Summary
هنا ، ونحن وصف تنفيذ وتفسير نتائج الفحص الكمي في المختبر ماموسفيري الذاتي تجديد.
Abstract
وتتميز الغدة الثديية بقدره التجديد واسعه النطاق ، كما انه يمر من خلال التغيرات الهرمونية الهائلة طوال دوره حياه الأنثى. يتم دراسة دور الخلايا الجذعية الثديية (MaSCs) علي نطاق واسع في السياق الفسيولوجي/التنموي وفيما يتعلق بسرطان الثدي. في هذا الجانب ، الدراسات المجرية السابقة تركز علي خصائص MaSC مطلوبه للغاية بعد. وتمثل الثقافات الماموسفيريه بديلا لتشكيل الأعضاء وأصبحت أداه قيمه للبحوث الاساسيه والانتقالية علي حد سواء. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتوليد الثقافات ماموسفيري الاوليه murine وكميه من خصائص النمو MaSC. ويشمل البروتوكول جمع الغدد الثديية والهضم ، وعزل الخلايا الظهاريه الثديية الاوليه (MECs) ، وإنشاء الثقافات الماموسفيريه الاوليه ، والمرور التسلسلي ، وتحديد الكمية من معلمات النمو الماموسفيري وتفسير النتائج. وعلي سبيل المثال ، فاننا نقدم تاثير التعبير Myc التاسيسي المنخفض المستوي علي الmecs العادية مما يؤدي إلى زيادة التجديد الذاتي والانتشار.
Introduction
وأصبحت العزلة والثقافة في المختبر من الجذعية الظهاريه الثديية والخلايا سلف ضرورية لفهم خصائصها في علم الاحياء الخلية الثديية. وقد مكنت التتبع السلالة الانيقه والمقايسات زرع المسلسل دراسة الخلايا الجذعية (SCs) والفرعية الانسجه الأخرى في سياق الخاصة بهم في مكانه الجسم الحيوي. ومع ذلك ، فان هذا النهج يستغرق وقتا طويلا ويتطلب توليد نماذج الماوس مراسل1،2،3،4،5. ولذلك ، في المختبر الثقافة وانتشار الخلايا الجذعية الثديية (mascs) في حين تجنيب الميزات الرئيسية ستيمنس ، وهي التجديد الذاتي والقدرة علي التمايز ، هو واحد من أكبر التحديات في هذا المجال. في السنوات الاخيره ، وقد استخدمت علي نطاق واسع ماموسفيري مقايسة لنمذجة كل من الانسجه الثديية العادية ونمو سرطان الثدي ، لتحديد الكمية الطبيعية أو السرطان SCs (cscs) وتقييم قدرتها علي التجديد الذاتي كمراسل بديل لنشاطهم في كل منهم في سياق فيفو6،7،8،9،10،11.
الفحص الماموسفيري هو نهج فعال من حيث التكلفة ، حيث يتم استزراع الخلايا الظهاريه الثديية المعزولة حديثا (MECs) في ظروف غير ملتصقة ، مع فرضيه ان MaSCs فقط سوف البقاء علي قيد الحياة وتشكيل المجالات في التعليق في حين ان جميع أنواع الخلايا الأخرى سوف يموت من قبل anoikis. وعلاوة علي ذلك ، فان القدرة علي تشكيل عده أجيال من الماموسفيريس في الممرات المتسلسلة غير الملتصقة ترتبط بقدره التجديد الذاتي لل mascs6،9،11. هنا ، ونحن وصف بروتوكول مفصل من الفحص الكمي ماموسفيري ، الذي تم تطويره في البداية من قبل dontu والزملاء7 كتعديل للفحص العصبي الرائد12، مما يتيح نمو SCs المفترضة في غير ملتصقة ، والظروف خاليه من المصل مع أضافه عوامل النمو المناسبة7،12.
Protocol
في الجسم الحي أجريت الإجراءات وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 وبعد الحصول علي موافقه من لجنتنا الاخلاقيه المؤسسية (كائن لرفاه الحيوانية-OPBA) ووزارة الصحة الايطاليه (IACUC أرقام 762/2015 و 537/2017).
