Summary
Integriteit van de bloed-hersen barrière is essentieel voor de functie van het zenuwstelsel. In Drosophila melanogasterwordt de bloed-hersen barrière gevormd door gliacellen tijdens de late embryogenese. Dit protocol beschrijft methoden voor het testen van de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière in D. melanogaster -embryo's en derde instar larven.
Abstract
Goede ontwikkeling van het zenuwstelsel omvat de vorming van de bloed-hersen barrière, de diffusie barrière die strak regelt de toegang tot het zenuwstelsel en beschermt zenuwweefsel tegen toxines en pathogenen. Defecten in de vorming van deze barrière zijn gecorreleerd met neuropathieën, en de afbraak van deze barrière is waargenomen bij veel neurodegeneratieve ziekten. Daarom is het van cruciaal belang om de genen te identificeren die de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière reguleren om mogelijke therapeutische doelen te identificeren. Om de exacte rollen die deze genen spelen in neurale ontwikkeling te begrijpen, is het noodzakelijk om de effecten van veranderde genexpressie op de integriteit van de bloed-hersen barrière te testen. Veel van de moleculen die functioneren in de oprichting van de bloed-hersen barrière zijn gevonden om te worden bewaard over eukaryotische soorten, met inbegrip van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster. Fruit vliegjes hebben bewezen een uitstekend modelsysteem te zijn voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die de ontwikkeling en functie van het zenuwstelsel reguleren. Dit protocol beschrijft een stapsgewijze procedure voor de bepaling van de integriteit van de bloed-hersen barrière tijdens de embryonale en larvale stadia van de ontwikkeling van D. melanogaster .
Introduction
Tijdens de ontwikkeling, cel-cel communicatie en interacties zijn van cruciaal belang voor de oprichting van weefsel en orgaan structuur en functie. In sommige gevallen sluiten deze celcelinteracties organen af van de omringende omgeving om een goede orgaanfunctie te waarborgen. Dit is het geval voor het zenuwstelsel, die is geïsoleerd door de bloed-hersen barrière (BBB). Dysfunctie van de BBB bij mensen is gekoppeld aan neurologische aandoeningen zoals epilepsie, en afbraak van de barrière is waargenomen bij neurodegeneratieve ziekten, waaronder multiple sclerose en Amyotrofische laterale sclerose1. Bij zoogdieren wordt de BBB gevormd door nauwe kruisingen tussen endotheliale cellen2,3. Andere dieren, waaronder de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, hebben een BBB samengesteld uit gliacellen. Deze gliacellen vormen een selectieve permeabele barrière om de beweging van nutriënten, afvalproducten, toxines en grote moleculen in en uit het zenuwstelsel te controleren4. Dit zorgt voor het onderhoud van de elektrochemische gradiënt die nodig is om brand actie potentialen, waardoor mobiliteit en coördinatie4. In D. melanogasterbeschermen de glia het zenuwstelsel tegen de kalium-rijke, bloed achtige Hemolymfe5.
In het centrale zenuwstelsel (CZS) en het perifere zenuwstelsel (PNS) van D. melanogaster, twee buitenste gliale lagen, de subperineurale glia en de perineuriële glia, evenals een buiten netwerk van extracellulaire matrix, de neurale lamella, vormen de Hemolymfe-hersenen en Hemolymfe-zenuw barrière6, aangeduid als de BBB in dit artikel. Tijdens de ontwikkeling subperineuriële glia worden polyploïde en vergroten om het zenuwstelsel te omringen5,6,7,8,9,10,11 . De subperineurale glia vormen septate-kruisingen, die de belangrijkste diffusie barrière tussen de Hemolymfe en het zenuwstelsel5,6,12bieden. Deze kruispunten zijn moleculair vergelijkbaar met de septate-achtige kruispunten gevonden bij de paranodes van myelinerende glia in gewervelde dieren, en ze voeren dezelfde functie als nauwe kruisingen in de BBB van zoogdier13,14, 15 , 16 , 17. de perineuriële glia verdelen, groeien en wikkelen rond de subperineurale glia om de diffusie van metabolieten en grote moleculen6,10,18,19te reguleren. De vorming van BBB is voltooid door 18,5 h na het leggen van eieren (AEL) bij 25 °c5,8. Eerdere studies hebben genen geïdentificeerd die kritische regulatoren zijn van BBB-formatie20,21,22. Om de precieze rollen van deze genen beter te begrijpen, is het belangrijk om het effect van mutatie van deze potentiële regulatoren op BBB-integriteit te onderzoeken. Terwijl eerdere studies hebben geschetst benaderingen voor het aszeggen van BBB integriteit in embryo's en larven, een uitgebreid protocol voor deze assay moet nog worden beschreven5,7. Dit stapsgewijze protocol beschrijft de methoden voor het aszeggen van BBB-integriteit tijdens D. melanogaster embryonale en derde INSTAR larvale stadia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. verzameling van monsters
- Embryo collectie
- Gebruik in elke embryo-opvang kooi minimaal 50 maagdelijke vrouwtjes met 20 − 25 mannetjes voor verzamelingen. Inincuberen deze vliegen in een fles met maïsmeel-agar voedsel (tabel van de materialen) voor 1 − 2 dagen voor aanvang collecties23.
