Summary
Kan-beyin bariyerbütünlüğü sinir sistemi fonksiyonu için çok önemlidir. Drosophila melanogasterolarak, kan-beyin bariyeri geç embriyogenez sırasında glial hücreler tarafından oluşur. Bu protokol, D. melanogaster embriyolarında ve üçüncü instar larvalarında kan-beyin bariyeri oluşumu ve bakımı için taht yöntemlerini açıklamaktadır.
Abstract
Uygun sinir sistemi gelişimi kan-beyin bariyerinin oluşumunu içerir, sıkı sinir sistemine erişimi düzenleyen ve toksinler ve patojenlerden nöral doku korur difüzyon bariyeri. Bu bariyerin oluşumundaki bozukluklar nöropatilerle ilişkilendirilmiştir ve bu bariyerin bozulması birçok nörodejeneratif hastalıkta gözlenmiştir. Bu nedenle, potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için kan-beyin bariyerinin oluşumunu ve bakımını düzenleyen genlerin belirlenmesi önemlidir. Bu genlerin nöral gelişimde tam rollerini anlamak için, değişmiş gen ekspresyonunun kan-beyin bariyerinin bütünlüğü üzerindeki etkilerini tetkik etmek gerekir. Kan-beyin bariyerinin kurulmasında işlev moleküllerin çoğu ökaryotik türler arasında korunmuş olduğu bulunmuştur, meyve sinek de dahil olmak üzere, Drosophila melanogaster. Meyve sinekleri sinir sistemi gelişimi ve işlevini düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için mükemmel bir model sistemi olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, D. melanogaster gelişiminin embriyonik ve larva evrelerinde kan-beyin bariyerinin bütünlüğünü test etmek için adım adım bir prosedürü tanımlar.
Introduction
Gelişim sırasında hücre-hücre iletişimi ve etkileşimleri doku ve organ yapısı nın ve fonksiyonunun kurulması açısından kritik öneme sahiptir. Bazı durumlarda, bu hücre-hücre etkileşimleri uygun organ fonksiyonu sağlamak için çevreden organları mühür. Bu kan-beyin bariyeri (BBB) tarafından izole edilir sinir sistemi için durumdur. İnsanlarda BBB disfonksiyonu epilepsi de dahil olmak üzere nörolojik bozukluklar ile bağlantılı olmuştur, ve bariyerin arıza multipl skleroz ve amiyotrofik lateral skleroz dahil nörodejeneratif hastalıklarda gözlenmiştir1. Memelilerde, BBB endotel hücreleri arasında sıkı kavşaklar oluşur2,3. Meyve sineği Drosophila melanogaster de dahil olmak üzere diğer hayvanlar, glial hücrelerden oluşan bir BBB var. Bu glial hücreler besin, atık ürünler, toksinler ve sinir sistemi içine ve dışında büyük moleküllerin hareketini kontrol etmek için seçici geçirgen bir bariyer oluşturur4. Bu hareketlilik ve koordinasyon için izin, yangın eylem potansiyelleri için gerekli elektrokimyasal degrade bakım sağlar4. D. melanogaster, glia potasyum açısından zengin, kan gibi hemolenf5sinir sistemini korumak .
Merkezi sinir sistemi (CNS) ve periferik sinir sistemi (PNS) D. melanogaster, iki dış glial tabakalar, subperineurial glia ve perineurial glia, yanı sıra ekstrasellüler matriks bir dış ağ, nöral lamella, formu hemolenf-beyin ve hemolenf-sinir bariyeri6, Bu makale boyunca BBB olarak anılacaktır. Geliştirme subperineurial glia poliploid olur ve sinir sistemi5çevreleyen büyütmek 5,6,7,8,9,10,11 . Subperineurial glia form septate kavşaklar, hemolenf ve sinir sistemi arasında ana difüzyon bariyersağlamak5,6,12. Bu kavşaklar moleküler olarak omurgalılarda miyelinating glia paranodlarında bulunan septate benzeri kavşaklar benzer, ve memelilerin BBB sıkı kavşaklar olarak aynı işlevi gerçekleştirmek13,14, 15.000 , 16.02.20 , 17. Perineurial glia bölmek, büyümek, ve metabolitleri ve büyük moleküllerin difüzyon düzenlemek için subperineurial glia etrafında sarın6,10,18,19. BBB oluşumu 25 °C5,8'deyumurtlama (AEL) sonrası 18,5 saat tamamlanır. Önceki çalışmalarda BBBoluşumununkritik düzenleyicileri olan genler tespit 20,21,22. Bu genlerin tam rollerini daha iyi anlamak için, bu potansiyel düzenleyicilerin mutasyonunun BBB bütünlüğü üzerindeki etkisini incelemek önemlidir. Önceki çalışmalarda embriyo ve larvalarda BBB bütünlüğünü nitelemek için yaklaşımlar özetlenen olsa da, bu test için kapsamlı bir protokol henüz tarif edilmemiştir5,7. Bu adım adım protokol, D. melanogaster embriyonik ve üçüncü instar larva aşamalarında BBB bütünlüğünü nitretetmek için yöntemleri açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Örneklerin Toplanması
- Embriyo koleksiyonu
- Her embriyo toplama kafesinde, koleksiyonlar için 20−25 erkek ile en az 50 bakire dişi kullanın. Bu sinekleri, toplamaya başlamadan önce 1−2 gün boyunca mısır unu-agar gıdası(Malzeme Tablosu)ile bir şişede kuluçkaya yatırın23.