1. جمع الغدد الثديية murine والهضم
- لتجربه نموذجيه ، والتضحية 8-10 أسابيع القديمة الإناث الفئران العذراء من قبل CO2 استنشاق. اعتمادا علي أهداف التجربة ، استخدم 5-30 الفئران. وضع الفئران علي لوحات التشريح تحت غطاء محرك المنزل. استخدام الابر لتمتد الأطراف الاماميه ويغسل الفراء من الحيوانية مع الايثانول.
- ارفع الجلد بملقط وقم باجراء شق عمودي يبدا من مستوي منطقه الحوض وينتقل إلى عنق الرحم ، تاركا الصفاق سليما. لتجنب تمزق الجلد أو الصفاق ، استخدم مقص مستدير الحواف.
- افصل الجلد بعناية من الجسم مع حركات لطيفه من المقص عبر المحور الجانبي للجسم.
- مره واحده يتم فصل الجلد تماما من منطقه الصدر والبطن ، وأداء أربعه شقوق عبر الأطراف الاربعه من الحيوانية ودبوس أسفل الجلد مع الابر. استخدم المقص والملقط لفصل جسم الحيواني تماما عن الجلد الممتد.
- استخدام ملقط لرفع بلطف منصات الدهون الثديية التي تتعرض الآن بشكل كامل وفصلها بعناية من الجلد مع المعونة من المقص. جمع الغدد الثديية الصدرية والبطن السفلي من كل ماوس وتزج بها في الفوسفات دولبيكو المحلول الملحي المخزنة (DPBS) ، في أنبوب مخروطي 50 mL. جمع ما يصل إلى 20 الغدد لكل أنبوب. الحفاظ علي الانسجه علي الجليد.
ملاحظه: إذا لزم الأمر ، يمكن ان تبقي الغدد علي الجليد بين عشيه وضحيها. هذه نقطه توقف أمنه. يجب ان يتم تنفيذ الخطوات التالية في ظروف معقمه. - اعداد وتصفيه المتوسطة الهضم: دولبيكو المتوسطة النسر المعدلة (DMEM) تستكمل مع 2 مم الجلوتامين ، 100 U/mL البنسلين ، 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين ، 200 U/mL كولاجيناز و 100 ميكروغرام/مل الهيلونيداز (انظر جدول المواد).
- نقل ما يصل إلى 20 الغدد إلى طبق بيتري 100 مم والمفروم الانسجه باستخدام مشرط أو مقص المنحني. تجنب نقل كميات كبيره من DPBS إلى الطبق.
- أضافه 10 مل من متوسط الهضم إلى كل طبق بيتري ونقل الانسجه المفرومة إلى أنبوب مخروطي 50 مل ، وذلك باستخدام ماصه المصلية 25 مل.
- ختم الأنابيب مع بارافيلم ووضعها علي المدورة. تعيين المدورة بسرعة منخفضه (0.03 x g) واحتضان ل 2.5 h في 37 درجه مئوية في جو رطب يحتوي علي 5 ٪ CO2.
- افحص التعليق بصريا قبل الانتقال إلى الخطوات التالية. إذا كانت قطع كبيره من الانسجه لا تزال غير مهضومه ، وأطاله فتره الحضانة في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه أخرى.
ملاحظه: كبديل ، يمكن ان يؤديها الهضم بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2، وذلك باستخدام لطيف كولاجيناز/حمض الهيالورونيك مزيج الانزيم13.
2. عزل الابتدائية Murine MECs
- وقف المدورة وأزاله الأنابيب من الحاضنة. اضبط طرف P1000 عند فتحه ماصه مصليه 5 مل. إذا كان التعليق يمر عبر تلميح P1000 ، انتقل إلى الخطوات التالية. والا ، وأطاله فتره الحضانة في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه أخرى.
- أجهزه الطرد المركزي في 100 x g، لمده 5 دقائق في 4 درجه مئوية. صب بعناية و ماده طافي وأعاده تعليق بيليه من كل أنبوب في 3 مل من dpbs.
