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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na Drosophila melanogaster

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60233
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Loyola University Chicago

Summary

A integridade da barreira hematoencefálica é fundamental para a função do sistema nervoso. Na Drosophila melanogaster, a barreira hematoencefálica é formada por células gliais durante a embriogênese tardia. Este protocolo descreve métodos para o ensaio para a formação e a manutenção da barreira do sangue-cérebro em embriões do melanogaster do D. e em larvas do terceiro instar.

Abstract

O desenvolvimento do sistema nervoso adequado inclui a formação da barreira hemato-encefálica, a barreira de difusão que regula firmemente o acesso ao sistema nervoso e protege o tecido neural de toxinas e patógenos. Os defeitos na formação desta barreira foram correlacionados com os neuropathies, e a avaria desta barreira foi observada em muitas doenças neurodegenerativas. Portanto, é fundamental identificar os genes que regulam a formação e manutenção da barreira hemato-encefálica para identificar potenciais alvos terapêuticos. A fim compreender os papéis exatos que estes genes jogam no desenvolvimento neural, é necessário ensaiar os efeitos da expressão de gene alterada na integridade da barreira do sangue-cérebro. Muitas das moléculas que funcionam no estabelecimento da barreira hemato-encefálica foram encontradas para serem conservadas em espécies eucarióticas, incluindo a mosca da fruta, a Drosophila melanogaster. As moscas da fruta provaram ser um sistema modelo excelente para examinar os mecanismos moleculars que regulam o desenvolvimento e a função do sistema nervoso. Este protocolo descreve um procedimento passo a passo para o ensaio da integridade da barreira hematoencefálica durante os estágios embrionário e larval do desenvolvimento de D. melanogaster .

Introduction

Durante o desenvolvimento, a comunicação celular e as interações são críticas para o estabelecimento da estrutura e função do tecido e do órgão. Em alguns casos, essas interações célula-célula selar fora órgãos do ambiente circundante para garantir a função adequada do órgão. Este é o caso para o sistema nervoso, que é isolado pela barreira sangue-cérebro (BBB). A disfunção do BBB em humanos tem sido associada a distúrbios neurológicos, incluindo epilepsia, e a quebra da barreira tem sido observada em doenças neurodegenerativas, incluindo esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica1. Nos mamíferos, o BBB é formado por junções apertadas entre as células endoteliais2,3. Outros animais, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, têm um BBB composto de células gliais. Estas células gliais formam uma barreira seletivamente permeável para controlar o movimento de nutrientes, produtos residuais, toxinas e grandes moléculas dentro e fora do sistema nervoso4. Isto permite a manutenção do gradiente eletroquímico necessário ao fogo potencial de ação, permitindo a mobilidade e coordenação4. Em D. melanogaster, o glia proteger o sistema nervoso do potássio-rico, sangue-como hemolinfa5.

No sistema nervoso central (SNC) e no sistema nervoso periférico (PNS) de D. melanogaster, duas camadas gliais exteriores, a glia subperinelares e o perinurais glia, bem como uma rede externa de matriz extracelular, a lamela neural, formam a hemolinfa-cérebro e hemolinfa-barreira nervosa6, referido como o BBB ao longo deste artigo. Durante o desenvolvimento subperinurais glia tornar-se poliploide e ampliar para cercar o sistema nervoso5,6,7,8,9,10,11 . As junções septadas do formulário do glia de subperinurais, que fornecem a barreira principal da difusão entre o hemolinfa e o sistema nervoso5,6,12. Estas junções são molecularmente similares às junções septate-like encontradas nos paranodes de glia de nos vertebrados, e executam a mesma função que junções apertadas no BBB dos mamíferos13,14, 15 anos de , 16 anos de , 17. o perinurais glia divide, cresce, e envolve em torno da glia subperinurais para regular a difusão de metabólitos e grandes moléculas6,10,18,19. A formação de BBB é completa por 18,5 h após a colocação do ovo (AEL) em 25 ° c5,8. Estudos prévios identificaram genes que são reguladores críticos da formação BBB20,21,22. Para compreender melhor os papéis exatos destes genes, é importante examinar o efeito da mutação destes reguladores potenciais na integridade de BBB. Embora estudos prévios tenham delineado abordagens para a integridade do BBB em embriões e larvas, um protocolo abrangente para este ensaio ainda não foi descrito5,7. Este protocolo passo a passo descreve métodos para ensaio a integridade BBB durante estágios larvares embrionário e terceiro instar D. melanogaster .

