה (איור 1B).
      הערה: המיקרופייל, החור הקטן שדרכו נכנסים אל הביצה, ממוקם בקצה הקדמי של העובר. . הקצה האחורי מעוגל יותר קנה הנשימה נראה לבן והוא ממוקם בתוך העובר, ומאפשר את ההבחנה של הצדדים הגדודים של העובר (איור 1ב).
    11. הכן שקופית עם חתיכה אחת של קלטת דו-צידית. לחץ בחוזקה על השקופית מעל העוברים כדי להעבירם לקלטת הדו.
    12. התייבשות עוברים על ידי דגירה בטמפרטורת החדר עבור ~ 25 דקות (לא התייבשות משמש). , בעקבות התייבשות. מכסים עוברים עם שמן הלוקרבון
      הערה: תקופות התייבשות עשויות להשתנות בהתאם לטמפרטורה, ללחות ולאוורור בחדר. תקופת הדגירה צריכה לשמש כדי להגדיר את המנגנון להזרקה ואת המיקרוסקופ קונפוקלית וקד לדימות, כפי שמתואר בסעיפים 2 ו 3 של פרוטוקול זה.
  2. אוסף זחל
    1. להקים צלב עם 5-10 בתולה זבובים נקבה של גנוטיפ הרצוי וחצי כמו זכרים רבים של גנוטיפ הרצוי בבקבוקון עם אוכל תירס-אגר מזון ו דגירה ב 25 ° c23.
    2. לאחר 5 שבעה ימים, בהתאם גנוטיפ, לאסוף הזחלים הנודדים השלישי מתוך הבקבוקון בעדינות עם מלקחיים. לשטוף את הזחלים ב-1x PBS כדי להסיר את המזון נדבק הזחלים. העברת הזחלים לצלחת מיץ תפוחים אגר עבור גנוטיפים כמתואר בשלב 1.1.9 במידת הצורך.
    3. מגלגלים זחלים על רקמה באמצעות מברשת צבע כדי לייבש אותם. העבר 6-8 הזחלים לשקופית שהוכנו על ידי קלטת דו צדדית באמצעות מלקחיים.

2. הכנת מחטים והזרקת דגימה

  1. משוך מחטים על פולר מיקרופיפטה לפני החניכה של פרוטוקול זה. מאובטח צינורות קפילר לתוך המחט משוך על פי הצורה המחט הסטנדרטית פרמטרים עבור D. מלאנוגסטר זריקות (שולחן 3)27. לאחסן מחטים בצלחת פטרי על ידי עיגון חימר עד השימוש להזרקה.
  2. טען מחט עם 5 μl של 10 kda תוספי מצומנת sulforhodamine 101 חומצה כלוריד (טבלה של חומרים) באמצעות 20 μl ג'ל טעינת הצנרת במהלך תקופת התייבשות 25 דקות לעוברים (שלב 1.1.12), או מיד לאחר העברת זחלים לשקופית (שלב 1.2.3).
  3. לטעון את המחט לתוך מחזיק מחט ומיקום במיקרומניפולציה מאובטח לבסיס פלדה (טבלת חומרים).
    הערה: המחט צריכה להיות כמעט מקבילה לשלב המיקרוסקופ להזרקת העובר ובזווית מעט כלפי מטה לזריקות זחל.
  4. הגדר את מנגנון ההזרקה (לוח חומרים) עד 50 psi, 5-10-ms עם מגוון של 10.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות הגדרות אלה עבור מנגנון ההזרקה המסוים הנמצא בשימוש.
  5. הנח את השקופית על הבמה ועל קצה המברשת של המחט כנגד קצה הקלטת הכפולה בזווית 45 ° כדי ליצור קצה שבור ובזווית.
    הערה: עבור עוברים יש צורך רק לשבור את הטיפ מספיק כדי לאפשר זרימה של 10 kDa dextran. מחט מושלמת יש טיפ בזווית מעט ורק טיפה קטנה של צבע תצא עם כל זריקה. עבור הזחלים, יש צורך לשבור את הטיפ יותר, אבל עם קצה בזווית לחדור את קיר הזחל הגוף. . טיפה גדולה יותר של צבע תצא החוצה
  6. משאבה דוושת הרגל עד הצבע הוא בקצה המחט.
  7. יישר את המחט כך שהוא יהיה מקביל עם העובר או זוויתי מעט למטה לעבר הזחל.
  8. להעביר את המחט לנקב את הקצה האחורי של הדגימה ולהזריק את הדגימה על ידי שאיבת דוושת הרגל. הזרק ~ 2 nL של צבע לעוברים, ו ~ 220 nL של צבע לתוך הזחלים.
    הערה: העובר או הזחל צריך להציף בצבע אם הזריקה מוצלחת.
  9. שימו לב לזמן ההזרקה למטרות דגירה. העוברים הדגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. . בטמפרטורת החדר
  10. המשך בשקופית כדי להזריק דגימות נוספות, וציין את זמן ההזרקה עבור כל אחד מהדגימות.
    הערה: בהתאם למהירות שבה ניתן לבצע את שלבי הניתוח וההדמיה הבאים, יש להזריק 4/8 דגימות בכל פעם.