Opmerking: Er kunnen meer vliegen worden gebruikt, maar de verhouding tussen vrouwen en mannen moet op 2:1 worden gehouden. - Pre-warme appelsap agar-platen (tabel 1) bij 25 °c 's nachts.
Opmerking: Dit is nodig voor een goede enscenering van embryo's. Als de platen snel uitdrogen, voeg dan een kom met water toe aan de incubator om de vochtigheid van de kamer te verhogen. - Anesthetize vliegt vanaf stap 1.1.1 met CO2 en transfer vliegt naar een verzamel kooi. Plaats een voorverwarmde appelsap agar-plaat met een kleine uitstrijkje gist pasta aan de open kant en bevestig deze aan de kooi met de rode huls (tafel van materialen). Om oudere embryo's te wissen, laat vliegen om embryo's/eieren op een appelsap agar plaat te leggen voor 1 uur bij 25 °C.
- Haal de opvang kooi uit de incubator. Keer de kooi mesh-zijde naar beneden en tik op vliegen naar de onderkant van de kooi. Vervang de appelsap agar met een nieuwe voorverwarmde appelsap agar plaat met een kleine uitstrijkje gist pasta. Gooi de eerste plaat weg.
- Laat vliegen om embryo's/eieren op de nieuwe appelsap agar plaat te leggen voor 1 uur bij 25 °C. Gooi deze plaat weg na de 1 h-collectie en ga verder naar de volgende stap om embryo's voor injectie te verzamelen.
- Om laat stadium 17 embryo's (20 − 21 h AEL) te verzamelen, mogen vliegen met het gewenste genotype uit stap 1.1.1 − 1.1.5 op een nieuwe voorverwarmde appelsap agar-plaat liggen met een kleine uitstrijkje gist pasta bij 25 °C gedurende 1 uur. leeftijds plaat voor 19 uur in een incubator van 25 °C , dus embryo's zullen 20 − 21 uur oud zijn op het moment van beeldvorming.
Opmerking: Deze stap kan worden herhaald zoals gewenst voor meerdere rondes van monsterverzameling, injectie en imaging. - Verzamel embryo's van platen in een celzeef met een nylon mesh van 70 μm door toevoeging van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% nonionische oppervlakteactieve stof (PBTx; Tabel 1) om het oppervlak van de plaat te bedekken en embryo's van het oppervlak los te maken met een penseel.
- Dechorionaat embryo's verzameld in de celzeef in een 50% bleekmiddel oplossing (tabel 1) in een 100 mm Petri schaaltje gedurende 5 minuten met incidentele opwinding bij kamertemperatuur. Spoel embryo ' 3 ' uit door de celzeef in PBTx in een Petri schaaltje te zwengelen, waarbij elke keer een vers gerecht van PBTx wordt gebruikt.
- Als alle embryo's van het juiste genotype zijn, ga dan direct naar stap 1.1.10. Als het genereren van embryo's van het juiste genotype een kruis met heterozygoot vliegen vereist, selecteert u embryo's van het juiste genotype met behulp van de aanwezigheid of afwezigheid van fluorescently gemarkeerde Balancer-chromosomen. Gebruik een stereomicroscoop met fluorescerende mogelijkheden voor genotype-selectie.
Opmerking: Balancer-chromosomen gemarkeerd met vervormdgeel fluorescerende eiwit; Kruppel-GAL4, UAS-groen fluorescerende proteïne (GFP); en twist-Gal4, UAS-GFP werkt goed voor genotype selectie in de late embryogenese (tabel 2)24,25,26. - Gebruik een glazen pipet en breng embryo's over in PBTx naar een 2% agarose-gelplaat (tabel 1). Verwijder overtollige vloeistof met filtreerpapier. Lijn ~ 6 − 8 embryo's uit op de 2% agarose gelplaat met posterieure aan de rechterkant en de rugzijde naar boven gericht (Figuur 1B).