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Protocol

1. coleta de amostras

  1. Coleção do embrião
    1. Em cada gaiola da coleção do embrião, use um mínimo de 50 fêmeas virgens com os 20 − 25 machos para coleções. Incubar estas moscas em uma garrafa com alimentos de farinha de milho-Agar (tabela de materiais) por 1 − 2 dias antes de iniciar as coletas23.
      Nota: Mais moscas podem ser usadas, mas a relação feminino-masculino deve ser mantida em 2:1.
    2. Placas de ágar de sumo de maçã pré-quentes (tabela 1) a 25 ° c durante a noite.
      Nota: Isso é necessário para o preparo adequado de embriões. Se as placas estão secando rapidamente, adicione uma bacia com água à incubadora para aumentar a umidade da câmara.
    3. Anestesizar moscas do passo 1.1.1 com CO2 e transferência voa para uma gaiola de coleta. Coloque uma placa de ágar de sumo de maçã pré-aquecida com uma pequena mancha de pasta de levedura na extremidade aberta e prenda-a à gaiola com a manga vermelha (tabela de materiais). A fim de limpar os embriões mais velhos, permitir que moscas para colocar os embriões/ovos em uma placa de ágar suco de maçã para 1 h a 25 ° c.
    4. Retire a gaiola de coleta da incubadora. Inverta o lado da malha da gaiola para baixo e a torneira voa para baixo à parte inferior da gaiola. Substitua o ágar suco de maçã com uma nova placa de agar suco de maçã pré-aquecido com uma pequena mancha de pasta de levedura. Descarte a primeira placa.
    5. Permitir moscas para colocar embriões/ovos na placa de ágar novo suco de maçã para 1 h a 25 ° c. Descarte esta placa após a coleta de 1 h e prossiga para o próximo passo para coletar embriões para injeção.
    6. Para recolher os embriões do estágio atrasado 17 (20 − 21 h AEL), permita moscas do genótipo desejado dos passos 1.1.1 − 1.1.5 para colocar em um novo pré-aquecido suco de maçã Agar placas com um pequeno esfregaço de pasta de levedura a 25 ° c para 1 h. placa de idade para 19 h em uma incubadora de 25 ° c , assim os embriões serão 20 − 21 h da idade na altura da imagem latente.
      Nota: Esta etapa pode ser repetida como desejado para várias rodadas de coleta de amostra, injeção e imagem.
    7. Colete embriões de placas em um filtro de células com malha de nylon de 70 μm adicionando soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) com surfactante não iônico 0,1% (PBTx; Tabela 1) para cobrir a superfície da placa e soltar os embriões da superfície usando um pincel.
    8. Embriões dechorionados coletados no filtro celular em uma solução de lixívia de 50% (tabela 1) em um prato de Petri de 100 mm por 5 min com agitação ocasional à temperatura ambiente. Enxágüe os embriões 3x girando o filtro da pilha em PBTx em uma placa de Petri, usando um prato fresco de PBTx cada vez.
    9. Se todos os embriões forem do genótipo correcto, avance directamente para o passo 1.1.10. Se a geração de embriões do genótipo correcto necessitar de uma cruz com moscas heterozzygous, selecione os embriões do genótipo correcto utilizando a presença ou ausência de cromossomas de equilibrador marcados fluorescentamente. Use um estereomicroscópio com capacidades fluorescentes para a seleção do genótipo.
      Nota: Cromossomas de balanceador marcados com proteína fluorescente amarela deformada; Kruppel-Gal4, proteína fluorescente UAS-verde (GFP); e Twist-Gal4, UAS-GFP funcionam bem para a seleção de genótipos na embriogênese tardia (tabela 2)24,25,26.
    10. Utilizando uma pipeta de vidro, transfira embriões em PBTx para uma laje de gel de agarose a 2% (tabela 1). Remova o excesso de líquido com papel de filtro. Alinhar ~ 6 − 8 embriões na laje de gel de agarose a 2% com posterior para o lado direito e dorsal virado para cima (Figura 1B).
      Nota: O micropyle, o furo pequeno através de que os espermatozóides entram no ovo, são situados na extremidade anterior do embrião. A extremidade posterior é mais arredondada. A traquéia aparece branca e está localizada no embrião, permitindo a distinção dos lados dorsal e ventral do embrião (Figura 1B).
    11. Prepare um slide com um pedaço de fita dupla face. Pressione firmemente o slide em cima dos embriões para transferi-los para a fita dupla face.
    12. Embriões de dessecação por incubação à temperatura ambiente durante ~ 25 min (não é utilizado dessecante). Após a dessecação, cubra os embriões com óleo de halocarbono.
      Nota: Os períodos de dessecação podem variar dependendo da temperatura, umidade e ventilação na sala. O período de incubação deve ser utilizado para configurar o aparelho para injeção e o microscópio confocal para a imagem, conforme descrito nas secções 2 e 3 deste protocolo.
  2. Coleção larval
    1. Configurar uma cruz com 5 − 10 moscas fêmeas virgens do genótipo desejado e metade do número de machos do genótipo pretendido num frasco para injetáveis com alimentos de farinha de milho-agar e incubar a 25 ° c23.
    2. Após 5 − 7 dias, dependendo do genótipo, coletar larvas de terceiro instar vagando do frasco suavemente com fórceps. Enxágüe larvas em 1X PBS para remover alimentos presos às larvas. Transfira larvas para uma placa de agar de sumo de maçã para genotipagem conforme descrito na etapa 1.1.9 se necessário.
    3. Larvas do rolo em um tecido usando um pincel para secá-los fora. Transfira 6 − 8 larvas para um slide preparado com fita dupla face usando fórceps.