ملاحظه: تسمح السرعة المنخفضة لطرد بازاله الخلايا اللمفاوية والانسجه الدهنية. مطلوب التلاعب لطيف لتجنب التفكك بيليه في هذه الخطوة. - تصفيه تعليق الخلية في كل أنبوب علي حده ، وذلك باستخدام 100 ، 70 و 40 μm الخلية strainers. في كل خطوه التصفية ، وغسل مصافي مع 2 مل من dpbs قبل جمع المرور.
ملاحظه: ومن هذه النقطة ، يمكن تجميع تعليقات الخلية ومعالجتها معا. - أجهزه الطرد المركزي في 300 x g، لمده 5 دقائق في 4 درجه مئوية. بعناية التهاوي الفائق وأعاده تعليق الخلايا في الحجم المتبقي من DPBS.
- انتقل إلى خليه الدم الحمراء (ربك) تحلل عن طريق أضافه كميه متساوية من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) تحلل العازلة (انظر جدول المواد). امزجها بالأنابيب وحضنها علي الجليد لمده تصل إلى 5 دقائق.
- أضافه 10 مل من DPBS وأجهزه الطرد المركزي في 300 x g، لمده 5 دقائق في 4 درجه مئوية. صب بعناية و ماده طافي وفحص بصريا بيليه. إذا كان بيليه ابيض ، انتقل إلى الخطوة التالية. والا كرر خطوه تحلل ار بي سي (الخطوة 2.5).
- أعاده تعليق بيليه الخلية في 1-5 mL من وسائل الاعلام ماموسفيري: الثدي الخلية الظهاريه نمو القاعدية المتوسطة (MEBM) ، تستكمل مع 2 مم الجلوتامين ، 100 U/mL البنسلين ، 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين ، 5 ميكروغرام/مل الانسولين ، 0.5 ميكروغرام/مل هيدروكورتيزون ، 2 ٪ B27 ، 20 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة (EGF) ، 20 نانوغرام/مل عامل النمو الليفي الاساسيه (bFGF) و 0.4 وحده دوليه/مل الهيبارين (انظر جدول المواد)
3. ماموسفيري التسلسلي أعاده الطلاء
- لإنشاء الثقافات ماموسفيري ، لوحه الخلايا علي الثقافة غير الانسجه المعالجة (التصاق فائقه منخفضه) 6-حسنا لوحات في كثافة 200,000 خلايا قابله للحياة/مل في ماموسفيري المتوسطة. حضنت الخلايا ل 7-10 أيام في 37 [ك], 5% [كو]2.
- اعداد وتصفيه 1 ٪ من الحل بولي هيما في 95 ٪ الايثانول (انظر جدول المواد). معطف التصاق منخفضه جدا 6-حسنا لوحات للممرات التالية ، عن طريق أضافه 400 μL من 1 ٪ من محلول بولي هيما في البئر والسماح الايثانول لتجف تماما. للحصول علي نتائج أفضل ، كرر الطلاء مرتين.
ملاحظه: استخدام لوحات غير المغلفة خلال الممر الأول يسمح بازاله انتقائية من الخلايا الليفية من الثقافة. - في نهاية 7-10 أيام الثقافة ، وجمع الماموسفيريس الاساسيه من جميع الآبار وأجهزه الطرد المركزي في 300 x g، لمده 5 دقائق في 4 درجه مئوية.
- بعناية التهاوي الفائق والمضي قدما إلى التفكك الميكانيكي لماموسفيريس باستخدام ماصه P200 مع نصائح المصفاة. ماصه لحوالي 100 مرات وفحص بصريا تعليق لوجود خزان كبيره.