3. הכנת דגימות להדמיה

  1. הדמיה של עוברים
    1. לאחר ההזרקה, הכינו עוברים להדמיה. להחיל ג'לי נפט עם המוליך כותנה משופעת על צד ימין ושמאל של דגימות על השקופית כמו מרווח כדי למנוע נזק לעוברים בעת הצבת שמיכות.
    2. דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לאורך כל עומק העובר עם מטרה 20x. לחשב את אחוז הדגמים הכולל עם צבע נצפתה בחוט העצב הגחוני (VNC) באמצעות המשוואה הבאה:% של דגימות עם BBB נפרץ = מספר דגימות עם הצטברות צבע של VNC/מספר כולל של דגימות.
  2. חיתוך והדמיה של הזחלים
    1. הכן שקופיות לדגימות. זחל לפני הזמן הר שני שמיכות במרווחים כ 0.5 ס מ מלבד השקופית עם לק ציפורניים.
      הערה: הכיסויים מתפקדים כרווחים עבור המוח, כך שהוא לא ניזוק במהלך תהליך ההרכבה.
    2. בעקבות הדגירה של 30 דקות, מנתחים את הזחלים ב-1x PBS ישירות על השקופית שישמשו בהדמיה. ראשית, השתמש זוג אחד של מלקחיים כדי לתפוס את הזחל במחצית הגוף זחל, ולהשתמש זוג שני של מלקחיים כדי להפריד את החצאים הקדמי והאחורי של הזחל.
    3. הבא, להשתמש בזוג אחד של מלקחיים כדי לתפוס את האזור הקדמי של ווים בפה, ולהשתמש זוג שני של מלקחיים כדי להפוך את קיר הגוף על קצה של הלקחיים מרתק את הפה ווים. המוח ו VNC יהיה חשוף.
    4. הפרד את המוח ואת VNC מן הקיר הגוף על ידי ניתוק העצבים, ולהסיר את קיר הגוף מהשקופית (איור 1ג, ד). הסרת דיסקי imaginal במידת הצורך.
    5. לכסות את המדגם עם 10 μL של 80% גליצרול ומניחים שמיכות על גבי המדגם עבור הדמיה.
    6. תמונה דרך עומק רקמת מערכת העצבים באמצעות מטרה 20x. לחשב את אחוז הדגימות הכולל עם צבע נצפתה ב VNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השיטות המתוארות כאן מאפשרות הדמיה של שלמות BBB ברחבי ה-CN ב D. מלאנוגסטר עוברים וזחלים (איור 1). עם השלמת היווצרות BBB בסוף embryogenesis, פונקציות BBB להוציא מולקולות גדולות מהמוח ו VNC5. פרוטוקול זה מנצל פונקציה זו כדי לאשר את היווצרות BBB. כאשר פראי סוג (אורגון R) בשלב מאוחר 17 (20-21 h הישן) העוברים הוזרקו עם 10 kda תוספי מצופני sulforhodamine 101 חומצה כלוריד פלורסנט, המולקולה תוספי גדול נשלל מן VNC, כצפוי (איור 2א). כדי להדגים את ההשפעה של מוטציות גנטיות על שלמות BBB, עוברים עם מוטציות בגנים raw היו שימוש. בעבר, הגן raw הוכח לווסת את הנסיגה להקות נבט במהלך embryogenesis, ולאחרונה הוכח לתפקד גליה להסדיר שינויים מורפולוגיים ב VNC במהלך פיתוח28. Heterozygous raw1 עוברים מוטציה הציגו bbb שלם, בדומה לתוצאות שנצפו העוברים בקרה פראי (איור 2ב). לעומת זאת, homozygous raw1 עוברים מוטנטים הציגו פגמים ביושרה של bbb, עם ההצפה של 10 kda תוספי לתוך VNC, המציין כי bbb נכשל טופס (איור 2ג). תוצאות אלה מציגות את היכולת של טכניקה זו לאשר את היווצרות BBB בשלבים עובריים.