NOT: Daha fazla sinek kullanılabilir, ancak kadın-erkek oranı 2:1 tutulmalıdır. - Önceden ısıtılmış elma suyu agar tabakları(Tablo 1) 25 °C gecede.
NOT: Bu embriyoların uygun evreleme için gereklidir. Plakalar hızlı bir şekilde kuruyorsa, odanın nemini artırmak için kuvöze su içeren bir kase ekleyin. - Anesthetize co2 ile adım 1.1.1 uçar ve bir toplama kafesi sinekler aktarır. Açık ucunda maya ezmesi küçük bir yayma ile önceden ısıtılmış elma suyu agar plaka yerleştirin ve kırmızı kollu kafese güvenli(Malzeme Tablosu). Eski embriyoları temizlemek için, sineklerin 25 °C'de 1 saat boyunca elma suyu agar tabağına embriyo/yumurta bırakmasına izin verin.
- Toplama kafesini kuvözden çıkarın. Kafes kafes tarafı aşağı ters ve dokunun kafesin altına aşağı uçar. Maya hamuru küçük bir yayma ile yeni bir önceden ısıtılmış elma suyu agar plaka ile elma suyu agar değiştirin. İlk tabağı atın.
- 25 °C'de 1 saat boyunca yeni elma suyu agar plakaüzerinde embriyo/yumurta bıraksın. 1 saat toplama aşağıdaki bu plaka atın ve enjeksiyon için embriyotoplamak için bir sonraki adıma geçin.
- Geç evre 17 embriyo (20−21 h AEL) toplamak için, 1.1.1−1.1.1.5 adımlarından istenilen genotip sineklerinin, 25 °C'de 25 °C'de küçük bir maya hamuru ile önceden ısıtılmış elma suyu agar tabaklarına serpmelerine izin verin. , bu yüzden embriyolar görüntüleme sırasında yaş 20−21 saat olacak.
NOT: Bu adım, numune toplama, enjeksiyon ve görüntüleme birden fazla tur için ististendiği gibi tekrarlanabilir. - % 0.1 niyonik yüzey aktif madde (PBTx) ile fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek 70 μm naylon örgü ile bir hücre süzgeci içine plakalar embriyoları toplamak; Tablo 1) plaka yüzeyini kaplar ve bir boya fırçası kullanarak yüzeyden embriyoları gevşetin.
- Hücre süzgecinde toplanan dekorionate embriyolar 100 mm Petri kabında %50 çamaşır suyu çözeltisi(Tablo 1)oda sıcaklığında ara sıra ajitasyon ile 5 dakika boyunca toplanır. Bir Petri kabında PBTx hücre süzgeci girdap tarafından 3x durulayın embriyolar, PBTx taze bir tabak her zaman kullanarak.
- Tüm embriyolar doğru genotip ise, doğrudan adım 1.1.10'a geçin. Doğru genotip embriyoların üretimi heterozigot sineklerle bir haç gerektiriyorsa, floresan olarak işaretlenmiş dengeleyici kromozomların varlığını veya yokluğunu kullanarak doğru genotipin embriyolarını seçin. Genotip seçimi için floresan yetenekleri olan bir stereomikroskop kullanın.
NOT: Deforme-sarı floresan protein ile işaretlenmiş dengeleyici kromozomlar; Kruppel-Gal4, UAS-yeşil floresan protein (GFP); ve büküm-Gal4, UAS-GFP geç embriyogenezde genotip seçimi için iyi çalışır (Tablo 2)24,25,26. - Cam pipet kullanarak, PBTx'teki embriyoları %2 agarose jel levhaya aktarın(Tablo 1). Fazla sıvıyı filtre kağıdıyla çıkarın. %2'lik agarose jel levhaüzerinde ~6−8 embriyoları sağ ve sırt tarafı yukarı bakacak şekilde hizala(Şekil 1B).