ملاحظه: حضانة قصيرة (2-5 دقيقه) من الكره بيليه في حجم منخفض (0.2-0.5 mL) من التريبسين أو Accutase في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2، يمكن استخدامها لتسهيل التفكك الميكانيكي. اعداد ماموسفيري الطازجة المتوسطة (الخطوة 2.7) لطلاء كل ممر. - أعاده التعليق في 1-5 مل من المتوسطة ماموسفيري الطازجة وحساب الخلايا قابله للحياة. إذا كان ذلك ممكنا ، تقسيم الخلايا في مجموعات العلاج أو الظروف الثقافية.
- لوحه 20,000 قابله للحياة الخلايا/مل علي بولي هيما المغلفة الترا--منخفضه التصاق 6--حسنا لوحات واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
ملاحظه: ماموسفيريس تصل إلى حجمها الأقصى في غضون 5-7 يوما بعد الطلاء الخلية. عندما يكون ذلك ممكنا ، وتوزيع خلايا كل عينه أو شرط لآبار متعددة للحصول علي نسخ متماثلة التقنية. يجب ان تبقي كثافة الطلاء منخفضه لتجنب تراكم الخلايا. ويوصي بحد اقصي 20,000 خلايا/مل للوحات 6-حسنا و 5,000 خلايا/مل للوحات 24-حسنا. - بعد 5-7 أيام ، عد عدد المجالات لكل بئر. ويمكن ان يتم ذلك اما يدويا ، وذلك باستخدام مجهر مجهز بعدسه تكبير 10x ، أو باستخدام تحليل الصور الرقمية (انظر الخطوة 4).
- جمع ماموسفيريس كل بئر بشكل منفصل والطرد المركزي في 300 x g، لمده 5 دقائق في 4 درجه مئوية.
- بعناية التهاوي الفائق والمضي قدما إلى التفكك الميكانيكي لماموسفيريس باستخدام ماصه P200 مع نصائح المصفاة. ماصه لحوالي 100 مرات وفحص بصريا تعليق لوجود خزان كبيره.
- أعاده التعليق في 1 مل من الماموسفيري الطازجة المتوسطة وحساب الخلايا قابله للحياة. تجمع خلايا كل عينه أو شرط وكرر الخطوات 3.6-3.10. تسجيل عدد من الخلايا المطلية وعدد من المجالات والخلايا تحسب لكل بئر لكل مقطع. انتقل إلى الخطوة 5 لحساب النمو التراكمي.
4. التعداد الكروي باستخدام تحليل الصور الرقمية (DIA)
- في نهاية كل مقطع ، امسح السطح الكامل لجميع الآبار واحصل علي صور للمجالات باستخدام كاميرا رقميه مثبته علي منظار فراغي. حفظ الصور كملفات .tif.
- استيراد صور المنظار الفراغي كتسلسل صور باستخدام imagej14. تعيين المقياس ونوع الصورة إلى 8 بت.
- تكرار كومه من الصور وحدد طرح الخلفية من عمليه علامة التبويب علي شريط القوائم. تحقق من الخيارات ضوء الخلفية وانزلاق منحيات وانقر علي زر OK. معالجه كافة الصور من المكدس.
- حدد ضبط ثم العتبة من صوره علامة التبويب لشريط القوائم. من خلال النقر علي تطبيق، سوف تظهر نافذه الحوار بعنوان تحويل المكدس إلى ثنائي . حدد الافتراضي كاسلوب والضوء كخلفيه. تحقق من مربع حساب عتبه لكل صوره وانقر علي زر OK.
- حدد بالتسلسل مستجمعات المياهالأوامر ، فتح وتاكل من القائمة الثنائية ضمن عمليه علامة التبويب من شريط القوائم. معالجه جميع الصور من المكدس عن طريق النقر علي زر نعم من مربع الحوار الذي يظهر.
ملاحظه: تسمح هذه العمليات بالتقسيم المرئي للكائنات التي تعمل باللمس وتجانس الكائنات وأزاله البيكسلات من حافه الكائنات. - حدد وظيفة تحليل الجسيمات من القائمة تحليل. تعيين عتبه الحد الأدنى للحجم في 10,000 μm2 ودائريه بين 0.50 و 1.00. حدد خيارات الحذف من القائمة المنسدلة إظهار . الاختيار تلخيص، واستبعاد علي الحواف وفي الموقع إظهار وانقر علي زر موافق. معالجه كافة الصور من المكدس.