מחקרים קודמים הוכיחו כי פגם subperineurial glia פוליפולוזציה התוצאות בשיבוש bbb כי ניתן לצפות בשלב השלישי זחל שלבים7,9. כך, פגמים במערך BBB ו/או תחזוקה עלול לגרום BBB פרוצים במהלך שלבים מאוחרים יותר של פיתוח, מה שהופך אותו רצוי שיטת השלמות של המכשול בשלב הזחל השלישי. לכן, הפרוטוקול המשמש לאמירת שלמות BBB בשלבים עובריים היה גם אופטימיזציה לשימוש הזחלים. בשנת אורגון R דגימות בקרה, 10 דקדה דקסטר נכשל לחדור BBB והוא נשלל מהמוח ו VNC (איור 2D, E). הצבע מצטבר בפריפריה של BBB.

Figure 1
איור 1: מערכת העצבים של עוברי שלב 17 וזחל שלישי. (א) סכימטי של ראיה מגעלת של שלב 17 מערכת העצבים המרכזית העובריים (cn). מערכת ה-CN מורכבת מהמוח (Br) ומכבל העצבים הגחוני (VNC), אשר הינו מורכב מצינורות (ch). מיקרופייל (mp; ראש חץ) בקצה הקדמי ניתן להשתמש כדי לכוון את העובר. . אחוריים לימין (ב) שלב 17 העובר מונחה עם הצד האחורי למעלה ואחורה ימינה, כפי שמומלץ בשלב 1.1.10. חיצים מצביעים על קנה הנשימה. ראש חץ מציין את ה-mp. . אחוריים לימין (ג) סכמטי של מערכת העצבים בזחל השלישי. המוח (Br) ו VNC להלחין את ה-CN, בעוד העצבים הארכת הסינפסה של VNC על שרירי הקיר הגוף הם חלק היקפית. . אחוריים לימין (ד) גזור שלישי זחל המוח ו VNC. . אחוריים לימין אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שיטת היווצרות מחסום הדם-מוח (BBB). (א-ג) שלב מאוחר 17 עוברים (20-21 h) הזריקו לפוס1 עם 10 kDa sulforhodamine 101 חומצה כלוריד דקטרן. . אחורי למטה סרגל קנה מידה = 20 μm. הנקודות לראות בקרים הם הערוצים הגסולונגדורי כי לאורך כבל העצב הגחוני (VNC). (A) בקרתאורגון R. ספיגת צבען ב 6.25% של דגימות, n = 16. (ב) בקרת אחים גולמיים1/+ . ספיגת צבע ב 6.67% של דגימות, n = 15. (ג) Homozygous raw1/1 החשבונאי. ספיגת צבע ב 100% של דגימות, n = 22. (ד) אורגון R הבקרה השלישית הגוף זחל המוח. צבען מצטבר ב BBB, אבל לא לחדור לתוך ה-CN, n = 7. סרגל קנה מידה = 50 μm. (E) אורגון R הבקרה השלישית שליטה הזחל VNC. צבען מצטבר ב BBB, אבל לא לחדור לתוך ה-CN, n = 11. קו מקווקו מתווה את הVNC. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מורפולוגיה של מידות בהתפתחות עובריים מאוחרת. תמונות אור משודרות של שלב 13-17-.17 עוברים מאפשרים הדמיה של מורפולוגיה של המעיים (אזורים אפורים כהים במחצית האחורי של העובר). ניתן להשתמש במבנה המיורפולוגיה כדי לקבוע את שלב ההתפתחות העובריים, שהיא מועילה כאשר בקביעה אם עוברים מיושנים כראוי להזרקה. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פתרון תכון
2% צמח ג'ל הוסף 0.8 g של agarose ל 40 מ ל כפול מזוקקים H2O (ddH2O) בבקבוקון Erlenmeyer ומיקרוגל כדי לפזר אגר. יוצקים לתוך מגש הליהוק ג'ל ולאפשר לג לגבש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לוחות מיץ תפוחים אגר מדידה 45 g של אגר ו 1.5 L של ddH2O לתוך בקבוקון 4 L. אוטוקלב במשך 40-45 דקות ב 121 ° c. למדוד 50 g של סוכר ו 0.5 L של מיץ תפוחים לתוך גביע 1 L ומערבבים על חום נמוך (הגדרה 3) כדי לפזר סוכר, מטפלת לא לשרוף אותו. בעקבות אוטוקלינג, להוסיף סוכר מחומם מראש ומיץ תפוחים אל אגר ומים. מערבבים נמוך עם החום לאפשר להתקרר עד שאתה יכול לגעת בו. הוסף 15 מ ל של 70% tegosept ומערבבים להתפזר. שופכים לתוך גביע של 0.5 ליטר. תרסיס עם אתנול להסיר בועות או להבה עם מבער באנסן. יוצקים לתוך 60 מנות פטרי. אפשר לקבוע לפחות 24 שעות, או עד שיהיה עיבוי מינימלי על מכסים של מנות פטרי ולאחסן ב -4 ° c.
50% אקונומיקה הוסיפו 15 מ ל שלמלבין ביתי לצינור חרוט.
80% גליצרול עבור 10 מ"ל, להוסיף 8 מ ל של בלוקddh 2 O ו 2 מל של גליצרול ל 15 מ"ל צינור חרוט. דגירה על הנדנדה עד הפתרון הוא הומוגנית.
1x PBS עבור 1 L, לדלל 100 mL של 10x PBS ב 900 mL של ddH2O.
10x PBS עבור 2 L, לפזר את הבאים ב 1,600 mL של ddH2O: 160 g של הנרוג, 4 גרם של kcl, 28.8 g של Na2hpo4, ו 4.8 g של KH2פו4. התאם את ה-pH ל 7.5 עם HCl.
PBTx (PBS + 0.1% nonionic) עבור 1 L, לשלב 100 mL של 10x PBS, 10 מ ל 10% nonionic שתיל, ו 890 mL של ddH2O.
70% טגוספט מערבבים 1 גר' חומצה p-הידרוקסימית, מתיל אסתר עבור כל 10 מ"ל של 100% אתנול. חנות ב-20 ° c.
10% הפוניים עבור 50 ml, להוסיף 45 ml של בלוק ddh2O ו 5 מ ל של nonionic החומרים לצינור חרוט. לסובב על הנדנדה עד הפתרון הוא הומוגנית.
ממרח שמרים מערבבים שמרים פעילים יבשים עם ddH2O בגביע פלסטיק 50 mL עד חלקה.