NOT: Mikropyle, spermatozoa yumurta girmek küçük delik, embriyonun ön ucunda yer almaktadır. Arka uç daha yuvarlak. Trakea beyaz görünür ve embriyo dorsal ve embriyonun ventral yanlarının ayrımını sağlayan dorsally bulunur (Şekil 1B). - Tek parça çift taraflı bantiçeren bir slayt hazırlayın. Çift taraflı banta aktarmak için embriyoların üstüne slayt sıkıca basın.
- ~25 dakika oda sıcaklığında kuluçka ile embriyoları desiccate (hiçbir kurutucu kullanılır). Desiccation sonra, halokarbon yağı ile embriyolar kapağı.
NOT: Kurutma süreleri odadaki sıcaklık, nem ve havalandırmaya bağlı olarak değişebilir. Bu protokolün 2 ve 3.
- Her embriyo toplama kafesinde, koleksiyonlar için 20−25 erkek ile en az 50 bakire dişi kullanın. Bu sinekleri, toplamaya başlamadan önce 1−2 gün boyunca mısır unu-agar gıdası(Malzeme Tablosu)ile bir şişede kuluçkaya yatırın23.
- Larva koleksiyonu
- İstenilen genotip 5−10 bakire dişi sinek ve mısır unu-agar gıda ve kuluçka ile bir şişe istenilen genotip yarısı kadar erkek 25 °C23bir haç kurmak .
- 5−7 gün sonra, genotip bağlı olarak, pİşplerle yavaşça şişeden dolaşan üçüncü yıldız larvalarını toplayın. Larvalara yapışmış yiyecekleri çıkarmak için 1x PBS'de larvaları durula. Gerekirse adım 1.1.9 açıklandığı gibi genotipleme için bir elma suyu agar plaka larvaları aktarın.
- Onları kurutmak için bir boya fırçası kullanarak bir doku üzerinde larva rulo. 6−8 larvayı, forceps kullanarak çift taraflı bantla hazırlanan bir slayta aktarın.
2. İğne Lerin Hazırlanması ve Numune Enjeksiyonu
- Bu protokolün başlatılmasından önce bir mikropipet çekmece üzerinde iğne çekin. İğne çekmecesine güvenli kılcal tüpler ve D. melanogaster enjeksiyonları için standart iğne şekli ve parametrelerine göre çekin (Tablo 3)27. İğneleri iğne için kullanılana kadar kilde demirleyerek petri kabında saklayın.
- Embriyolar için 25 dakikalık kurutma süresi boyunca 20 μL jel yükleme pipet ucu (1.1.12. adım) kullanılarak sülforodamine(Tablo)konjuge 10 kDa dekstran 5 μL'lik bir iğne yükleyin veya slayta larva (adım 1.2.3).
- İğneyi bir iğne tutucuya yükleyin ve çelik bir taban(Malzeme Tablosu)için sabitlenmiş bir mikromanipülatörde konumlandırın.
NOT: İğne embriyo enjeksiyonu için mikroskop aşamasına neredeyse paralel olmalı ve larva enjeksiyonları için biraz aşağı doğru açılı olmalıdır. - Enjeksiyon cihazını(Malzeme Tablosu)50 psi, 5−10 ms ve 10 ms'e ayarlayın.
NOT: Kullanılan enjeksiyon cihazı için bu ayarların değiştirilmesi gerekebilir. - Açılı, kırık bir uç oluşturmak için kaydırağı sahneye ve fırça kenarına çift taraflı bandın kenarına 45° açıyla yerleştirin.
NOT: Embriyolar için sadece 10 kDa dextran akışı için izin vermek için yeterli ucu kırmak için gereklidir. Mükemmel bir iğne biraz açılı ucu vardır ve boya sadece küçük bir damla her enjeksiyon ile çıkacaktır. Larvalar için, ucu daha fazla kırmak için gereklidir, ancak larva gövde duvarına nüfuz etmek için açılı bir ucu ile. Daha büyük bir boya damlası çıkacak. - Boya iğnenin ucunda olana kadar ayak pedalını pompalayın.
- İğneyi embriyoya paralel olacak şekilde hizala veya larvaya doğru hafifçe aşağı doğru açılı.
- İğneyi numunenin arka ucunu delmek için hareket ettirin ve ayak pedalını pompalayarak numuneye enjekte edin. Embriyolara ~2 nL boya ve larvalara ~220 nL boya enjekte edin.