- فحص بصريا المراسلات من الحذف مع المجالات ، وإذا لزم الأمر ، تصحيح عدد الجسيمات وفقا لذلك. جمع التهم من جميع الإطارات من كل بئر للحصول علي العدد الإجمالي لماموسفيريس لكل بئر.
5. حساب منحني النمو التراكمي
ملاحظه: وعدد الماموسفيريس التي تحسب في كل بئر في نهاية كل مقطع (Pn) يعكس عدد الخلايا الماموسفيريه التي تم البذر فيها في بداية Pn.
- لكل مقطع (PN) ، سجل عدد الخلايا المطلية وعدد الخلايا والمجالات المحسوبة لكل بئر. حساب حجم الكره في نهاية كل مقطع:
حجم المجال Pn (الخلايا/المجال) = عد الخلايا pn /المجالات تحسب pn
ملاحظه: حجم المجال في Pn هو مقياس للإمكانيات التكاثرية لكل خليه ماموسفيريه البدء في المصنفة في pn. - الاستدلال علي عدد من المجالات مطلي عن طريق تقسيم عدد من الخلايا المطلية ل Pn حسب حجم المجال المحسوب في نهاية المقطع السابق (pn-1):
المجالات مطلي Pn = الخلايا مطلي pn /حجمالمجال p n-1
ملاحظه: باتفاق, المجال افترضت حجم ثابته اثناء الممر اولي من الثقافة ([اي.], مجال حجم [ب]0 = مجال حجم [ف]1). إذا تم استخدام الآبار المتعددة كنسخ متماثلة التقنية ، استخدم متوسط حجم المجال في PN-1 كالمقام. - حساب الخلية التراكمية ورقم المجال لكل بئر لكل مقطع:
العدد التراكمي Pn = (عدد pn /مطلي pn) Xالعدد التراكمي p n-1.
ملاحظه: حسب الاتفاقية ، الرقم التراكمي P0 = مطلي p1. إذا تم استخدام الآبار المتعددة كنسخ متماثلة التقنية ، حساب متوسط العدد التراكمي لكل عينه أو شرط لكل مقطع. - ارسم نقاط البيانات علي مقياس شبه لوغاريتمي. عرض رقم الممر (P0 إلى pN) علي المحور س (المقياس الخطي) والخلية التراكمية أو رقم المجال علي محور y (المقياس اللوغاريتمي).
- تناسب خط الاتجاه الاسي إلى نقاط البيانات وحساب معامل التحديد (R2) لقياس الخير من نوبة.
ملاحظه: يجب ان يكون خط الاتجاه المزود بنقاط البيانات تقريبيا لمنحني اسي ، كما هو متوقع لعدد الخلايا الذي ينمو أو يموت بمعدل ثابت. ياخذ R2 القيم بين 0 و 1 ، مع القيم الأقرب إلى 1 تشير إلى احتواء أفضل. - تصور معادله خط الاتجاه كداله أسيه طبيعيه لاستنتاج معدل النمو (GR) للثقافة:
y = y0 e(GR) x، حيث y0 هي قيمه y عند x = 0.
Representative Results
Myc التعبير الفوقي في MECs العادية ، يؤدي إلى زيادة وتيره الخلايا ماموسفيري البدء. ويتحقق ذلك من خلال اليه مزدوجة: Myc يزيد من معدل MaSC الانقسامات متناظرة وتواتر أعاده برمجه السلف في Masc جديده11. لاختبار تاثير التعبير Myc التاسيسيه منخفضه ، استخدمنا نموذج الماوس Rosa26-Myc المعدلة وراثيا ، والتي يمكن ان يسببها النشاط Myc بواسطة 4-هيدروكسي تاموكسيفين (4-OHT)15. نحن أولا مطلي MECs علي التصاق منخفضه جدا لوحات 6-حسنا لأزاله الخلايا الليفية ، في غياب 4-OHT. بعد الممر الأول ، ونحن تقسيم الثقافة في اثنين: تم الحفاظ علي اثنين من الآبار غير المعالجة (السيطرة) وعولجت اثنين من الآبار مع 200 nM 4-OHT (MycER). أحصينا المجال وأرقام الخلايا من 5 مقاطع متتالية لثلاث تجارب مستقله (الجدول 1). وتظهر في الجدول 2أرقام الخلايا والمجالات التراكمية لكل مقطع. الاستقراء مع 4-OHT يؤدي إلى زيادة المجال ومعدلات نمو الخلايا ، كما هو مبين في الشكل 1.