2. preparação de agulhas e injeção de amostra

  1. Puxe as agulhas em um extrator de micropipeta antes da iniciação deste protocolo. Fixe os tubos capilares no extrator da agulha e puxe de acordo com a forma padrão da agulha e os parâmetros para injeções de D. melanogaster (tabela 3)27. Armazene as agulhas em uma placa de Petri ancorando na argila até o uso para a injeção.
  2. Coloque uma agulha com 5 μL de 10 kDa dextrano conjugados a sulforhodamina 101 cloreto de ácido (tabela de materiais) utilizando uma ponta de pipeta de carregamento de gel de 20 μl durante o período de dessecação de 25 min para embriões (passo 1.1.12), ou imediatamente após a transferência de larvas para o slide (passo 1.2.3).
  3. Coloque a agulha em um suporte de agulha e posicione-a em um micromanipulador fixado a uma base de aço (tabela de materiais).
    Nota: A agulha deve ser quase paralela ao estágio do microscópio para a injeção do embrião e angular ligeiramente para baixo para injeções larval.
  4. Ajuste o aparelho de injeção (tabela de materiais) para 50 psi, 5 − 10 ms com uma faixa de 10.
    Nota: Pode ser necessário alterar essas configurações para o aparelho de injeção em particular que está sendo usado.
  5. Coloque a corrediça no estágio e a borda da escova da agulha de encontro à borda da fita frente e verso em um ângulo de 45 ° para criar uma ponta angular, quebrada.
    Nota: Para os embriões só é necessário quebrar a ponta suficiente para permitir o fluxo de 10 kDa Dextran. Uma agulha perfeita tem uma ponta ligeiramente angular e somente uma gota pequena da tintura virá para fora com cada injeção. Para as larvas, é necessário quebrar a ponta mais, mas com uma ponta angular para penetrar na parede do corpo larval. Uma gota maior da tintura virá para fora.
  6. Bombear o pedal do pé até que o corante esteja na ponta da agulha.
  7. Alinhe a agulha para que seja paralela com o embrião ou ligeiramente inclinada para baixo em direção à larva.
  8. Mova a agulha para perfurar a extremidade posterior da amostra e injete o espécime bombeando o pedal do pé. Injete ~ 2 nL de corante em embriões, e ~ 220 nL de corante em larvas.
    Nota: O embrião ou larva deve inundar com corante se a injeção for bem-sucedida.
  9. Anote o tempo de injeção para fins de incubação. Incubar embriões por 10 min à temperatura ambiente. Incubar larvas por 30 min à temperatura ambiente.
  10. Continue o slide para injetar espécimes adicionais, observando o tempo de injeção para cada espécime.
    Nota: Dependendo da velocidade com que as etapas subseqüentes da dissecção e da imagem latente podem ser executadas, 4 − 8 espécimes podem ser injetados em um momento.