NOT: Enjeksiyon başarılı olursa embriyo veya larva boya ile sel gerekir. - Kuluçka amacıyla enjeksiyon zamanına dikkat edin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka embriyoları. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuluçka larvaları.
- Her numune için enjeksiyon süresini belirterek ek numuneler enjekte etmek için slayttan aşağı doğru devam edin.
NOT: Sonraki diseksiyon ve görüntüleme adımlarının gerçekleştirilebildiği hıza bağlı olarak, bir seferde 4−8 numune enjekte edilebilir.
3. Görüntüleme Örneklerinin Hazırlanması
-
Embriyoların görüntülenmesi
- Enjeksiyondan sonra, embriyoları görüntüleme için hazırlayın. Kapak kayması yerleştirildikten sonra embriyoların zarar görmesini önlemek için slayttaki numunelerin sağ ve sol taraflarına pamuk uçlu aplikatör ile petrol jölesi uygulayın.
- 20x hedefi ile embriyo derinliği boyunca bir konfokal mikroskop kullanarak görüntü örnekleri. Ventral sinir kordonunda (VNC) gözlenen toplam örneklerin yüzdesini aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplayın: BBB tehlikeye sapmış örneklerin % 'i = VNC/toplam test numune sayının boya birikimi olan numune lerin sayısı.
-
Larvaların diseksiyonu ve görüntülemesi
- Larva örnekleri için slaytları önceden hazırlayın. Mount iki kapak lar yaklaşık 0,5 cm arayla oje ile slayt aralıklı.
NOT: Kapaklar beyin için spacer olarak işlev, bu yüzden montaj işlemi sırasında zarar görmez. - 30 dk kuluçkadan sonra, görüntülemede kullanılacak slaytın üzerine 1x PBS'de larvaları inceleyin. İlk olarak, larvayı yarıya indirmek için bir çift forceps kullanın ve larvanın ön ve arka yarısını ayırmak için ikinci bir çift forceps kullanın.
- Daha sonra, ağız kancalarında ön bölgeyi kavramak için bir çift forceps kullanın ve ağız kancalarını sürükleyen terplerin ucu üzerinde vücut duvarını tersine çevirmek için ikinci bir çift forceps kullanın. Beyin ve VNC açığa çıkacak.
- Sinirleri keserek beyin ve VNC'yi vücut duvarından ayırın ve vücut duvarını slayttan çıkarın (Şekil 1C,D). İstenirseniz hayali diskleri çıkarın.
- Numunenin üzerini %80 gliserol ile kaplayın ve görüntüleme için numunenin üzerine bir kapak kayması yerleştirin.
- 20x hedefi kullanarak sinir sistemi dokusunun derinliği ile Görüntü. VNC'de gözlenen boya ile toplam örneklerin yüzdesini hesaplayın.
- Larva örnekleri için slaytları önceden hazırlayın. Mount iki kapak lar yaklaşık 0,5 cm arayla oje ile slayt aralıklı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan yöntemler, D. melanogaster embriyoları ve larvalarında CNS boyunca BBB'nin bütünlüğünün görselleştirilmesine olanak sağlar (Şekil 1). Geç embriyogenezde BBB oluşumunun tamamlanmasından sonra, BBB fonksiyonları beyin ve VNC5büyük molekülleri dışlamak için . Bu protokol BBB oluşumunu test etmek için bu işlevden yararlanır. Yabani tip (Oregon R) geç evre 17 (20−21 saat eski) embriyolara sulforhodamine 101 asit klorür floresan boyaya konjuge 10 kDa dekstran enjekte edildiğinde, büyük dekstran molekülü beklendiği gibi VNC'den dışlandı (Şekil 2A). Genetik mutasyonların BBB bütünlüğü üzerindeki etkisini göstermek için ham genmutasyonu olan embriyolar kullanılmıştır. Daha önce, ham gen embriyogenez sırasında mikrop bandı retraksiyondüzenleyen gösterilmiştir, ve daha yakın zamanda geliştirme sırasında VNC morfolojik değişiklikleri düzenlemek için glia fonksiyonu gösterilmiştir28. Heterozigot ham1 mutant embriyolar, yabani tip kontrol embriyolarında gözlenen sonuçlara benzer şekilde sağlam bir BBB sergilediler (Şekil 2B). Buna karşılık, homozigot ham1 mutant embriyolar BBB bütünlüğü kusurları sergiledi, 10 kDa dextran boya VNC içine sel ile, BBB oluşturmak için başarısız olduğunu gösteren (Şekil 2C). Bu sonuçlar bu tekniğin embriyonik evrelerde BBB oluşumunu test etme yeteneğini göstermektedir.