الشكل 1: النتائج التمثيلية. المجال التراكمي (ا) والخلية (ب) منحنيات النمو التحكم والماموسفيريس العضلي. ويظهر الانحراف المعياري والمتوسط ل 3 تجارب مستقله. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| 1st تصفيح | 2nd الطلاء | الطلاء الثالث | 4th تصفيح | 5 الطلاء الخامس | ||||||||||||
| الخلايا مطلي | عدد الخلايا | عدد المجالات | الخلايا مطلي | عدد الخلايا | عدد المجالات | الخلايا مطلي | عدد الخلايا | عدد المجالات | الخلايا مطلي | عدد الخلايا | عدد المجالات | الخلايا مطلي | عدد الخلايا | عدد المجالات | ||
| Exp1 | التحكم | 77,000 | 50,000 | 31 | 65,000 | 58,500 | 41 | 57,000 | 30,000 | 32 | 30,000 | 22,000 | 5 | 22,000 | 0 | 0 |
| 77,000 | 81,000 | 41 | 65,000 | 55,000 | 23 | |||||||||||
| MycER | 77,000 | 31, 0000 | 193 | 80,000 | 375,000 | 323 | 80,000 | 380,000 | 217 | 80,000 | 220,000 | 223 | 80,000 | 170,000 | 155 | |
| 77,000 | 110,000 | 142 | 80,000 | 505,000 | 396 | 80,000 | 270,000 | 149 | 80,000 | 290,000 | 194 | 80,000 | 250,000 | 160 | ||
| Exp2 | التحكم | 75,000 | 75,000 | 71 | 60,000 | 17,000 | 34 | 28,000 | 45,000 | 29 | 45,000 | 13,000 | 2 | 13,000 | 0 | 0 |
| 75,000 | 47,000 | 45 | 60,000 | 11,000 | 47 | |||||||||||
| MycER | 75,000 | 200,000 | 188 | 80,000 | 225,000 | 277 | 80,000 | 230,000 | 155 | 80,000 | 210,000 | 211 | 80,000 | 100,000 | 95 | |
| 75,000 | 250,000 | 192 | 80,000 | 202,500 | 283 | 80,000 | 305,000 | 185 | 80,000 | 160,000 | 237 | 80,000 | 100,000 | 133 | ||
| Exp3 | التحكم | 82,500 | 130,000 | 121 | 80,000 | 45,000 | 105 | 80,000 | 110,000 | 86 | 80,000 | 58,500 | 75 | 58,500 | 58,500 | 78 |
| 82,500 | 125,000 | 177 | 80,000 | 71,250 | 42 | |||||||||||
| MycER | 82,500 | 325,000 | 457 | 80,000 | 610,000 | 327 | 80,000 | 367,000 | 309 | 80,000 | 500,000 | 260 | 80,000 | 115,000 | 146 | |
| 82,500 | 475,000 | 463 | 80,000 | 455,000 | 392 | 80,000 | 415,000 | 204 | 80,000 | 470,000 | 295 | 80,000 | 185,000 | 161 | ||
الجدول 1: عدد المجالات المحسوبة وعدد الخلايا المطلية والمحسوبة في كل ممر.