3. preparação de amostras para imagens

  1. Imagem latente dos embriões
    1. Após a injecção, prepare embriões para imagiologia. Aplique a geléia de petróleo com um aplicador com ponta de algodão nos lados direito e esquerdo das amostras na corrediça como um espaçador para impedir dano aos embriões em cima da colocação da lamínula.
    2. Amostras da imagem usando um microscópio confocal durante todo a profundidade do embrião com um objetivo 20x. Calcule a porcentagem de amostras totais com corante observado no cabo do nervo ventral (VNC) utilizando a seguinte equação:% de amostras com BBB comprometida = número de amostras com acúmulo de corante no VNC/número total de amostras ensaiadas.
  2. Dissecção e imagem de larvas
    1. Prepare slides para amostras larval antes do tempo. Monte duas coberturas espaçadas aproximadamente 0,5 cm para além da corrediça com esmalte.
      Nota: Os COVERSLIP funcionam como espaçadores para o cérebro, por isso não é danificado durante o processo de montagem.
    2. Após a incubação de 30 min, dissecar as larvas em 1X PBS diretamente na corrediça que será usada na imagem latente. Primeiro, use um par de fórceps para agarrar a larva no meio do corpo larval, e usar um segundo par de fórceps para separar as metades anteriores e posteriores da larva.
    3. Em seguida, use um par de fórceps para segurar a região anterior na boca ganchos, e usar um segundo par de fórceps para inverter a parede do corpo sobre a ponta da pinça segurando os ganchos da boca. O cérebro e o VNC serão expostos.
    4. Separe o cérebro e o VNC da parede do corpo cortando os nervos, e retire a parede do corpo da corrediça (Figura 1C, D). Remova os discos imaginal, se desejar.
    5. Cubra a amostra com 10 μL de 80% de glicerol e coloque uma lamínula na parte superior da amostra para a imagem.
    6. Imagem através da profundidade do tecido do sistema nervoso usando um objetivo 20x. Calcule a percentagem de amostras totais com corante observado no VNC.

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Representative Results

Os métodos aqui descritos permitem a visualização da integridade do BBB em todo o SNC em embriões e larvas de D. melanogaster (Figura 1). Após a conclusão da formação BBB na embriogênese tardia, as funções BBB para excluir grandes moléculas do cérebro e VNC5. Este protocolo aproveita esta função para o ensaio de formação BBB. Quando o Wild-Type (Oregon R) os embriões do estágio atrasado 17 (20 − 21 h velhos) foram injetados com 10 kDa dextrano conjugados ao corante fluorescente do cloreto de ácido do sulforhodamine 101, a grande molécula do dextrano foi excluída do VNC, como esperado (Figura 2a). A fim demonstrar o efeito de mutações genéticas na integridade de BBB, os embriões com mutações no gene cru foram utilizados. Previamente, o gene cru foi demonstrado para regular a retração da faixa de germe durante o embriogénese, e foi mostrado mais recentemente para funcionar no glia para regular mudanças MORFOLÓGICAS no VNC durante o desenvolvimento28. Heterozygous RAW1 os embriões do mutante exibiram um BBB intacto, similar aos resultados observados em embriões do selvagem-tipo controle (Figura 2B). Por outro lado, os embriões homozygous RAW1 Mutant exibiram defeitos na integridade do BBB, com 10 kDa dextrano Dye inundação no VNC, indicando que o BBB não se forma (Figura 2C). Estes resultados demonstram a habilidade desta técnica de ensaiar a formação de BBB durante estágios embrionários.

Estudos prévios demonstraram que um defeito na poliploidização subperinatal glia resulta em uma ruptura do BBB que pode ser observada em estágios larvares do terceiro instar7,9. Assim, defeitos na formação e/ou manutenção do BBB podem resultar em um BBB comprometido durante estágios posteriores de desenvolvimento, o que torna desejável a integridade do ensaio da barreira no terceiro estágio larval do instar. Portanto, o protocolo utilizado para a integridade do BBB em estágios embrionários também foi otimizado para uso em larvas. Em amostras de controle de Oregon R, 10 kDa dextrano não consegue penetrar o BBB e é excluído do cérebro e VNC (Figura 2D, e). O corante se acumula na periferia do BBB.