Önceki çalışmalar, subperineurial glia poliploidizasyon bir kusur üçüncü instar larva aşamalarında görülebilir BBB bir bozulma yada sonuç olduğunu göstermiştir7,9. Böylece, BBB oluşumu ve/veya bakımındaki kusurlar, gelişimin sonraki aşamalarında BBB'nin tehlikeye girmelerine neden olabilir, bu da üçüncü instar larva aşamasında bariyerin bütünlüğünü nisbeten istinat etmeyi arzu eder. Bu nedenle, embriyonik evrelerde BBB bütünlüğünün belirtilmesinde kullanılan protokol larvalarda kullanılmak üzere optimize edilmiştir. Oregon R kontrol örneklerinde, 10 kDa dextran BBB nüfuz başarısız ve beyin ve VNC hariç tutulur (Şekil 2D,E). Boya BBB çevresinde birikir.
Şekil 1: Evre 17 embriyoların sinir sistemi ve üçüncü instar larvası. (A) Evre 17 embriyonik merkezi sinir sisteminin (CNS) ventral görünümü şeması. CNS beyin (Br) ve ventral sinir kordonu (VNC), dorsoventral kanalları (ch) vardır oluşur. Mikropyle (mp; ok başı) ön uçta embriyo yönlendirmek için kullanılabilir. Arkadan sağa. (B) Evre 17 embriyo yukarı ve sağ arka ile odaklı, adım 1.1.10 tavsiye edilir. Oklar nefes borusunu gösteriyor. Ok ucu mp gösterir. Arkadan sağa. (C) Üçüncü instar larvasında sinir sisteminin şeması. Beyin (Br) ve VNC CNS oluşturmak, sinirler Vücut duvar kasları üzerine VNC sinaps uzanan ve PNS bir parçasıdır. Arkadan sağa. (D) Üçüncü instar larva beyin ve VNC diseksiyon. Arkadan sağa. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kan-beyin bariyeri (BBB) oluşumu için tahkikat. (A-C) Geç evre 17 embriyolar (20−21 saat eski) posteriora enjekte 10 kDa sulforhodamine 101 asit klorür dekstran. Arka arkaya. Ölçek çubuğu = 20 μm. Kontrollerde görülen nokta, ventral sinir kordonuna (VNC) yayılan dorsoventral kanallardır. (A) Oregon R kontrolü. Örneklerin %6.25'inde boya alımı, n = 16. (B) ham1/+ kardeş kontrolü. Örneklerin %6.67'sinde boya alımı, n = 15. (C) Homozigot ham1/1 mutant. Örneklerin %100'ünde boya alımı, n = 22. (D) Oregon R kontrol üçüncü instar larva beyin. Boya BBB'de birikir, ancak CNS,n = 7'ye nüfuz etmez. Ölçek çubuğu = 50 μm. (E) Oregon R kontrol üçüncü instar larva VNC. Boya BBB'de birikir, ancak CNS,n = 11'e nüfuz etmez. Kesik çizgi VNC özetliyor. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Geç embriyonik gelişimde midgut morfolojisi. Evre 13−17 embriyolarının aktarılan ışık görüntüleri bağırsak morfolojisinin (embriyonun arka yarısındaki koyu gri bölgeler) görselleştirilmesine olanak sağlar. Midgut morfolojisi embriyonik gelişim inevreminin evresini belirlemek için kullanılabilir, bu da embriyoların enjeksiyon için uygun şekilde yaşlanıp yaşlanmadığı konusunda yararlıdır. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm | Tarifi |
| %2 Agarose jel | Bir Erlenmeyer şişesine 40 mL'lik çift distile H2O (ddH2O) ve mikrodalga fırına 0,8 g agarose ekleyin ve agarı çözündürün. Bir jel döküm tepsisine dökün ve jel oda sıcaklığında 30 dakika katılaşmak için izin verin. |
| Elma suyu agar tabakları | 4 L'lik bir şişeye 45 g agar ve 1,5 L ddH2O ölçün. 121 °C'de 40−45 dk için otoklav. Ölçü 50 şeker g ve elma suyu 0.5 L 1 L kabı içine ve düşük ateşte karıştırın (ayar 3) şekeri eritmek için, onu yakmak için dikkat. Autoclaving sonra, agar ve suya önceden ısıtılmış şeker ve elma suyu ekleyin. Eğer dokunabilirsiniz kadar soğumasını sağlamak için ısı kapalı düşük karıştırın. % 70 tegosept 15 mL ekleyin ve dağıtmak için karıştırın. 0.5 L'lik bir kabın içine dökün. Bir Bunsen brülör ile kabarcıklar veya alev kaldırmak için etanol ile sprey. 60 mm petri kapları içine dökün. Petri kaplarının kapaklarında en az 24 saat veya en az yoğuşma olana kadar ayarlanmasına izin verin ve 4 °C'de saklayın. |