Opmerking: De micropyle, het kleine gat waardoor spermatozoa het ei binnengaan, bevindt zich aan het voorste uiteinde van het embryo. Het achterste uiteinde is meer afgerond. De luchtpijp is wit en bevindt zich dorsaal in het embryo, waardoor het onderscheid van de rugzijde en de ventrale kanten van het embryo mogelijk wordt (Figuur 1B). - Maak een Slide met één stuk dubbelzijdige tape. Druk stevig op de schuif op de bovenkant van de embryo's om ze over te brengen naar de dubbelzijdige tape.
- De adsorptie van embryo's door incubatie bij kamertemperatuur gedurende ~ 25 min (geen droogmiddel wordt gebruikt). Na het afdrogen, bedek embryo's met Halo koolstof olie.
Opmerking: De droogtijden kunnen variëren afhankelijk van de temperatuur, luchtvochtigheid en ventilatie in de kamer. De incubatietijd moet worden gebruikt om het apparaat voor injectie en de confocale Microscoop voorbeeld vorming op te zetten, zoals beschreven in de punten 2 en 3 van dit protocol.
- Gebruik in elke embryo-opvang kooi minimaal 50 maagdelijke vrouwtjes met 20 − 25 mannetjes voor verzamelingen. Inincuberen deze vliegen in een fles met maïsmeel-agar voedsel (tabel van de materialen) voor 1 − 2 dagen voor aanvang collecties23.
- Larval collectie
- Stel een kruis in met 5 − 10 maagdelijke vrouwelijke vliegen van het gewenste genotype en de helft van zoveel mannetjes van het gewenste genotype in een injectieflacon met maïsmeel-agar Food en inincuberen bij 25 °C23.
- Verzamel na 5 − 7 dagen, afhankelijk van het genotype, zwervende derde instar larven uit de injectieflacon zachtjes met een tang. Spoel larven in 1x PBS om voedsel te verwijderen dat aan de larven vastzit. Breng larven over naar een appelsap agar-plaat voor genotype ring, zoals beschreven in stap 1.1.9 indien nodig.
- Rol larven op een tissue met een penseel om ze af te drogen. Breng 6 − 8 larven over naar een glijbaan, voorbereid met dubbelzijdige tape met behulp van een tang.
2. bereiding van naalden en preparaat injectie
- Trek naalden op een micro pipet trekker voorafgaand aan de inleiding van dit protocol. Veilige capillaire buizen in de naald trekker en trekken volgens de standaard naald vorm en parameters voor D. melanogaster injecties (tabel 3)27. Bewaar naalden in een Petri schaaltje door klei te verankeren tot het gebruik voor injectie.
- Plaats een naald met 5 μL 10 kDa dextran, geconjugeerd met sulforhodamine 101 acid chloride (tabel met materialen) met behulp van een gel-loading pipetpunt van 20 μl gedurende de 25 minuten droog periode voor embryo's (stap 1.1.12), of onmiddellijk na de overdracht van larven naar de glijbaan (stap 1.2.3).
- De naald in een naald houder en positie in een micro manipulator bevestigd aan een stalen basis (tabel van de materialen) te laden.
Opmerking: De naald moet bijna evenwijdig zijn aan de Microscoop-fase voor de injectie van embryo's en schuin naar beneden worden gekanteld voor larvale injecties. - Stel het injectie toestel (tabel met materialen) in op 50 psi, 5 − 10 MS met een bereik van 10.
Opmerking: Het kan nodig zijn deze instellingen te wijzigen voor het gebruik van de betreffende injectie apparatuur. - Plaats de schuif op het podium en de penseel rand van de naald tegen de rand van de dubbelzijdige tape in een hoek van 45 ° om een schuine, gebroken punt te maken.
Opmerking: Voor embryo's is het alleen nodig om de tip genoeg te breken om de 10 kDa dextran te laten stromen. Een perfecte naald heeft een enigszins schuine punt en slechts een kleine druppel kleurstof komt met elke injectie uit. Voor larven is het noodzakelijk om de tip meer te breken, maar met een schuine punt om de larvale Body Wall te penetreren. Er komt een grotere druppel kleurstof uit. - Pomp voetpedaal tot de kleurstof aan de punt van de naald.
- Lijn de naald zodanig uit dat deze evenwijdig is met het embryo of een beetje naar beneden schuin naar de larve wordt gekanteld.
- Beweeg de naald om het achterste uiteinde van het preparaat te prikken en Injecteer het preparaat door het voetpedaal te pompen. Injecteer ~ 2 nL van kleurstof in embryo's, en ~ 220 nL van kleurstof in larven.