Figure 1
Figura 1: o sistema nervoso dos embriões do estágio 17 e da larva do terceiro instar. (A) esquema de uma visão ventral de um estágio 17 sistema nervoso central embrionário (SNC). O SNC consiste no cérebro (br) e no cabo do nervo ventral (VNC), que tem canais dorsoventrais (CH). O micrópila (MP; Arrowhead) na extremidade anterior pode ser usado para orientar o embrião. Posterior à direita. (B) estágio 17 embrião orientado com o lado dorsal para cima e posterior para a direita, conforme recomendado na etapa 1.1.10. As setas estão apontando para a traquéia. Arrowhead indica o MP. Posterior à direita. (C) esquema do sistema nervoso na larva do terceiro ínstar. O cérebro (br) e o VNC compõem o SNC, enquanto os nervos se estendem da sinapse VNC para os músculos da parede corporal e fazem parte do PNS. Posterior à direita. (D) cérebro larval de terceiro instar dissecado e VNC. Posterior à direita. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: ensaio para a formação de barreira hematoencefálica (BBB). (A-C) Fase tardia 17 embriões (20 − 21 h de idade) injetados posteriormente com 10 kDa sulforhodamina 101 cloreto de ácido Dextran. Posterior para baixo. Barra de escala = 20 μm. Os pontos observados nos controles são canais dorsoventrais que abrangem o cabo do nervo ventral (VNC). (A) controle de Oregon R. Consumo de corante em 6,25% das amostras, n = 16. (B) RAW1/+ controle irmão. Consumo de corante em 6,67% das amostras, n = 15. (C) homozygous RAW1/1 mutante. Consumo de corante em 100% das amostras, n = 22. (D) Oregon R controle terceiro instar larval cérebro. A tintura se acumula no BBB, mas não penetra no SNC, n = 7. Barra de escala = 50 μm. (E) controle Oregon R terceiro instar LARVAL VNC. A tintura se acumula no BBB, mas não penetra no SNC, n = 11. Linha tracejada descreve o VNC. Barra de escala = 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: morfologia do intestino médio no desenvolvimento embrionário tardio. As imagens luminosas transmitidas dos embriões do estágio 13 − 17 permitem o visualização da morfologia do intestino (regiões cinzentas escuras na metade do posterior do embrião). A morfologia do intestino médio pode ser usada para determinar o estágio do desenvolvimento embrionário, o que é útil para determinar se os embriões estão sendo envelhecidos apropriadamente para injeção. Barra de escala = 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Solução Receita
2% gel de agarose Adicionar 0,8 g de agarose a 40 mL de H2O de dupla destilação (ddH2O) num frasco de Erlenmeyer e microondas para dissolver o agar. Despeje em uma bandeja de fundição de gel e permitir que o gel para solidificar por 30 min à temperatura ambiente.
Placas de agar de suco de maçã Medir 45 g de agar e 1,5 L de ddH2O em um balão de 4 L. Autoclave de 40 − 45 min a 121 ° c. Meça 50 g de açúcar e 0,5 L de sumo de maçã num copo de 1 L e mexa em lume baixo (ajuste 3) para dissolver o açúcar, tomando cuidado para não o queimar. Após autoclavagem, adicione o açúcar pré-aquecido e suco de maçã para o agar e água. Mexa em baixo com o calor desligado para permitir esfriar até que você possa tocá-lo. Adicionar 15 mL de 70% tegosept e mexa para dispersar. Despeje em uma taça 0,5 L. Pulverize com etanol para remover bolhas ou chamas com um queimador de Bunsen. Despeje em pratos de Petri de 60 mm. Permitir a definir para pelo menos 24 h, ou até que haja condensação mínima nas tampas das placas de Petri e armazenar a 4 ° c.
50% lixívia Adicionar 15 mL de ddH2O e 15 ml de lixívia doméstica em um tubo cônico.
80% glicerol Para 10 mL, adicione 8 mL de ddH autoclavado2O e 2 ml de glicerol a um tubo cônico de 15 ml. Incubar em um balancim até que a solução seja homogênea.
1X PBS Para 1 L, diluir 100 mL de PBS 10x em 900 mL de ddH2O.
PBS 10x Para 2 L, dissolva o seguinte em 1.600 mL de ddH2o: 160 g de NaCl, 4 g de kcl, 28,8 g de na2hpo4e 4,8 g de KH2po4. Ajuste o pH a 7,5 com HCl.
PBTx (PBS + 0,1% surfactante não iônico) Para 1 L, combine 100 mL de PBS 10x, 10 mL de surfactante não iônico de 10% e 890 mL de ddH2O.
70% tegosepto Misture 1 g de ácido p-hidroxibenzóico, éster metílico para cada 10 mL de etanol a 100%. Conservar a-20 ° c.
10% surfactante nonionic Para 50 mL, adicione 45 mL de ddH autoclavado2O e 5 ml de surfactante não iônico a um tubo cônico. Gire sobre o balancim até que a solução seja homogênea.
Pasta de levedura Misture O fermento ativo seco com ddH2O em um copo plástico de 50 ml até que liso.