| %50 Çamaşır Suyu | Konik bir tüp içine 15 mL ddH2O ve 15 mL ev çamaşır suyu ekleyin. |
| %80 Gliserol | 10 mL için 8 mL otoklaved ddH2O ve 2 mL gliserol ekleyin 15 mL konik tüp. Çözelti homojen olana kadar bir rocker üzerinde kuluçka. |
| 1x PBS | 1 L için 100 mL 10x PBS'yi 900 mL ddH2O'da seyreltin. |
| 10x PBS | 2 L için, ddH2O 1.600 mL aşağıdaki çözün: NaCl 160 g, KCl 4 g, Na2HPO4 28.8 g ve KH4.8g 2 PO4. HCl ile pH'ı 7,5'e ayarlayın. |
| PBTx (PBS + %0.1 noniyonik sürfaktan) | 1 L için 100 mL 10x PBS, 10 mL %10 niyonik yüzey aktif madde ve 890 mL ddH2O birleştirin. |
| %70 Tegosept | Karışım 1 g p-hidroksibenzoik asit, metil ester her 10 mL için 100% etanol. -20 °C'de saklayın. |
| %10 Niyonik yüzey aktif | 50 mL için konik bir tüpe 45 mL otoklav ddH2O ve 5 mL niyonik yüzey aktif madde ekleyin. Çözelti homojen olana kadar kaya üzerinde döndürün. |
| Maya ezmesi | Kuru aktif mayayı 50 mL plastik kabın içinde ddH2O ile karıştırın. |
Tablo 1: Bu protokol boyunca kullanılan reaktifler ve arabellekler.
| Genotip | Stok |
| w[1118]; ln(2LR)Gla, wg[Gla-1]/CyO, P{w[+mC]=GAL4-twi.G}2.2, P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH2.2 | Bloomington #6662 |
| w{*]; sna[Sco]/CyO, P{w[+mC]=Dfd-EYFP}2 | Bloomington #8578 |
| w{*]; L[2] Pin[1]/CyO, P{w[+mC]=GAL4-Kr.C}DC3, P{w[+mC]=UAS=GFP. S65T}DC7 | Bloomington #5194 |
| Df(1)JA27/FM7c, P{w[+mC]=GAL4-Kr.C}DC1, P{w[+mC]=UAS-GFP. S65T}DC5, sn[+] | Bloomington #5193 |
| w[*]; ry[506] Dr[1]/TM6B, P{w[+mc]=Dfd-EYFP}3, Sb[1] Tb[1] ca[1] | Bloomington #8704 |
| y[1] w[*]; D[*] gl[3]/TM3, P{w[+mC]=GAL4-Kr.C}DC2, P{w[+mC]=UAS-GFP. S65T}DC10, Sb[1] | Bloomington #5195 |
| Oregon R | Birden Fazla Suş Mevcut |
| ham[1] cn[1] bw[1] sp[1]/CyO | Bloomington #2749 |
| P{w[+mW.hs]=GawB}elav[C155] | Bloomington #458 |
| w[1118]; P{w[+m*]=GAL4}repo/TM3, Sb[1] | Bloomington #7415 |
| P{UAS-GFP} | Birden fazla suş mevcuttur |
Tablo 2: Sinek suşları. Bu protokol boyunca tartışılan sinek suşları. Bloomington Drosophila Stok Merkezi hisse senedi numarası, uygun olduğu durumlarda sağlanmaktadır.
| Döngüsü | ısı | Çekme | Hız | Zaman | Basınç | Rampa |
| 1 | 590 | 115 | 15 | 250 | 600 | X |
| 2 | 575 | 130 | 60 | 250 | 600 | X |
Tablo 3: Micropipette çekmece ayarları. Mikropipet çekmece ayarları bu protokolde enjeksiyon için iğne oluşturmak için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, Geç embriyonik ve D. melanogaster gelişiminin üçüncü instar larva aşamalarında BBB bütünlüğü için test etmek için gereken adımların kapsamlı bir açıklamasını sağlar. Benzer yaklaşımlar başka bir yerde geliştirme sırasında BBB bütünlüğünü titretmek için tarif edilmiştir, yanı sıra yetişkin aşamalarında5,7,29,30. Ancak, malzeme ve yöntem bölümlerindeki prosedürlerin açıklamaları genellikle doğada geniştir ve kolay uygulama için yeterli ayrıntıya sahiptir ve araştırmacı adına önemli sorun giderme gerektirir. Bu protokol, embriyonik ve larva aşamalarında BBB bütünlüğü için test etmek için gereken adımların kapsamlı bir açıklamasını sağlar. Her aşamada, doğru gelişim aşamasının incelenmesi ni ve doku mimarisinin bozulmamasını sağlamak için izlenmesi gereken kritik adımlar vardır, bu da BBB'yi tehlikeye atabilir. Bu yaklaşımlarda başarıelde etmek için doğru sonuçlar elde etmek için protokolün birden çok adımını gidermek gerekiyordu. Embriyonik ve larva protokollerinde kritik adımlar aşağıda açıklanmıştır.