الجدول 2: حساب أرقام المجالات المطلية والنطاق التراكمي وأرقام الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الجدول. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
Discussion
هنا ، ونحن وصف بروتوكول لوصف كمي لخصائص النمو MaSC في المختبر. علي سبيل المثال ، نقدم تاثير التعبير Myc التاسيسيه منخفضه المستوي علي MaSCs العادية murine. بيد ان هذا النهج يمكن تطبيقه بالتساوي علي سياقات مختلفه. ويمكن استزراع الخلايا الاساسيه البشرية أو الاوليه ، فضلا عن الخطوط الخلوية الثابتة ، في الظروف المستقلة لإرساء الثقافات الماموسفيريه التي يمكن المرور بها بشكل متسلسل. ويمكن إدخال التعبير الفوقي للجينات وتداخل الحمض الريبي النيبالي بسهوله في البروتوكول مع أضافه خطوه الانتقال الفيروسية في نهاية الممر الأول (بعد الخطوة 3.5). بدلا من ذلك ، يمكن ان تكون الخلايا المصابة في التصاق ثم مطلي كما ماموسفيريس.
جانب حرجه من الفحص يقدم هنا البذر خليه كثافة, اي سوفت كنت منخفضه بكفاية ان يتفادى الجيل المجاميع يتداخل مع التفسير من النتيجات16,17. ويمكن لمورفولوجية الماموسفيريس ان تكون مفيده لحل هذا الغموض. وينبغي حصر المجالات المدمجة والمستديرة في نهاية كل مقطع. وينبغي ان يؤخذ في الاعتبار كل من دوران الخزان والحجم. باستخدام العملية المؤتمتة لل DIA ، يتم ضمان هذه الخطوة مع العتبات المناسبة بطريقه موضوعيه ومطلقه. في كثير من الأحيان ، فان الأسلاف تشكيل الهياكل اكينار أو مجموعات أصغر من الخلايا التي ينبغي استبعادها من التهم ماموسفيري. كقاعده عامه ، ونحن نستخدم عتبه 100 ميكرومتر قطرها. وأخيرا ، ينبغي توخي الحذر لتجنب نقل الماموبشيريس السليمة أو غير المنفصلة تماما من ممر إلى آخر. من ناحية أخرى ، سيؤدي الإفراط في الأنابيب إلى زيادة موت الخلايا. وهكذا ، إذا واجهت مثل هذه الصعوبات ، ونحن نوصي باستخدام التريسينزيشن خفيفه أو العلاج Accutase وتمرير المجالات المنفصلة من خلال مصفاه 40 μm لضمان توليد المعلقات أحاديه الخلية.
وقد استخدمت كفاءه تشكيل المجال (SFE) بدلا من ذلك ، كبديل لل SC أو CSC كميه الجسم السابق في الثقافات الماموسفيريه. SFE هو في الواقع مقياس للخلايا مثل الجذعية في السكان خليه معينه. ومع ذلك ، فانه يمثل نهجا اقل ضميري لأنه لا يقدم المعلومات الا في نقاط زمنيه متميزة. حساب أرقام المجال التراكمي وتوليد منحنيات النمو التراكمي ، بدلا من ذلك ، يمكن الاستدلال علي معدل نمو الثقافة من الخطوة الاوليه البذر الخلية حتى عوادم الثقافة أو ، في حاله الثقافات الخلد ، للعدد المطلوب من الممرات. ويسمح تقييم خصائص النمو بتقييم الانحراف عن النمو المتسارع من خلال المعامل R2 ، وفي الخطوة الثانية ، تقييم القيمة الوراثية نفسها.
الأهم من ذلك ، يمكن استخدام منحنيات النمو ماموسفيري التراكمي لتقييم تاثير مثبطات جزيء صغير أو ادويه العلاج الكيميائي الأخرى بشكل انتقائي في CSC المستوي6،11. خلافا لماموسفيريس الابتدائية العادية ، والتي العادم وظيفيا في 5-7 الممرات ، ماموسفيريس الورم تميل إلى توسيع إلى أجل غير مسمي. وترتبط هذه الميزة إلى غير محدود CSC القدرة علي التجديد الذاتي. الآثار علي الانتشار والتجديد CSC الذاتي يمكن ان تكون غير مقترنة من خلال توليد الخلايا السرطانية ومنحنيات النمو ماموسفيري ، علي التوالي. ومن المتوقع ان يؤدي التاثير الخاص بالديوان إلى انخفاض معدل النمو ماموسفيري التراكمي ، مع أو بدون تاثير علي معدل نمو الخلية التراكمي6،11.
وأخيرا ، مجال آخر من الاهتمام هو واحد من الكبار SC الانسجه أعاده برمجه. وتتكون ماموسفيريس المزروعة بالبالكامل من الخلايا غير المتجانسة من حيث الشكل الظاهري ، والتي يحتفظ فيها جزء صغير فقط بالسمات الشبيهة بالجذعية ، بما في ذلك القدرة علي البدء في الماموسفيري وتجديد الغدد الثديية عند الزرع في الجسم الفيفو6و9و11و18و19 التالي يمكن عزل الثديين الثديية اما باستخدام في المختبر الاحتفاظ بالعلامات الاختبارات6،9،11 أو ، السابق فيفو ، وذلك باستخدام علامات السطح الراسخة2،3. علي وجه الخصوص ، الأسلاف الثديية لا البقاء anoikis وغير قادرين علي تشكيل ماموسفيريس. وقد تبين القسري Myc التعبير لمنح ماموسفيري استهلال المحتملة لأسلاف الثدي معزولة كما PKHneg11، مما ادي إلى توليد ثقافة التي يمكن المرور إلى أجل غير مسمي. المثل ، يمكن اختبار تدخل المنظمين السلبيين لأعاده برمجه الفسيولوجية باستخدام نفس الفحص. وفي هذا السياق ، هناك مساله مشتركه قد تنشا وهي العدد المحدود من مدخلات الخلايا. إذا كان إدخال الخلية اقل من 10,000 الخلايا ، ونحن نوصي البذر في لوحات 24-حسنا (الحد الأقصى 5,000 خلايا قابله للحياة/مل). ومع ذلك ، يمكن إثبات الظروف الثقافية المستقلة انكوراج ان تكون قاسيه جدا لتسجيل أعاده برمجه ، وخاصه في الحالات التي يكون فيها تاثير أعاده برمجه ليست فورية. وفي مثل هذه الحالات ، يمكن ان يكون استخدام مصفوفة داعمه وثقافات organoid ثلاثية الابعاد أكثر ملاءمة ل20.
وعموما ، فان الفحص الماموسفيري هو خيار فعال من حيث التكلفة والذي يمكن استخدامه بسهوله لتسجيل الخصائص الشبيهة بالجذع في السكان العاديين والذين يعملون في الفم. وييسر النهج الكمي المتبع في هذا البروتوكول المقارنات بين الثقافات التي تجري في ظروف مختلفه أو التي تتعرض لمحفزات متنوعة. عندما يتبع بصرامة ، فانه يوفر نظام نموذجي السابقين الجسم الآخر بسيطه نسبيا التي تسمح بفك الاقتران من اللاعبين المتعددين التي تحدد خصائص الجذعية في الجسم المجري ، وتقدم امكانيه الدراسات الميكانيكية أكثر تفصيلا.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ونحن نشكر برونو Amati لهديه النوع من نموذج الماوس Rosa26-MycER المحورة وراثيا. تم تمويل هذا العمل من قبل المنح من WWCR ، AIRC ، والمنسق الخاص ، ووزارة الصحة الايطاليه إلى P.G.P. T.V. و X.A. كانت مدعومة من قبل FIRC والشركة الخاصة من قبل منحه FUV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
| Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
| DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
| DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
| EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
| Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
| Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
| Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
| Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |
References
- Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland. Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).
- Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).
- Pece, S., et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140 (1), 62-73 (2010).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Santoro, A., et al. p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value. Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gao, H., et al. Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters? Springerplus. 5, 140 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Murphy, D. J., et al. Distinct thresholds govern Myc's biological output in vivo. Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).
- Bailey, P. C., et al. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 8, 29-39 (2018).
- Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Panciera, T., et al. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