Tabela 1: reagentes e buffers utilizados em todo este protocolo.

Genótipo Estoque
w [1118]; ln (2LR) GLA, WG [GLA-1]/CyO, P {w [+ mC] = GAL4-Twi. G} 2.2, P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} AH 2.2 #6662 de Bloomington
w {*]; SNA [SCO]/CyO, P {w [+ mC] = DFD-EYFP} 2 #8578 de Bloomington
w {*]; L [2] PIN [1]/CyO, P {w [+ mC] = GAL4-Kr. C} DC3, P {w [+ mC] = UAS = GFP. S65T} DC7 #5194 de Bloomington
DF (1) JA27/FM7c, P {w [+ mC] = GAL4-Kr. C} DC1, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC5, SN [+] #5193 de Bloomington
w [*]; Ry [506] Dr [1]/TM6B, P {w [+ MC] = DFD-EYFP} 3, SB [1] TB [1] CA [1] #8704 de Bloomington
y [1] w [*]; D [*] GL [3]/TM3, P {w [+ mC] = GAL4-Kr. C} DC2, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC10, SB [1] #5195 de Bloomington
De Banguecoque Várias cepas disponíveis
RAW [1] CN [1] BW [1] SP [1]/CyO #2749 de Bloomington
P {w [+ mW. HS] = GawB} ELAV [C155] #458 de Bloomington
w [1118]; P {w [+ m *] = GAL4} repo/TM3, SB [1] #7415 de Bloomington
P {UAS-GFP} Várias cepas disponíveis

Tabela 2: estirpes de mosca. Cepas de mosca discutidas ao longo deste protocolo. O número de ações da Bloomington Drosophila Stock Center é fornecido quando aplicável.

Ciclo Calor Puxar Velocidade Tempo Pressão Rampa
1 590 115 15 250 600 X
2 575 130 60 250 600 X

Tabela 3: configurações do extrator de micropipeta. Configurações de extrator de micropipeta usadas para gerar agulhas para injeção neste protocolo.

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Discussion

Este protocolo fornece uma descrição detalhada das etapas necessárias para o ensaio para a integridade BBB durante os estágios larvares embrionário e terceiro instar tardio do desenvolvimento de D. melanogaster . Abordagens semelhantes têm sido descritas em outro lugar para o ensaio da integridade do BBB durante o desenvolvimento, bem como em estágios adultos5,7,29,30. No entanto, descrições de procedimentos em materiais e seções de métodos são muitas vezes de natureza ampla e faltam detalhes suficientes para fácil implementação, necessitando de solução de problemas significativa em nome do pesquisador. Este protocolo fornece uma descrição detalhada das etapas necessárias para o ensaio de integridade BBB durante os estágios embrionário e larval. Em cada etapa, há etapas críticas a serem seguidas para garantir que a fase correta do desenvolvimento esteja sendo examinada e a arquitetura tecidual não seja interrompida, o que poderia comprometer o BBB. A fim conseguir o sucesso nestas aproximações era necessário pesquisar defeitos etapas múltiplas do protocolo para produzir resultados exatos. As etapas críticas nos protocolos embrionário e larval são descritas abaixo.

Estudos prévios relataram o estabelecimento do BBB por 18,5 h AEL5. Para assegurar o sincronismo desenvolvente exato, é importante manter amostras em uma temperatura constante durante o envelhecimento. Ao coletar embriões, as placas do agar do suco de maçã devem ser trazidas a 25 ° c antes do uso para a coleção. Usando placas de suco de maçã que não foram pré-aquecido resulta em desenvolvimento mais lento e pode produzir amostras que ainda não estabeleceram um BBB e, portanto, exibem acúmulo de 10 kDa dextrano no sistema nervoso. Como tal, é importante certificar-se de que um está injetando as amostras que são mais velhas do que 18,5 h. Além disso, ao realizar esses experimentos em embriões, é necessário considerar a possibilidade de um atraso no desenvolvimento, porque tal atraso poderia simplesmente resultar em o posterior estabelecimento do BBB. Para dar conta de eventuais atrasos no desenvolvimento, as amostras foram analisadas a 20 − 21 h de AEL, ligeiramente após a formação de BBB relatada. O uso da morfologia de outros tecidos, em particular o intestino médio em desenvolvimento, pode auxiliar no estabelecimento do estágio correto do desenvolvimento do embrião que está sendo analisado (Figura 3). Inversamente, o sincronismo experimental impróprio pode conduzir às amostras que são já motile e começaram o processo de eclosão. Para reduzir o número de larvas que já começaram a eclosão, é importante realizar um mínimo de duas coletas de 1 h para limpar os embriões mais velhos de fêmeas antes de coletar embriões para injeção. Se a análise do BBB em larvas de primeiro instar é desejada, uma breve incubação de larvas em 1X PBS em um prato de 9 poços no gelo pode ser usada para reduzir a motilidade antes da injeção. As lâminas também podem ser mantidas em um bloco de gelo durante o procedimento de injeção para reduzir a motilidade.

A fim de garantir imagens de qualidade e resultados precisos sobre o estabelecimento do BBB no embrião, medidas adicionais devem ser seguidas cuidadosamente durante todo o procedimento. Ao alinhar os embriões na laje de agar, a traquéia deve estar voltada para cima, pois este é o lado dorsal do embrião (Figura 1B). Quando os embriões são transferidos para o slide com a fita dupla face, o lado ventral do embrião, em seguida, será voltado para cima, permitindo a visualização ideal do cabo nervoso durante a imagem confocal mais tarde no protocolo. Os embriões também devem ser firmemente aderidos à fita dupla face para inibir o movimento durante a injeção. O uso de uma almofada de agarose plana de 2% permite que o pesquisador empurre a corrediça com a fita dupla face firmemente para os embriões durante o processo de transferência, sem risco de danos aos embriões. Após a transferência para o slide, a dessecação é necessária para evitar que o embrião exploda após a injeção de corante. A injeção de demasiada tintura pode igualmente fazer com que o embrião estoure. É importante inserir apenas a agulha no embrião o suficiente para injetar o corante, mas não tanto que a agulha potencialmente perfura o sistema nervoso, o que daria um resultado falso positivo. Demasiado grande de uma ferida da punctura pode igualmente conduzir à hemolinfa e à inundação da tintura fora do embrião, conduzindo a um experimento falhado. Com estas armadilhas potenciais na mente, a injeção é o mais bem sucedido com uma agulha que tenha um ângulo ligeiro à ponta, tal que há um ponto pequeno com que para perfurar com cuidado o embrião.

No caso de larvas de ensaio para integridade BBB, podem surgir desafios devido à motilidade da amostra. O uso de fita dupla face de alta qualidade é crítico, pois deve ser eficaz em imobilizar larvas para injeção. Se a larva se torna unstuck, pode ser rolado para trás na fita e empurrado delicadamente para baixo para resecure o. Ao transportar larvas para a injeção, é útil transportar a corrediça em uma placa de Petri caso que as larvas se tornem Unstuck. As etapas após a injeção exigem o maior cuidado para evitar a ruptura do BBB. Para minimizar os danos potenciais à amostra, é mais fácil dissecar a amostra diretamente nos slides que serão utilizados para a imagem. Se a larva é aderida fortemente à fita ao transferir a amostra para a dissecção, uma gota de 1X PBS pode ser adicionada à fita para afrouxar a adesão e para permitir a transferência à corrediça para a dissecção. Após a dissecção, é importante aplainar a amostra suficientemente para evitar resultados falsos positivos, mas não tanto que a integridade da amostra é comprometida. Imprensando a larva entre a lamínula e a corrediça usando lamela adicionais enquanto os espaçadores impedem que o cérebro esteja danificado, contudo imobiliza a amostra para a imagem latente eficaz.

A fim conseguir o sucesso com protocolos para embriões e larvas, é crítico certificar-se que o instrumento da injeção e o microscópio confocal estão ajustados acima antes que o processamento da amostra comece. Isto permite o sincronismo exato na imagem latente das amostras, que é necessário para a comparação da amostra. Outras abordagens utilizaram os set-ups de injeção mais avançados, exigindo um microscópio invertido configurado para injeção de embrião. Este protocolo utiliza um microscópio de dissecação padrão e um micromanipulador com um regulador de pressão. Neste caso, uma injeção de zebrafish configurada foi simplesmente adaptada para injeção de embriões de mosca e larvas. Este protocolo poderia ser simplificado mais para utilizar um micromanipulador com uma seringa para a injeção também. Muitas dessas ferramentas estão prontamente disponíveis em departamentos de biologia e podem até estar disponíveis em configurações de laboratório de sala de aula, permitindo a máxima facilidade de implementação do protocolo.

Durante o procedimento da imagem latente, pode ser útil etiquetar as pilhas do sistema nervoso para identificar mais facilmente a região desejada para a imagem latente. Especificamente, pode-se usar o sistema GAL4/UAS para expressar GFP em neurônios ou glia, usando as cepas de ELAV-GAL4 ou repo-GAL4, respectivamente (tabela 2)31,32,33. Tal rotulagem forneceria um contraste com o dextrano ácido do cloreto de sulforhodamine 101 para visualizar a integridade do sistema nervoso.

Enquanto este método é focado em ensaio a integridade do BBB durante o desenvolvimento de D. melanogaster, esta abordagem poderia ser adaptada para examinar a integridade de outras barreiras em uma variedade de organismos e tecidos. Por exemplo, protocolos semelhantes foram publicados para ensaio o BBB em camundongos34. Além, a permeabilidade da barreira do sangue-olho e a barreira somática que cercam as pilhas de germe durante o espermatogênese em D. melanogaster utilizam uma aproximação similar29,35. O protocolo também pode ser adaptado para uso em outros tecidos para testar a permeabilidade, incluindo no intestino. Ao adaptar este protocolo para uso em outros tecidos ou espécies, será necessário considerar o tamanho das moléculas que podem penetrar na barreira, pois é viável que 10 kDa dextrano pode ser pequeno o suficiente para permear algumas barreiras. Globalmente, este protocolo fornece um procedimento passo a passo para o ensaio de integridade BBB durante o desenvolvimento de D. melanogaster que pode ser facilmente adaptado para uso em outras configurações.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem ao Dr. F. Bryan Pickett e ao Dr. Rodney Dale pelo uso de equipamentos para injeção. Este trabalho foi financiado por financiamento de pesquisa da Loyola University Chicago para M.D., D.T., e J.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran ThermoFisher Scientific D1863 Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips Eppendorf 22351656
100% Ethanol (200 proof) Pharmco-Aaper 11000200
Active Dry Yeast Red Star
Agar Fisher Scientific BP1423
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Air Compressor DeWalt D55140
Apple Juice Mott's Natural Apple Juice
Bleach Household Bleach 1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Bottle Plugs Fisher Scientific AS-277
Cell Strainers BD Falcon 352350
Confocal Microscope Olympus FV1000 Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator Puritan 19-062614
Double-Sided Tape 1/2" Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip Roboz RS-5015
Fly Food Bottles Fisher Scientific AS-355
Fly Food Vials Fisher Scientific AS-515
Foot Pedal Treadlite II T-91-S
Gel Caster Bio-Rad 1704422
Gel Tray Bio-Rad 1704436
Glass Pipette VWR 14673-010
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Granulated sugar Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil Lab Scientific, Inc. FLY-7000
Light Source Schott Ace I
Manipulator Stand World Precision Instruments M10
Micromanipulator World Precision Instruments KITE-R
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Needle Holder World Precision Instruments MPH310
Nightsea Filter Sets Electron Microscopy Science SFA-LFS-CY For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head Electron Microscopy Science SFA-RB For visualization of GFP
Paintbrush Simply Simmons Chisel Blender #6
Pipetter Fisher Scientific 13-683C
Pneumatic Pump World Precision Instruments PV830 This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Small Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-100
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Steel Base Plate World Precision Instruments 5052
Stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000 Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source Baytronix Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) Genesee Scientific 20-258
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 Nonionic surfactant
Vial Plugs Fisher Scientific AS-273

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Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na <em>Drosophila melanogaster</em>
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Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J.… More

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233, doi:10.3791/60233 (2019).

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