Daha önceki çalışmalarda BBB'nin 18.5 h AEL5tarafından kurulduğu bildirilmiştir. Doğru gelişimsel zamanlama sağlamak için, yaşlanma sırasında sabit bir sıcaklıkta numuneleri korumak önemlidir. Embriyo toplarken, elma suyu agar tabakları toplama için kullanılmadan önce 25 °C'ye getirilmelidir. Daha yavaş gelişme ile önceden ısıtılmış olmayan elma suyu plakaları kullanarak ve henüz bir BBB kurmuş değil ve bu nedenle sinir sisteminde 10 kDa dextran birikimi sergileyecek örnekleri verebilir. Bu nedenle, bir 18.5 h. Daha eski örnekleri enjekte emin olmak önemlidir. BBB'nin daha sonra kurulması. Olası gelişimsel gecikmeleri hesaba katmak için, örnekler rapor edilen BBB oluşumundan biraz sonra 20−21 saat AEL olarak test edildi. Diğer dokuların morfolojisi kullanarak, özellikle gelişmekte olan midgut, tsayarak olan embriyo gelişimi doğru aşamasıkurulmasına yardımcı olabilir(Şekil 3). Tersine, yanlış deneysel zamanlama zaten hareketli ve kuluçka işlemine başlamış örneklere neden olabilir. Zaten kuluçkaya başladı larva ların sayısını azaltmak için, enjeksiyon için embriyo toplamadan önce dişilerden yaşlı embriyolar temizlemek için iki saat koleksiyonları en az gerçekleştirmek önemlidir. İlk instar larvasında BBB analizi isteniyorsa, enjeksiyon dan önce hareketliliği azaltmak için buz üzerinde 9 kuyuluk bir tabakta 1x PBS'de larvaların kısa bir inkübasyonu kullanılabilir. Slaytlar da hareketlilik azaltmak için enjeksiyon işlemi sırasında bir buz paketi üzerinde tutulabilir.
Embriyoda BBB'nin kurulmasına ilişkin kaliteli görüntüler ve doğru sonuçlar elde etmek için, prosedür boyunca ek adımların dikkatle izlenmesi gerekmektedir. Agar levha üzerinde embriyolar sıraya, trakea yukarı bakacak olmalıdır, Bu embriyonun sırt tarafı olduğu gibi (Şekil 1B). Embriyolar çift taraflı bant ile slayt aktarıldığında, embriyonun ventral tarafı daha sonra karşı karşıya olacak, protokol daha sonra konfokal görüntüleme sırasında sinir kordonu optimal görselleştirme için izin. Embriyolar da enjeksiyon sırasında hareketi inhibe etmek için çift taraflı bant güvenli bir şekilde yapıştırılmalıdır. Düz bir% 2 agarose ped kullanımı araştırmacı embriyolara zarar riski olmadan transfer işlemi sırasında embriyolar üzerine sıkıca çift taraflı bant ile slayt itmek için izin verir. Slayta aktarılmasından sonra, embriyonun boya enjeksiyonu üzerine patlamasını önlemek için kurutma gereklidir. Çok fazla boya enjeksiyonu da embriyo patlamasına neden olabilir. Sadece boya enjekte etmek için yeterli embriyo içine iğne eklemek için önemlidir, ama o kadar çok değil iğne potansiyel olarak yanlış pozitif sonuç verecek sinir sistemini delinmesi. Çok büyük bir delik yarası da embriyo nun hemolenf ve boya taşması ile sonuçlanabilir, başarısız bir deneyyol. Akılda bu potansiyel tuzaklar ile, enjeksiyon ucuna hafif bir açı ya da bir iğne ile en başarılı, dikkatle embriyo delmek için küçük bir nokta olduğu gibi.