טבלה 1: ריאגנטים ומאגרים המשמשים לאורך פרוטוקול זה.

גנוטיפ לאי
w [1118]; בתוך (2LR) גלה, wg [גלה-1]/cyo, P {w [+ mC] = GAL4-twi. G} 2.2, P {w [+ mC] = מוכן-2xEGFP} AH 2.2 בלומינגטון #6662
w {*]; sna [Sco]/cyo, P {w [+ mC] = Dfd-EYFP} 2 בלומינגטון #8578
w {*]; L [2] פינים [1]/cyo, P {w [+ mC] = GAL4-Kr. C} DC3, P {w [+ mC] = UAS = GFP. S65T}DC7 בלומינגטון #5194
Df (1) JA27/FM7c, P {w [+ mC] = GAL4-Kr. C} DC1, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC5, sn [+] בלומינגטון #5193
w [*]; ry [506] Dr [1]/tm6b, P {w [+ mc] = Dfd-EYFP} 3, Sb [1] Tb [1] ca [1] בלומינגטון #8704
y [1] w [*]; D [*] gl [3]/TM3, P {w [+ mC] = GAL4-Kr. C} DC2, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC10, Sb [1] בלומינגטון #5195
אורגון ר זנים מרובים זמינים
raw [1] cn [1] bw [1] sp [1]/cyo בלומינגטון #2749
P {w [+ mW. hs] = מטומb} elav [C155] בלומינגטון #458
w [1118]; P {w [+ m *] = GAL4} repo/TM3, Sb [1] בלומינגטון #7415
P {UAS-GFP} זנים מרובים זמינים

שולחן 2: זנים לטוס. לטוס זנים שנדונו במהלך פרוטוקול זה. מספר המניות של מרכז בלומינגטון דרוזוהילה מסופק במידת הצורך.