Opmerking: Het embryo of de larve moet met kleurstof overspoelen als de injectie succesvol is. - Noteer het tijdstip van injectie voor incubatie doeleinden. Inincuberen embryo's gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Incuberen larven gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Ga door de glijbaan om extra specimens te injecteren en noteer het tijdstip van de injectie voor elk preparaat.
Opmerking: Afhankelijk van de snelheid waarmee daaropvolgende dissectie-en beeldvormings stappen kunnen worden uitgevoerd, kunnen 4 − 8 monsters tegelijk worden geïnjecteerd.
3. bereiding van de monsters voorbeeld vorming
-
Beeldvorming van embryo's
- Maak na de injectie embryo's voorbeeld vorming. Breng Petroleum Jelly met een applicator met katoen punt aan de rechter-en linkerkant van de samples op de glijbaan aan als een afstandhouder om schade aan de embryo's bij het plaatsen van de afdek mantel te voorkomen.
- Beeld monsters met een confocale Microscoop gedurende de diepte van het embryo met een 20x-doelstelling. Bereken het percentage van de totale monsters met de kleurstof die is waargenomen in het ventrale zenuw snoer (VNC) met behulp van de volgende vergelijking:% van de monsters met gecompromitteerde BBB = aantal monsters met kleurstof accumulatie in het VNC/totale aantal monsters.
-
Dissectie en beeldvorming van larven
- Voorbereiden van dia's voor larvale monsters van tevoren. Monteer twee afdek stroken van ongeveer 0,5 cm naast de glijbaan met nagellak.
Opmerking: De dekbonnen functioneren als afstandhouders voor de hersenen, zodat deze tijdens het montage proces niet beschadigd raken. - Na de incubatie van 30 minuten, ontleden de larven in 1x PBS direct op de glijbaan die zal worden gebruikt bij beeldvorming. Gebruik eerst één paar tang om de larve halverwege het larvale lichaam te grijpen en gebruik een tweede paar tang om de voorste en achterste helft van de larve te scheiden.
- Gebruik vervolgens een paar tang om de voorste regio aan de mond haken te grijpen en gebruik een tweede paar tang om de lichaams wand te inverteren over de punt van de Tang die de mond haken aangrijpt. De hersenen en VNC zullen worden blootgesteld.
- Scheid de hersenen en VNC van de lichaams wand door de zenuwen te scheiden, en verwijder de lichaams wand van de glijbaan (Figuur 1C, D). Verwijder imaginale schijven indien gewenst.
- Bedek het monster met 10 μL van 80% glycerol en plaats een dekslip bovenop het monster voorbeeld vorming.
- Beeld door de diepte van het zenuwstelsel weefsel met behulp van een 20x doelstelling. Bereken het percentage van de totale monsters met kleurstof waargenomen in de VNC.
- Voorbereiden van dia's voor larvale monsters van tevoren. Monteer twee afdek stroken van ongeveer 0,5 cm naast de glijbaan met nagellak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven methoden zorgen voor de visualisatie van de integriteit van de BBB in het CZS in D. melanogaster embryo's en larven (Figuur 1). Na voltooiing van BBB formatie in de late embryogenese, de BBB functies om grote moleculen uit de hersenen en VNC5uitsluiten. Dit protocol maakt gebruik van deze functie om BBB-vorming te testen. Wanneer wild-type (Oregon R) laat stadium 17 (20 − 21 h oude) embryo's werden geïnjecteerd met 10 kDa dextran geconjugeerd met sulforhodamine 101 acid chloride fluorescerende kleurstof, werd het grote dextran-molecuul uitgesloten van de VNC, zoals verwacht (Figuur 2A). Om het effect van genetische mutaties op de integriteit van BBB te demonstreren, werden embryo's met mutaties in het ruwe gen gebruikt. Voorheen werd aangetoond dat het onbewerkte gen de onttrekking van de kiem band tijdens de embryogenese regelt, en meer recentelijk is aangetoond dat het in glia functioneert om morfologische veranderingen in de VNC te reguleren tijdens de ontwikkeling28. Heterozygoot RAW1 Mutant EMBRYO'S vertoonden een intact BBB, vergelijkbaar met de resultaten waargenomen in wild-type controle embryo's (Figuur 2B). Daarentegen vertoonden homozygoot RAW1 Mutant embryo's gebreken in de integriteit van de BBB, waarbij 10 kDa dextran-KLEURstof in de VNC overstroomt, wat aangeeft dat de BBB niet vorm kon geven (Figuur 2C). Deze resultaten tonen het vermogen van deze techniek om BBB-vorming te testen tijdens embryonale stadia.
Eerdere studies hebben aangetoond dat een defect in subperineurale glia polyploidization resulteert in een verstoring van de BBB die kan worden waargenomen in derde INSTAR larvale stadia7,9. Dus, defecten in de vorming van BBB en/of onderhoud kan resulteren in een gecompromitteerde BBB in latere stadia van ontwikkeling, waardoor het wenselijk is om de integriteit van de barrière in het derde INSTAR larvale stadium te testen. Daarom is het protocol dat wordt gebruikt voor het aszeggen van BBB-integriteit in embryonale stadia ook geoptimaliseerd voor gebruik in larven. In de Oregon R controlemonsters, 10 kDa dextran niet door dringen de BBB en is uitgesloten van de hersenen en VNC (Figuur 2D, E). De kleurstof accuiteert aan de periferie van de BBB.
Figuur 1: het zenuwstelsel van de fase 17 embryo's en de derde INSTAR larve. A)schematisch beeld van een ventrale weergave van een stadium 17 embryonaal centraal zenuwstelsel (CNS). Het CNS bestaat uit de hersenen (BR) en het ventrale zenuw snoer (VNC), die dorsoventral kanalen (CH) heeft. De micropyle (MP; pijlpunt) aan het voorste uiteinde kan worden gebruikt om het embryo te oriënteren. Posterior aan de rechterkant. B) fase 17 embryo gericht met de rugzijde naar boven en posterieure naar rechts, zoals aanbevolen in stap 1.1.10. Pijlen wijzen naar de luchtpijp. Pijlpunt geeft het MP aan. Posterior aan de rechterkant. C) Schematische werking van het zenuwstelsel in het derde INSTAR larve. De hersenen (BR) en VNC componeren de CNS, terwijl de zenuwen uit te breiden van de VNC Synapse op de spieren van het lichaam van de muur en zijn onderdeel van de PNS. Posterior aan de rechterkant. D) ontleed derde INSTAR larvale brein en VNC. Posterior aan de rechterkant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: bepaling voor de vorming van bloed-hersen barrière (BBB). (a-C) Laat stadium 17 embryo's (20 − 21 h oud) geïnjecteerd posteriorly met 10 kDa sulforhodamine 101 zuurchloride dextran. Posterieur naar beneden. Schaalbalk = 20 μm. Punten die worden gezien in besturingselementen zijn dorsoventral kanalen die het ventrale zenuw snoer (VNC) beslaan. A) controle door de Oregon R. Kleurstof opname in 6,25% van de monsters, n = 16. (B) RAW1/+ -besturingselement op hetzelfde niveau. Kleurstof opname in 6,67% van de monsters, n = 15. C) homozygoot rauwe1/1 mutant. Kleurstof opname in 100% van de monsters, n = 22. D) Oregon R controle derde INSTAR larvale hersenen. Kleurstof accuiteert bij de BBB, maar niet doordringen in het CZS, n = 7. Schaalbalk = 50 μm. E) Oregon R controle derde INSTAR LARVALe VNC. Kleurstof accuiteert bij de BBB, maar niet doordringen in het CZS, n = 11. Stippellijn schetst de VNC. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Midgut morfologie in de late embryonale ontwikkeling. Uitgezonden lichtbeelden van de fase 13 − 17 embryo's maken visualisatie van darm morfologie mogelijk (donkergrijze gebieden in de achterste helft van het embryo). De morfologie van de midgut kan worden gebruikt om de fase van de embryonale ontwikkeling te bepalen, wat nuttig is bij het bepalen of embryo's op gepaste wijze worden gerijpt voor injectie. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Oplossing | Recept |
| 2% agarose gel | Voeg 0,8 g agarose toe aan 40 mL dubbel gedestilleerd H2O (ddH2O) in een erlenmeyer kolf en magnetron om agar op te lossen. Giet in een gelgiet bakje en laat de gel 30 minuten stollen bij kamertemperatuur. |
| Appelsap agar platen | Meet 45 g agar en 1,5 L van ddH2O in een kolf van 4 L. Autoclaaf voor 40 − 45 min bij 121 °C. Meet 50 g suiker en 0,5 L appelsap in een bekerglas van 1 L en roer op laag vuur (instelling 3) om de suiker op te lossen en zorg dat u het niet brandt. Voeg na autoclaven de voorverwarmde suiker en het appelsap toe aan de agar en het water. Roer op laag met de hitte uit om te koelen tot je het aanraken. Voeg 15 mL 70% tegosept toe en roer om te dispergeren. Giet in een bekerglas van 0,5 L. Spray met ethanol om bubbels of vlam te verwijderen met een bunsenbrander. Giet in 60 mm petrischaaltjes. Laat minimaal 24 uur in, of tot er minimaal condensatie is op de deksels van de petrischalen en bewaar bij 4 °C. |
| 50% bleekwater | Voeg 15 mL ddH2O en 15 ml huisvuil in een conische buis toe. |
| 80% glycerol | Voeg voor 10 mL 8 mL geautoclaveerd ddH2O en 2 ml glycerol toe aan een conische buis van 15 ml. Incuberen op een rocker totdat de oplossing homogeen is. |
| 1x PBS | Verdun voor 1 L 100 mL 10x PBS in 900 mL ddH2O. |
| 10x PBS | Los voor 2 L het volgende op in 1.600 mL ddH2O: 160 g NaCl, 4 g kcl, 28,8 g na2hpo4en 4,8 g van KH2po4. Stel de pH in op 7,5 met HCl. |
| PBTx (PBS + 0,1% nonionische oppervlakteactieve stof) | Combineer voor 1 L 100 ml 10x PBS, 10 ml 10% nietionogene oppervlakteactieve stof en 890 ml DDH2O. |
| 70% tegosept | Meng 1 g p-hydroxybenzoinezuur, methyl ester voor elke 10 mL 100% ethanol. Bewaren bij-20 °C. |
| 10% nonionische oppervlakteactieve stof | Voeg voor 50 mL 45 mL geautoclaveerd ddH2O en 5 ml nonionische oppervlakteactieve stof toe aan een conische buis. Draai op de rocker totdat de oplossing homogeen is. |
| Gist pasta | Meng droge actieve gist met ddH2O in een 50 ml plastic bekerglas tot het glad is. |
Tabel 1: reagentia en buffers die in dit protocol worden gebruikt.
| Genotype | Voorraad |
| w [1118]; LN (2LR) GLA, WG [GLA-1]/CyO, P {w [+ mC] = GAL4-Twi. G} 2.2, P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} AH 2.2 | Bloomington #6662 |
| w {*]; SNA [SCO]/CyO, P {w [+ mC] = DFD-EYFP} 2 | Bloomington #8578 |
| w {*]; L [2] PIN [1]/CyO, P {w [+ mC] = GAL4-kr. C} DC3, P {w [+ mC] = UAS = GFP. S65T} DC7 | Bloomington #5194 |
| DF (1) JA27/FM7c, P {w [+ mC] = GAL4-kr. C} DC1, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC5, SN [+] | Bloomington #5193 |
| w [*]; Ry [506] Dr [1]/TM6B, P {w [+ MC] = DFD-EYFP} 3, SB [1] TB [1] CA [1] | Bloomington #8704 |
| y [1] w [*]; D [*] gl [3]/TM3, P {w [+ mC] = GAL4-kr. C} DC2, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC10, SB [1] | Bloomington #5195 |
| Oregon R | Meerdere stammen beschikbaar |
| RAW [1] CN [1] BW [1] SP [1]/CyO | Bloomington #2749 |
| P {w [+ mW. HS] = GawB} elav [C155] | Bloomington #458 |
| w [1118]; P {w [+ m *] = GAL4} repo/TM3, SB [1] | Bloomington #7415 |
| P {UAS-GFP} | Meerdere stammen beschikbaar |
Tabel 2: vliegen stammen. Vliegen stammen besproken in dit protocol. Het voorraad nummer van Bloomington Drosophila Stock Center wordt indien van toepassing verstrekt.
| Cyclus | Warmte | Trekken | Snelheid | Tijd | Druk | Helling |
| 1 | 590 | 115 | 15 | 250 | 600 | X |
| 2 | 575 | 130 | 60 | 250 | 600 | X |
Tabel 3: instellingen van de trekker micropipetten. Micropipet trekker-instellingen gebruikt voor het genereren van naalden voor injectie in dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol bevat een uitgebreide beschrijving van de stappen die nodig zijn om de integriteit van BBB te testen tijdens de late embryonale en derde INSTAR larvale stadia van de ontwikkeling van D. melanogaster . Soortgelijke benaderingen zijn elders beschreven om te testen van de integriteit van de BBB tijdens de ontwikkeling, evenals in volwassen stadia5,7,29,30. Beschrijvingen van procedures in materialen en methoden zijn echter vaak breed van aard en hebben onvoldoende Details voor een eenvoudige implementatie, waardoor aanzienlijke probleemoplossing voor de onderzoeker noodzakelijk is. Dit protocol bevat een uitgebreide beschrijving van de stappen die nodig zijn om de integriteit van BBB te testen tijdens embryonale en larvale stadia. In elke fase, er zijn kritische stappen moeten worden gevolgd om ervoor te zorgen dat de juiste fase van de ontwikkeling wordt onderzocht en weefsel architectuur wordt niet verstoord, die de BBB zou kunnen compromitteren. Om succes te behalen in deze benaderingen was het noodzakelijk om meerdere stappen van het protocol op te lossen om nauwkeurige resultaten te leveren. Kritieke stappen in de embryonale en larvale protocollen worden hieronder beschreven.
Eerdere studies hebben gemeld de oprichting van de BBB door 18,5 h AEL5. Om een nauwkeurige ontwikkelings timing te garanderen, is het belangrijk om monsters op een constante temperatuur te houden tijdens het verouderen. Bij het verzamelen van embryo's moeten de appelsap agar-platen vóór de inzameling tot 25 °C worden gebracht. Het gebruik van appelsap platen die niet vooraf zijn opgewarmd resulteert in een tragere ontwikkeling en kan monsters opleveren die nog geen BBB hebben vastgesteld en daarom accumulatie van 10 kDa dextran in het zenuwstelsel vertonen. Als zodanig, het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het injecteren van monsters die ouder zijn dan 18,5 h. Bovendien moet bij het uitvoeren van deze experimenten in embryo's rekening worden houden met de mogelijkheid van een vertraging in de ontwikkeling, omdat een dergelijke vertraging eenvoudigweg kan resulteren in de latere oprichting van de BBB. Om rekening te kunnen hebben gehouden met mogelijke ontwikkelings vertragingen, werden monsters getest op 20 − 21 h AEL, iets na gerapporteerde BBB-vorming. Met behulp van de morfologie van andere weefsels, in het bijzonder de ontwikkelende midgut, kan helpen bij het vaststellen van de juiste fase van de ontwikkeling van het embryo dat wordt onderzocht (Figuur 3). Omgekeerd kan een onjuiste experimentele timing resulteren in monsters die al motiel zijn en het broed proces zijn begonnen. Om het aantal larven te verminderen dat al is begonnen met uitkomen, is het belangrijk om minimaal twee 1 h-verzamelingen uit te voeren om oudere embryo's van vrouwtjes te wissen voordat embryo's voor injectie worden verzameld. Als analyse van de BBB in eerste instar larven gewenst is, kan een korte incubatie van larven in 1x PBS in een 9-well gerecht op ijs worden gebruikt om de beweeglijkheid vóór injectie te verminderen. Dia's kunnen tijdens de injectieprocedure ook op een ijspop worden gehouden om de beweeglijkheid te verminderen.
Om de kwaliteit van de beelden en accurate resultaten met betrekking tot de oprichting van de BBB in het embryo te waarborgen, moeten tijdens de gehele procedure extra stappen worden gevolgd. Bij het uitrijden van embryo's op de agar-plaat moet de luchtpijp naar boven worden gericht, aangezien dit de rugzijde van het embryo is (Figuur 1B). Wanneer de embryo's worden overgebracht naar de dia met de dubbelzijdige tape, wordt de ventrale zijde van het embryo naar boven gericht, waardoor een optimale visualisatie van het zenuw snoer mogelijk wordt tijdens confocale beeldvorming verderop in het protocol. Embryo's moeten ook veilig worden vastgehouden aan de dubbelzijdige tape om de beweging tijdens de injectie te remmen. Het gebruik van een plat 2% agarose pad stelt de onderzoeker in staat om de glijbaan met de dubbelzijdige tape stevig op de embryo's te duwen tijdens het overdrachtsproces zonder gevaar voor beschadiging van de embryo's. Na overbrenging naar de glijbaan is uitdroging noodzakelijk om te voorkomen dat het embryo op de injectie van de kleurstof barst. Injectie van te veel kleurstof kan ook leiden tot het barsten van het embryo. Het is belangrijk om alleen de naald in het embryo te steken genoeg om de kleurstof te injecteren, maar niet zozeer dat de naald het zenuwstelsel mogelijk doorprikken, wat een vals positief resultaat zou geven. Te groot van een punctie wond kan ook leiden tot de Hemolymfe en de kleurstof stroomt uit het embryo, wat leidt tot een mislukte experiment. Met deze potentiële valkuilen in gedachten, is de injectie het meest succesvol met een naald die een lichte hoek heeft tot de punt, zodat er een klein punt is waarmee het embryo zorgvuldig kan worden doorprikken.
In het geval van asgezegde larven voor BBB-integriteit, kunnen er uitdagingen ontstaan door de beweeglijkheid van het monster. Het gebruik van hoogwaardige dubbelzijdige tape is van cruciaal belang, omdat het effectief moet zijn in het immobiliseren van larven voor injectie. Als de larve niet vastloopt, kan deze worden teruggedraaid op de tape en zachtjes omlaag geduwd om het te resecure. Bij het transporteren van larven voor injectie, is het handig om de glijbaan in een Petri schaaltje te dragen voor het geval de larven niet meer vast komen te zitten. De stappen na de injectie vereisen de meeste zorg om verstoring van de BBB te voorkomen. Om mogelijke schade aan het monster te minimaliseren, is het het gemakkelijkst om het monster direct te ontleden op de dia's die worden gebruikt voorbeeld vorming. Als de larve sterk wordt gehecht aan de tape bij het overbrengen van het monster voor dissectie, kan een druppel 1x PBS aan de tape worden toegevoegd om de hechting los te maken en om de overdracht naar de dia voor dissectie mogelijk te maakt. Na de sectie is het belangrijk om het monster voldoende plat te maken om vals-positieve resultaten te voorkomen, maar niet zozeer dat de integriteit van het monster in het gedrang komt. De larve tussen de dekglaasje en de glijbaan met behulp van extra dekstroken als spacers voorkomt dat de hersenen worden beschadigd, maar immobiliseert het monster voor effectieve beeldvorming.
Om succes te behalen met protocollen voor zowel embryo's als larven, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het injectie apparaat en de confocale Microscoop worden ingesteld voordat de monsterverwerking begint. Dit zorgt voor een nauwkeurige timing in de beeldvorming van monsters, die nodig is voor de vergelijking van de steekproef. Andere benaderingen hebben meer geavanceerde injectie-set-ups gebruikt, waarbij een omgekeerde Microscoop is ingesteld voor embryo injectie. Dit protocol maakt gebruik van een standaard ontleed Microscoop en micro manipulator met een drukregelaar. In dit geval was een injectie met zebravis eenvoudig aangepast voor injectie van vlieg embryo's en larven. Dit protocol kan verder worden vereenvoudigd om ook een micromanipulator met een injectiespuit te gebruiken. Veel van deze tools zijn beschikbaar in de biologie afdelingen en kunnen zelfs beschikbaar zijn in de klaslokaal laboratorium instellingen, waardoor het maximale gemak van het protocol implementatie.
Tijdens de beeldvormings procedure kan het handig zijn om de cellen van het zenuwstelsel te labelen om gemakkelijker de gewenste regio voorbeeld vorming te identificeren. Concreet zou men het GAL4/UAS systeem kunnen gebruiken om GFP te uiten in neuronen of glia, met behulp van respectievelijk de elav-GAL4 of repo-GAL4 stammen (tabel 2)31,32,33. Dergelijke labeling zou een contrast met de sulforhodamine 101 acid chloride dextran om de integriteit van het zenuwstelsel te visualiseren.
Hoewel deze methode is gericht op het aszeggen van de integriteit van de BBB tijdens de ontwikkeling van D. melanogaster, deze aanpak kan worden aangepast om te onderzoeken van de integriteit van andere barrières in een verscheidenheid van organismen en weefsels. Bijvoorbeeld, soortgelijke protocollen zijn gepubliceerd voor het aszeggen van de BBB in muizen34. Bovendien, permeabiliteit van de bloed-oogbarrière en de somatische barrière rond de kiemcellen tijdens de spermatogenese in D. melanogaster gebruik maken van een soortgelijke aanpak29,35. Het protocol kan ook worden aangepast voor gebruik in andere weefsels om de permeabiliteit te testen, ook in de darm. Bij de aanpassing van dit protocol voor gebruik in andere weefsels of soorten, moet rekening worden houden met de grootte van moleculen die de barrière kunnen binnendringen, omdat het haalbaar is dat 10 kDa dextran klein genoeg is om enkele barrières in te dringen. Over het algemeen biedt dit protocol een stapsgewijze procedure om te testen op de integriteit van BBB tijdens de ontwikkeling van D. melanogaster , die gemakkelijk kan worden aangepast voor gebruik in andere instellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. F. Bryan Pickett en Dr. Rodney Dale voor het gebruik van apparatuur voor injectie. Dit werk werd gefinancierd door onderzoeksfinanciering van Loyola University Chicago naar M.D., D.T. en J.J.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
References
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J.
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