BBB bütünlüğü için larva ların atanma durumunda, örneğin hareketliliği nedeniyle zorluklar ortaya çıkabilir. Yüksek kaliteli çift taraflı bant kullanımı çok önemlidir, çünkü larvaların enjeksiyon için immobilize edilmesinde etkili olmalıdır. Larva çözülmezse, teybe geri yuvarlanabilir ve yavaşça yeniden güvenli hale getirilebilir. Enjeksiyon için larva taşırken, larvaların sıkışmaihtimaline karşı kaydırağı petri kabında taşımak faydalıdır. Enjeksiyondan sonraki adımlar BBB'nin bozulmasını önlemek için en çok özeni gerektirir. Numunenin olası hasarını en aza indirmek için, numunenin doğrudan görüntüleme için kullanılacak slaytlar üzerinde incelenmesi en kolayıdır. Diseksiyonu için numune aktarırken larva banta güçlü bir şekilde yapışırsa, yapışmayı gevşetmek ve diseksiyon için slayta aktarılmasına izin vermek için teybe 1x PBS bir damla eklenebilir. Diseksiyondan sonra, yanlış pozitif sonuçları önlemek için numuneyi yeterince düzleştirmek önemlidir, ancak örnek bütünlüğü tehlikeye girer. Boşluk olarak ek kapaklar kullanarak kapak ve slayt arasında larva sandviç beynin zarar görmesine engel olur, ancak etkili görüntüleme için örnek immobilize.
Hem embriyolar hem de larvalar için protokollerle başarıya ulaşmak için, numune işleme başlamadan önce enjeksiyon cihazı nın ve konfokal mikroskobunun kurulduğundan emin olmak çok önemlidir. Bu, numune karşılaştırması için gerekli olan numunelerin görüntülenmesinde doğru zamanlamasağlar. Diğer yaklaşımlar daha gelişmiş enjeksiyon kurulumları kullandık, embriyo enjeksiyonu için kurulmuş ters bir mikroskop gerektiren. Bu protokol, basınç regülatörü ile standart bir diseksiyon mikroskop ve mikromanipülatör kullanır. Bu durumda, bir zebra balığı enjeksiyonu sadece sinek embriyo ve larva enjeksiyonu için adapte edildi. Bu protokol enjeksiyon için bir şırınga ile bir mikromanipülatör kullanmak için daha da basitleştirilmiş olabilir. Bu araçların çoğu Biyoloji bölümlerinde kolayca mevcuttur ve hatta sınıf laboratuvar ayarlarında mevcut olabilir, protokol uygulama maksimum kolaylığı için izin.
Görüntüleme işlemi sırasında, daha kolay görüntüleme için istenen bölgeyi belirlemek için sinir sistemi hücrelerini etiketlemek yararlı olabilir. Özellikle, bir elav-Gal4 veya repo-Gal4 suşları kullanarak, nöronlar veya glia gfp ifade gal4 /UAS sistemi kullanabilirsiniz, sırasıyla (Tablo 2)31,32,33. Bu tür etiketleme sinir sisteminin bütünlüğünü görselleştirmek için sulforhodamine 101 asit klorür dextran ile bir kontrast sağlayacaktır.
Bu yöntem D. melanogastergelişimi sırasında BBB bütünlüğünü tahmin odaklanmış olsa da, bu yaklaşım organizmalar ve dokuların çeşitli diğer engellerin bütünlüğünü incelemek için adapte edilebilir. Örneğin, farelerde BBB34'üatamak için benzer protokoller yayınlanmıştır. Buna ek olarak, D. melanogaster spermatogenez sırasında kan-göz bariyeri ve mikrop hücrelerini çevreleyen somatik bariyer geçirgenlik benzer bir yaklaşım kullanmak29,35. Protokol aynı zamanda diğer dokularda kullanılabilir geçirgenlik test etmek için adapte edilebilir, bağırsak da dahil olmak üzere. Bu protokolü diğer doku veya türlerde kullanım için uyarlarken, bariyeri geçebilecek moleküllerin boyutunu göz önünde bulundurmak gerekecektir, çünkü 10 kDa dextran'ın bazı bariyerlere nüfuz edecek kadar küçük olması mümkündür. Genel olarak, bu protokol, diğer ortamlarda kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilen D. melanogaster geliştirme sırasında BBB bütünlüğü için test etmek için adım adım bir yordam sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar enjeksiyon için ekipman kullanımı için Dr F. Bryan Pickett ve Dr Rodney Dale teşekkür ederiz. Bu çalışma Loyola University Chicago'dan M.D., D.T., ve J.J.'e kadar araştırma fonu ile finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
References
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