חזור חום משוך מהירות זמן לחץ רמפה
1 590 115 15 250 600 X
2 575 130 60 250 600 X

שולחן 3: הגדרות פולר מיקרופיפטה. הגדרות פולר מיקרופיפטה ששימשו להפקת מחטים להזרקה בפרוטוקול זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מספק תיאור מקיף של השלבים הדרושים לטיפול בשלמות BBB במהלך שלבי הזחל המאוחרים והשלישי של התפתחות D. מלאנוגסטר . גישות דומות תוארו במקום אחר כדי לקיים את שלמות bbb במהלך הפיתוח, כמו גם למבוגרים בשלבים5,7,29,30. עם זאת, תיאורים של הליכים בחומרים ובסעיפים לעתים קרובות רחבים בטבע וחסרים מספיק פרטים לצורך ביצוע קל, המחייב פתרון בעיות משמעותי מטעם החוקר. פרוטוקול זה מספק תיאור מקיף של השלבים הדרושים לטיפול בשלמות BBB במהלך שלבים עובריים ושלבי זחל. בכל שלב, ישנם צעדים קריטיים כדי להבטיח כי השלב הנכון של הפיתוח הוא נבדק וארכיטקטורת רקמות אינו משתבש, אשר עלול לסכן את BBB. על מנת להשיג הצלחה בגישות אלה היה צורך לפתור בעיות מרובות של הפרוטוקול כדי להניב תוצאות מדויקות. שלבים קריטיים בפרוטוקולי העובריים והזחל מתוארים להלן.

מחקרים קודמים דיווחו על הקמת BBB על ידי 18.5 h ח. ד.5. כדי להבטיח תזמון התפתחותי מדויק, חשוב לשמור על הדגימות בטמפרטורה קבועה בזמן ההזדקנות. בעת איסוף עוברים, מיץ תפוחים אגר לוחות יש להביא 25 ° צ' לפני השימוש עבור איסוף. שימוש בצלחות מיץ תפוחים כי לא היו מחומם מראש תוצאות בפיתוח איטי יכול להניב דגימות שעדיין לא הקימו bbb ולכן מוצג הצטברות של 10 kda תוספי במערכת העצבים. ככזה, חשוב לוודא כי אחד הוא הזרקת דגימות שגילם עולה על 18.5 h. בנוסף, בעת ביצוע ניסויים אלה בעוברים, יש צורך לשקול את האפשרות של עיכוב התפתחותי, כי עיכוב כזה יכול פשוט לגרום הקמתה המאוחרת של BBB. כדי להתחשב בעיכובים התפתחותיים פוטנציאליים, הדגמים התייצבו ב -20 ל -21 יו, מעט אחרי היווצרות BBB. באמצעות מורפולוגיה של רקמות אחרות, במיוחד באמצע המעיים, יכול לסייע בהקמת השלב הנכון של התפתחות העובר להיות החוצה (איור 3). לעומת זאת, תזמון ניסיוני לא תקין יכול לגרום לדגימות שכבר מורצפת והחלו בתהליך הבקיעה. כדי להקטין את מספר הזחלים שכבר התחילו בקיעה, חשוב לבצע מינימום של שני אוספים h 1 כדי לנקות עוברים מבוגרים מנקבות לפני איסוף העוברים להזרקה. אם הניתוח של BBB בזחלים הראשונים הוא הרצוי, דגירה קצרה של הזחלים ב-1x PBS בצלחת 9-טוב על הקרח ניתן להשתמש כדי להפחית תנועתיות לפני ההזרקה. ניתן לשמור שקופיות גם על חבילת קרח במהלך הליך ההזרקה כדי להפחית את התנועתיות.

על מנת להבטיח תמונות איכותיות ותוצאות מדויקות לגבי הקמת BBB בעובר, יש לעקוב בזהירות אחר צעדים נוספים במהלך התהליך. כאשר מפנים את העוברים על הלוח אגר, קנה הנשימה צריך להיות פונה כלפי מעלה, כמו זה הצד השני של העובר (איור 1B). כאשר העוברים מועברים לשקופית עם הקלטת הכפולה, הצד הגחוני של העובר יהיה כשפניו כלפי מעלה, ויאפשר הדמיה אופטימלית של חוט העצב במהלך הדמיה ממוחשבת בהמשך הפרוטוקול. על העוברים להיות גם מחוברים באופן מאובטח לקלטת הדו כדי לעכב את התנועה במהלך ההזרקה. השימוש בלוח שטוח באורך 2% מאפשר לחוקר לדחוף את השקופית עם הקלטת הדו-צדדית בחוזקה על העוברים במהלך תהליך ההעברה ללא סיכון לפגיעה בעוברים. לאחר העברה לשקופית, התייבשות נחוצה כדי למנוע מהעובר להתפרץ על הזרקת הצבע. הזרקה של צבע יותר מדי יכול גם לגרום העובר להתפוצץ. חשוב רק להכניס את המחט לתוך העובר מספיק כדי להזריק את הצבע, אבל לא עד כדי כך את המחט עלולה לחדור את מערכת העצבים, אשר ייתן תוצאה חיובית כוזבת. גדול מדי של פצע ניקוב יכול גם לגרום המוליש וצבע ההצפה מתוך העובר, המוביל לניסוי כושל. עם אלה מלכודות פוטנציאליות בראש, הזרקה היא המוצלחת ביותר עם מחט כי יש זווית קלה לקצה, כך יש נקודה קטנה שבה כדי לנקב בזהירות את העובר.

במקרה של הזחלים הרימות עבור שלמות BBB, אתגרים יכולים לנבוע בשל תנועתיות המדגם. השימוש בקלטת כפולה באיכות גבוהה הוא קריטי, מאחר שהוא צריך להיות יעיל בהזרקות זחלים להזרקה. אם הזחל הופך להיות לא תקוע, זה יכול להיות מתגלגל חזרה על הקלטת ודחף בעדינות מטה כדי לאבטח אותו מחדש. כאשר מעבירים את הזחלים להזרקה, מומלץ לשאת את השקופית בצלחת פטרי למקרה שהזחלים יהפכו לבלתי תקועים. הצעדים הבאים ההזרקה דורשים את הטיפול הטוב ביותר כדי למנוע הפרעה של BBB. על מנת למזער את הנזק הפוטנציאלי למדגם, קל יותר לנתח את המדגם ישירות על השקופיות שישמשו לדימות. אם הזחל מחזק את הקלטת כאשר מעבירים את הדגימה לניתוח, ניתן להוסיף ירידה של 1x PBS לקלטת כדי לשחרר את ההדבקה ולאפשר העברה לשקופית לצורך ניתוח. לאחר הניתוח, חשוב לשטח את המדגם מספיק כדי למנוע תוצאות חיוביות שווא, אבל לא כל כך הרבה שלמות המדגם הוא נפרץ. Sandwiching את הזחל בין שמיכות לבין השקופית באמצעות שמיכות נוספות כמו מרווחים מונע נזק למוח, עדיין משתק את המדגם עבור הדמיה יעילה.

על מנת להשיג הצלחה עם פרוטוקולים עבור שני עוברים וזחלים, זה קריטי כדי לוודא את מכשיר ההזרקה ומיקרוסקופ קונפוקלית וקד מוגדרים לפני עיבוד לדוגמה מתחיל. זה מאפשר תזמון מדויק של הדמיה של דגימות, אשר נדרש לצורך השוואת המדגם. גישות אחרות מנוצל יותר מערכת הזרקת קופצים מתקדמים, המחייב מיקרוסקופ הפוך להגדיר להזרקה העובר. פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ מנתח סטנדרטי ובמיקרומניפולציה עם וסת לחץ. במקרה זה, הזרקת דג מוגדר להגדיר היה פשוט מותאם להזרקה של עוברי הזבוב והזחלים. פרוטוקול זה יכול להיות פשוט יותר כדי להשתמש במיקרומניפולציה עם מזרק גם להזרקה. רבים מכלים אלה זמינים במחלקות הביולוגיה, וייתכן אפילו שיהיו זמינים במסגרות מעבדה לכיתות, המאפשרות להקל המקסימלי של יישום הפרוטוקול.

במהלך תהליך ההדמיה, זה יכול להיות מועיל כדי לתייג את התאים של מערכת העצבים כדי לזהות בקלות רבה יותר את האזור הרצוי עבור הדמיה. במיוחד, אחד יכול להשתמש GAL4/uas מערכת כדי לבטא gfp בנוירונים או glia, באמצעות elav-GAL4 או repo-GAL4 הזנים, בהתאמה (שולחן 2)31,32,33. תיוג כזה יספק ניגוד עם sulforhodamine 101 חומצה כלוריד תוספי כדי להמחיש את השלמות של מערכת העצבים.

בעוד שיטה זו מתמקדת על השלמות של BBB במהלך הפיתוח של D. melanogaster, גישה זו יכולה להיות מותאמת כדי לבחון את היושרה של מחסומים אחרים על פני מגוון של אורגניזמים ורקמות. לדוגמה, פרוטוקולים דומים פורסמו עבור לומר BBB בעכברים34. בנוסף, החדירות של מחסום עין הדם והמכשול הסומטיים סביב תאי הנבט במהלך הזרע בשנת D. מלאנוגסטר משתמשים בגישה דומה29,35. הפרוטוקול יכול גם להיות מותאם לשימוש ברקמות אחרות כדי לבדוק חדירות, כולל במעי. בעת התאמת פרוטוקול זה לשימוש ברקמות או מינים אחרים, יהיה צורך לשקול את הגודל של מולקולות שיכולות לחדור את המכשול, כפי שניתן לראות כי 10 המכונה תוספי עשוי להיות קטן מספיק כדי לחלחל כמה מחסומים. באופן כללי, פרוטוקול זה מספק הליך צעד-אחר-צעד לטיפול בתקינות BBB במהלך הפיתוח של D. melanogaster שניתן להתאים בקלות לשימוש בהגדרות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים לד ר פ. בריאן פיקט וד ר רודני דייל לשימוש בציוד להזרקה. עבודה זו ממומנת על ידי מימון מחקר מאוניברסיטת לויולה שיקגו ל-md, D.T., ו-ג'יג'י

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran ThermoFisher Scientific D1863 Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips Eppendorf 22351656
100% Ethanol (200 proof) Pharmco-Aaper 11000200
Active Dry Yeast Red Star
Agar Fisher Scientific BP1423
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Air Compressor DeWalt D55140
Apple Juice Mott's Natural Apple Juice
Bleach Household Bleach 1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Bottle Plugs Fisher Scientific AS-277
Cell Strainers BD Falcon 352350
Confocal Microscope Olympus FV1000 Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator Puritan 19-062614
Double-Sided Tape 1/2" Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip Roboz RS-5015
Fly Food Bottles Fisher Scientific AS-355
Fly Food Vials Fisher Scientific AS-515
Foot Pedal Treadlite II T-91-S
Gel Caster Bio-Rad 1704422
Gel Tray Bio-Rad 1704436
Glass Pipette VWR 14673-010
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Granulated sugar Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil Lab Scientific, Inc. FLY-7000
Light Source Schott Ace I
Manipulator Stand World Precision Instruments M10
Micromanipulator World Precision Instruments KITE-R
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Needle Holder World Precision Instruments MPH310
Nightsea Filter Sets Electron Microscopy Science SFA-LFS-CY For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head Electron Microscopy Science SFA-RB For visualization of GFP
Paintbrush Simply Simmons Chisel Blender #6
Pipetter Fisher Scientific 13-683C
Pneumatic Pump World Precision Instruments PV830 This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Small Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-100
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Steel Base Plate World Precision Instruments 5052
Stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000 Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source Baytronix Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) Genesee Scientific 20-258
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 Nonionic surfactant
Vial Plugs Fisher Scientific AS-273

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  2. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  3. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
  4. Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
  5. Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
  6. Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
  7. Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
  8. Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
  9. Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
  10. von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
  11. Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
  12. Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
  13. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  14. Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
  15. Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
  16. Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
  17. Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
  18. von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
  19. Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
  20. Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
  21. Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
  22. DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
  23. BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
  24. Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
  25. Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
  26. Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
  27. Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
  28. Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
  29. Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
  30. Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
  31. Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
  32. Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
  33. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  34. Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
  35. Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 151 דרוזופילה מלאנוגסטר מחסום דם-מוח גליה מערכת עצבים כבל עצבי הגחוני עובר זחל
שיטת שלמות המוח בדם <em>בדרוזופילה מלאנוסטר</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J.… More

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233, doi:10.3791/60233 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter