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Developmental Biology

मिमूत्र मैमोस्फीयर संस्कृतियों में आत्म-नवीकरण का परिमाणीकरण

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60256
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hemato-Oncology, University of Milan

Summary

यहां, हम एक इन विट्रो मैमोस्फीयर आत्म-नवीकरण मात्रात्मक परख के परिणामों के कार्यान्वयन और व्याख्या का वर्णन करते हैं।

Abstract

स्तन ग्रंथि व्यापक उत्थान क्षमता की विशेषता है, क्योंकि यह एक महिला के जीवन चक्र में बड़े पैमाने पर हार्मोनल परिवर्तन के माध्यम से चला जाता है । स्तन स्टेम कोशिकाओं (MaSCs) की भूमिका व्यापक रूप से दोनों शारीरिक/विकासात्मक संदर्भ में और स्तन कैंसरजन्य के संबंध में अध्ययन किया जाता है । इस पहलू में, एमएएससी गुणों पर केंद्रित पूर्व वीवो अध्ययन अत्यधिक मांग के बाद किए जाते हैं। मैमोस्फीयर संस्कृतियां अंग गठन के किराए का प्रतिनिधित्व करती हैं और बुनियादी और अनुवाददोनों अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान उपकरण बन गई हैं। यहां, हम मूत्र प्राथमिक मैमोस्फीयर संस्कृतियों की पीढ़ी और MaSC विकास गुणों की मात्रा के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं। प्रोटोकॉल में मैमेरी ग्रंथि संग्रह और पाचन, प्राथमिक मैममैरी एपिथेलियल कोशिकाओं (एमईसी) का अलगाव, प्राथमिक मैमोस्फीयर संस्कृतियों की स्थापना, धारावाहिक पासिंग, मैमोस्फीयर विकास मापदंडों की मात्रा और परिणामों की व्याख्या शामिल है। एक उदाहरण के रूप में, हम सामान्य एमसीसी पर निम्न स्तर की संविलियन Myc अभिव्यक्ति के प्रभाव को प्रस्तुत करते हैं जिससे आत्म-नवीकरण और प्रसार में वृद्धि होती है ।

Introduction

मैममैरी सेल जीव विज्ञान में उनके गुणों को समझने के लिए अलगाव और मैममैरी एपिथेलियल स्टेम और प्रोजेनिटर कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृति आवश्यक हो गई है। सुरुचिपूर्ण वंश अनुरेखण और धारावाहिक प्रत्यारोपण परखों ने वीवो आला में उनके संदर्भ में स्टेम सेल (एससी) और अन्य ऊतक सबसेट के अध्ययन को सक्षम किया है। हालांकि, यह दृष्टिकोण समय लेने वाला है और इसके लिए रिपोर्टर माउस मॉडल1,2,3,4,5की पीढ़ी की आवश्यकता होती है। इसलिए, इन विट्रो संस्कृति और मैमेरी स्टेम सेल (MaSCs) के प्रचार, जबकि प्रमुख स्टेमनेस सुविधाओं, अर्थात् आत्म नवीकरण और भेदभाव की क्षमता बख्शते, क्षेत्र में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक है । पिछले वर्षों में, मैमोस्फीयर परख का व्यापक रूप से सामान्य स्तन ऊतक और स्तन कैंसर के विकास को मॉडल करने के लिए उपयोग किया गया है, सामान्य या कैंसर एससी (सीएससी) की मात्रा निर्धारित करने और वीवो संदर्भ6,7,8, 9,10,11में अपनी गतिविधि के सरोगेट रिपोर्टर के रूप में उनकी आत्म-नवीकरण क्षमता का आकलन करने के लिए।

मैमोस्फीयर परख एक कुशल और लागत प्रभावी दृष्टिकोण है, जिसमें हौसले से अलग-थलग मैममैरी एपिथेलियल कोशिकाओं (एमईसी) को गैर-अनुयायी परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जाता है, इस आधार के साथ कि केवल मैट्रिक्स जीवित रहेंगे और निलंबन में क्षेत्र बनाएंगे जबकि अन्य सभी सेल प्रकार एनोइकिस द्वारा मर जाएंगे। इसके अलावा, धारावाहिक गैर-अनुयायी मार्ग में मैमोस्फीयर की कई पीढ़ियों को बनाने की क्षमता एमएएससी6,9,11की आत्म-नवीकरण क्षमता से संबंधित है। यहां, हम एक मात्रात्मक मैमोस्फीयर परख के एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसे शुरू में डोन्टू औरसहयोगियों द्वारा अग्रणी न्यूरोस्फीयर परख12के संशोधन के रूप में विकसित किया गया था, जो उचित विकास कारकों7,12के अलावा गैर-अनुयायी, सीरम-मुक्त स्थितियों में ख्यात अनुसूचित जाति के विकास को सक्षम करता है।

Protocol

वीवो प्रक्रियाओं में यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63 के अनुसार और हमारी संस्थागत आचार समिति (पशु भलाई के लिए जीव-OPBA) और इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (IACUC संख्या 762/2015 और 537/2017) से अनुमोदन के बाद प्रदर्शन किया गया ।

1. Murine Mammary ग्रंथि संग्रह और पाचन

  1. एक ठेठ प्रयोग के लिए, सह2 साँस लेना द्वारा 8-10 सप्ताह पुरानी कुंवारी महिला चूहों का बलिदान करें। प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर, 5-30 चूहों का उपयोग करें। चूहों को एक हुड के नीचे विच्छेदन बोर्डों पर रखें। अग्रअंगों को फैलाने और इथेनॉल के साथ जानवर के फर को धोने के लिए सुइयों का उपयोग करें।
  2. संदंश के साथ त्वचा को उठाएं और पेल्विक क्षेत्र के स्तर से शुरू होने वाले एक ऊर्ध्वाधर चीरा को करें और गर्भाशय ग्रीवा के लिए सभी तरह से आगे बढ़ें, जिससे पेरिटोनम बरकरार हो जाता है। त्वचा या पेरिटोनम को तोड़ने से बचने के लिए गोल धार वाली कैंची का इस्तेमाल करें।
  3. ध्यान से शरीर के पार्श्व धुरी भर में कैंची के कोमल आंदोलनों के साथ शरीर से त्वचा अलग।
  4. एक बार जब त्वचा छाती और पेट के क्षेत्र से पूरी तरह से अलग हो जाती है, तो जानवर के चार अंगों में चार चीरों को करें और सुइयों के साथ त्वचा को पिन करें। विस्तारित त्वचा से जानवर के शरीर को पूरी तरह से अलग करने के लिए कैंची और संदंश का उपयोग करें।
  5. धीरे-धीरे स्तन वसा पैड को उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें जो अब पूरी तरह से उजागर हो रहे हैं और कैंची की सहायता से त्वचा से उन्हें ध्यान से अलग कर ते हैं। प्रत्येक माउस के निचले छाती और पेट की स्तन ग्रंथियों को इकट्ठा करें और उन्हें 50 मिलीग्राम शंकुई ट्यूब में डुल्बेको के फॉस्फेट बफर्ड लवण (डीपीबीएस) में विसर्जित करें। प्रति ट्यूब 20 ग्रंथियों तक एकत्र करें। ऊतकों को बर्फ पर रखें।
    नोट: जरूरत पड़ने पर ग्रंथियों पर रात भर बर्फ रह सकती है। यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है। निम्नलिखित चरणबाँ परिस्थितियों में किए जाने चाहिए।
  6. पाचन माध्यम तैयार करें और फ़िल्टर करें: डल्बेकको का संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) 2 एमएम ग्लूटामाइन, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, 100 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, 200 यू/एमएल कोलेजेनेज़ और 100 μg/mL हायलुरोनिडासे (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पूरक है।
  7. एक 100 मिमी पेट्री डिश के लिए 20 ग्रंथियों तक स्थानांतरित करें और एक स्केलपेल या घुमावदार कैंची का उपयोग कर ऊतक कीमा। डिश में डीपीबीएस की बड़ी मात्रा स्थानांतरित करने से बचें।
  8. प्रत्येक पेट्री डिश में पाचन माध्यम के 10 मिलील जोड़ें और एक 25 mL सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग कर, एक 50 मिलीस शंकुट्यूब के लिए कीमा बनाया हुआ ऊतक हस्तांतरण।
  9. ट्यूबों को पैराफिल्म के साथ सील करें और उन्हें एक रोटेटर पर रखें। रोटेटर को कम गति (0.03 x ग्राम)पर सेट करें और 5% सीओ2वाले आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. नेत्रहीन अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले निलंबन का निरीक्षण करें । यदि ऊतक के बड़े टुकड़े पचाते रहते हैं, तो एक और 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन को लंबा करें।
    नोट: एक विकल्प के रूप में, पाचन 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर रात भर किया जा सकता है, एक कोमल कोलेजेनेज़/हायलुरोनिडेस एंजाइम मिश्रण13का उपयोग कर।

2. प्राथमिक Murine MECs के अलगाव

  1. रोटेटर बंद करो और इनक्यूबेटर से ट्यूबों को हटा दें। 5 mL सीरोलॉजिकल पिपेट के उद्घाटन पर एक P1000 टिप समायोजित करें। यदि निलंबन P1000 टिप के माध्यम से गुजरता है, अगले कदम के लिए आगे बढ़ें । अन्यथा, एक और 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन को लम्बा करें।
  2. 100 x ग्रामपर अपकेंद्रित्र, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए। ध्यान से अतिशयोक्ति को डिडेंट करें और डीपीबीएस के 3 एल में प्रत्येक ट्यूब के पैलेट को फिर से निलंबित करें।
    नोट: कम केंद्रीकरण की गति लिम्फोसाइट्स को हटाने और ऊतक कोशिकाओं को निकालने की अनुमति देती है। इस चरण में गोली को उखाड़ फेंकने से बचने के लिए कोमल हेरफेर की आवश्यकता होती है।
  3. 100, 70 और 40 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करके, प्रत्येक ट्यूब में सेल निलंबन को अलग से फ़िल्टर करें। प्रत्येक फ़िल्टरिंग चरण में, पास-थ्रू इकट्ठा करने से पहले डीबीएस के 2 एमएल के साथ छलनी धोएं।
    नोट: इस बिंदु से, सेल निलंबन को एक साथ पूल और संसाधित किया जा सकता है।
  4. 300 x ग्रामपर अपकेंद्रित्र, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए। ध्यान से अधिनेता को डिडेंट करें और डीपीबीएस की शेष मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  5. अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ACK) लिसिस बफर (सामग्री की तालिकादेखें) की बराबर मात्रा जोड़कर लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लिसिस के लिए आगे बढ़ें। 5 मिन तक के लिए बर्फ पर पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा मिलाएं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए, 300 x ग्रामपर डीपीबीएस और सेंट्रलाइज के 10 मीटर जोड़ें। ध्यान से अतिशयोक्ति और नेत्रहीन गोली का निरीक्षण। यदि गोली सफेद है, तो अगले चरण के लिए आगे बढ़ें। अन्यथा आरबीसी लाइसेसिस चरण (चरण 2.5) दोहराएं।
  7. मैमोस्फीयर मीडिया के 1-5 मिलील में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें: मैममैरी एपिथेलियल सेल ग्रोथ बेसल मीडियम (एमईबीएम), 2 mM ग्लूटामाइन के साथ पूरक, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 μg/mL इंसुलिन, ०.५ μg/mL हाइड्रोकॉर्टिसोन, 2% B27, 20 एनजी/mL एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), 20 एनजी/एमएल बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) और ०.४ आईयू/एमएल हेपरिन (सामग्री की सामग्रीदेखें) ।

3. धारावाहिक मैमोस्फीयर री-प्लेटिंग

  1. मैमोस्फीयर संस्कृतियों की स्थापना के लिए, गैर ऊतक संस्कृति पर कोशिकाओं का इलाज (अल्ट्रा कम आसंजन) 6 अच्छी तरह से २००,००० व्यवहार्य कोशिकाओं के घनत्व पर प्लेट/ कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 7-10 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. 95% इथेनॉल (सामग्री की तालिकादेखें) में 1% पॉली-हेमा समाधान तैयार करें और फ़िल्टर करें। कोट अल्ट्रा-कम आसंजन 6-अच्छी तरह से निम्नलिखित मार्ग के लिए प्लेटें, प्रति अच्छी तरह से 1% पॉली-हेमा समाधान के 400 माइक्रोन जोड़कर और इथेनॉल को पूरी तरह से सूखने की अनुमति देकर। बेहतर परिणाम के लिए, कोटिंग को दो बार दोहराएं।
    नोट: पहले मार्ग के दौरान गैर-लेपित प्लेटों का उपयोग संस्कृति से फाइब्रोब्लास्ट को चयनात्मक हटाने की अनुमति देता है।
  3. 7-10 दिनों की संस्कृति के अंत में, सभी कुओं से प्राथमिक मैमोस्फीयर एकत्र करें और 300 x ग्रामपर अपकेंद्री, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए।
  4. ध्यान से अतिशयोक्ति को शांत करें और फ़िल्टर किए गए सुझावों के साथ पी 200 पिपेट का उपयोग करके मैमोस्फीयर के यांत्रिक विसोशन के लिए आगे बढ़ें। लगभग 100 बार पिपेट और बड़े स्फेरॉइड की उपस्थिति के लिए निलंबन का निरीक्षण करते हैं।
    नोट: 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर ट्राइप्सिन या एसीक्यूटेज की कम मात्रा (0.2-0.5 mL) में गोला गोली का एक छोटा ऊष्मायन (2-5 min) यांत्रिक विच्छेदन की सुविधा के लिए उपयोग किया जा सकता है। प्रत्येक मार्ग की चढ़ाना के लिए ताजा मैमोस्फीयर माध्यम (चरण 2.7) तैयार करें।
  5. ताजा मैमोस्फीयर माध्यम के 1-5 mL में फिर से निलंबित करें और व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। यदि लागू हो, तो कोशिकाओं को उपचार समूहों या संस्कृति की स्थिति में विभाजित करें।
  6. थाली 20,000 व्यवहार्य कोशिकाओं/मिलीएल पर पॉली-हेमा-कोटेड अल्ट्रा-कम आसंजन 6-कूप प्लेटें और इनक्यूबेट पर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2।
    नोट: मैमोस्फीयर सेल प्लेटिंग के बाद 5-7 दिनों के भीतर अपने अधिकतम आकार तक पहुंच जाते हैं। जब संभव हो, तकनीकी प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए कई कुओं के लिए प्रत्येक नमूना या हालत की कोशिकाओं को वितरित करें। सेल एकत्रीकरण से बचने के लिए चढ़ाना घनत्व कम रखा जाना चाहिए। 24-अच्छी प्लेटों के लिए अधिकतम 20,000 कोशिकाओं/mL की सिफारिश की जाती है और 24-कूप प्लेटों के लिए 5,000 कोशिकाएं/एमएएल की सिफारिश की जाती है।
  7. 5-7 दिनों के बाद, प्रति अच्छी तरह से क्षेत्रों की संख्या गिनें। यह या तो मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, 10x आवर्धन लेंस से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, या डिजिटल छवि विश्लेषण का उपयोग करके (चरण 4 देखें)।
  8. प्रत्येक कुएं के मैमोस्फीयर को अलग से और 300 x ग्रामपर अपकेंद्रित्र एकत्र करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए।
  9. ध्यान से अतिशयोक्ति को शांत करें और फ़िल्टर किए गए सुझावों के साथ पी 200 पिपेट का उपयोग करके मैमोस्फीयर के यांत्रिक विसोशन के लिए आगे बढ़ें। लगभग 100 बार पिपेट और बड़े स्फेरॉइड की उपस्थिति के लिए निलंबन का निरीक्षण करते हैं।
  10. ताजा मैमोस्फीयर माध्यम के 1 mL में फिर से निलंबित करें और व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती करें। प्रत्येक नमूने या स्थिति की कोशिकाओं को पूल करें और चरण 3.6-3.10 दोहराएं। चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या और प्रत्येक मार्ग के लिए प्रति अच्छी तरह से गिना क्षेत्रों और कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड । संचयी विकास गणना के लिए 5 कदम आगे बढ़ें।

4. डिजिटल छवि विश्लेषण (व्यास) का उपयोग कर क्षेत्र गणना

  1. प्रत्येक मार्ग के अंत में, सभी कुओं की पूरी सतह को स्कैन करें और एक स्टीरियोस्कोप पर घुड़सवार डिजिटल कैमरे का उपयोग करके क्षेत्रों की छवियां प्राप्त करें। छवियों को .tif फ़ाइलों के रूप में सहेजें।
  2. इमेजजे14का उपयोग करके स्टीरियोस्कोप छवियों को इमेज सीक्वेंस के रूप में आयात करें। स्केल और छवि के प्रकार को 8-बिट तक सेट करें।
  3. छवियों के ढेर को डुप्लिकेट करें और मेनू बार पर टैब प्रक्रिया से घटाई पृष्ठभूमि का चयन करें। ऑप्शन लाइट बैकग्राउंड और स्लाइडिंग पैराबोलाइड की जांच करें और बटन ओकेपर क्लिक करें । ढेर की सभी छवियों को संसाधित करें।
  4. मेनू बार की टैब इमेज से एडजस्ट करें और फिर थ्रेसहोल्ड चुनें। आवेदनपर क्लिक करके, एक संवाद खिड़की जिसका शीर्षक है कन्वर्ट स्टैक टू बाइनरी दिखाई देगा। पृष्ठभूमि के रूप में विधि और प्रकाश के रूप में डिफ़ॉल्ट का चयन करें। प्रत्येक छवि के लिए बॉक्स गणना सीमा की जांच करें और ठीकबटन पर क्लिक करें ।
  5. मेनू बार की टैब प्रक्रिया के तहत बाइनरी सूची से क्रमक्रमिक रूप से कमांड वाटरशेड, ओपन और इरोड का चयन करें। दिखाई देने वाले डायलॉग बॉक्स के बटन पर क्लिक करके ढेर की सभी छवियों को प्रोसेस करें।
    नोट: ये प्रक्रियाएं वस्तुओं के दृश्य विभाजन के लिए अनुमति देती हैं जो वस्तुओं के किनारे से पिक्सेल को छूने, वस्तुचौरी और हटाने की अनुमति देती हैं।
  6. मेनू एनालाइजासे कणों का विश्लेषण समारोह का चयन करें। न्यूनतम आकार की सीमा 10,000 माइक्रोन2 पर और परिपत्र0.50 और 1.00 के बीच निर्धारित करें। शो ड्रॉप-डाउन मेनू से विकल्प एलिप्स का चयन करें। संक्षेप कीजांच करें , किनारों पर बाहर करें और सीटू शो में और बटन ओकेपर क्लिक करें । ढेर की सभी छवियों को संसाधित करें।
  7. नेत्रहीन क्षेत्रों के साथ अंडाकार के पत्राचार का निरीक्षण करें और यदि आवश्यक हो तो कण की गिनती को तदनुसार सही करें। अच्छी तरह से मैमोस्फीयर की कुल गिनती प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कुएं के सभी फ्रेम से मायने रखता है।

5. संचयी विकास वक्र गणना

नोट: प्रत्येक मार्ग के अंत में प्रत्येक कुएं में गिने जाने वाले मैमोस्फीयर की संख्या (पीएन)पीएनकी शुरुआत में वरीयता प्राप्त मैमोस्फीयर-शुरू करने वाली कोशिकाओं की संख्या को दर्शाती है।

  1. प्रत्येक मार्ग (पीएन)के लिए, प्लेटेड कोशिकाओं की संख्या और प्रति अच्छी तरह से गिने जाने वाले कोशिकाओं और क्षेत्रों की संख्या दर्ज करें। प्रत्येक मार्ग के अंत में क्षेत्र के आकार की गणना करें:
    क्षेत्र आकार पीएन (कोशिकाओं/क्षेत्र) = कोशिकाओं की गिनती पीएन/
    नोट: पीएन में गोला का आकार पीएनमें वरीयता प्राप्त प्रत्येक मैमोस्फीयर-शुरू करने वाली कोशिका की प्रसारक्षमता का एक पैमाना है ।
  2. पिछले मार्ग के अंत में गणना किए गए गोला आकार द्वारा पीएन के लिए चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके चढ़ाया क्षेत्रों की संख्या का अनुमान लगाएं (पीएन-1):
    क्षेत्रों चढ़ाया पीएन = कोशिकाओं चढ़ाया पीएन/
    नोट: सम्मेलन द्वारा, संस्कृति के पहले मार्ग के दौरान क्षेत्र का आकार स्थिर माना जाता है (यानी, क्षेत्र का आकार पी0 = गोला आकार पी1)। यदि तकनीकी प्रतिकृति के रूप में कई कुओं का उपयोग किया जाता है, तो पीएन-1 में औसत क्षेत्र आकार का उपयोग भाजक के रूप में करें।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से प्रति मार्ग के लिए संचयी सेल और क्षेत्र संख्या की गणना करें:
    संचयी संख्या पीएन = (गिनती पीएन/चढ़ाया पीएन)एक्स संचयी संख्या पीएन-1।
    नोट: अधिवेशन तक, संचयी संख्या पी0 = चढ़ाया पी1। यदि तकनीकी प्रतिकृति के रूप में कई कुओं का उपयोग किया जाता है, तो प्रत्येक मार्ग के लिए प्रति नमूना या स्थिति के औसत संचयी संख्या की गणना करें।
  4. डेटा बिंदुओं को अर्ध-लॉगरिथम स्केल पर प्लॉट करें। एक्स एक्सिस (रैखिक पैमाने) पर मार्ग संख्या (पी0 से पीएन)और वाई एक्सिस (लॉगरिथमस्केल) पर संचयी सेल या गोला संख्या प्रदर्शित करें।
  5. डेटा बिंदुओं के लिए एक घातीय प्रवृत्ति लाइन फिट और फिट की भलाई को मापने के लिए दृढ़ संकल्प (आर2)के गुणांक की गणना ।
    नोट: डेटा पॉइंट्स पर फिट की गई ट्रेंड-लाइन को एक घातीय वक्र का अनुमान लगाना चाहिए, जैसा कि एक सेल आबादी के लिए उम्मीद है जो लगातार दर के साथ बढ़ता है या मर जाता है। आर2 0 और 1 के बीच मूल्यों लेता है, 1 के निकटतम मूल्यों के साथ एक बेहतर फिट का संकेत है ।
  6. संस्कृति की विकास दर (जीआर) का अनुमान लगाने के लिए प्रवृत्ति-रेखा के समीकरण को एक प्राकृतिक घातीय कार्य के रूप में चित्रित करें:
    y = y0 ई(जीआर) एक्स,जहां x = 0 होने पर वाई का मूल्यहै।

Representative Results

सामान्य एमसीसी में Myc अतिअभिव्यक्ति, मैमोस्फीयर शुरू कोशिकाओं की आवृत्ति में वृद्धि की ओर जाता है। यह एक डबल तंत्र के माध्यम से प्राप्त किया जाता है: Myc MaSC सममित डिवीजनों की दर और नए MaSCs11में जनक पुनर्प्रोग्रामिंग की आवृत्ति बढ़ जाती है । कम संविलियन Myc अभिव्यक्ति के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हमने Rosa26-MycER ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग किया, जिसमें Myc गतिविधि को 4-हाइड्रोक्सीटैमोक्सिफेन (4-OHT)15द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। हमने पहले 4-OHT की अनुपस्थिति में फाइब्रोब्लास्ट को हटाने के लिए अल्ट्रा-कम आसंजन 6-अच्छी प्लेटों पर एमईसी चढ़ाया। पहले मार्ग के बाद, हम दो में संस्कृति विभाजित: दो कुओं अनुपचारित रखा गया (नियंत्रण) और दो कुओं २०० एनएम 4-OHT (MycER) के साथ इलाज किया गया । हमने तीन स्वतंत्र प्रयोगों(तालिका 1)के लिए लगातार 5 मार्गके क्षेत्र और सेल नंबरों की गणना की। प्रति मार्ग संचयी कोशिका और गोला की संख्या तालिका 2पर दिखाई जाती है । 4-OHT के साथ प्रेरण क्षेत्र और सेल वृद्धि दर में वृद्धि की ओर जाता है, जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि परिणाम। संचयी क्षेत्र(ए)और सेल(बी)नियंत्रण और MycER मैमोस्फीयर के विकास घटता है। 3 स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब और मानक विचलन दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पहली चढ़ाना दूसरा चढ़ाना तीसरी चढ़ाना चौथी चढ़ाना 5वीं चढ़ाना
कोशिकाओं चढ़ाया सेल काउंट गोला गिनती कोशिकाओं चढ़ाया सेल काउंट गोला गिनती कोशिकाओं चढ़ाया सेल काउंट गोला गिनती कोशिकाओं चढ़ाया सेल काउंट गोला गिनती कोशिकाओं चढ़ाया सेल काउंट गोला गिनती
Exp1 नियंत्रण 77,000 50,000 31 65,000 58,500 41 57,000 30,000 32 30,000 22,000 5 22,000 0 0
77,000 81,000 41 65,000 55,000 23
MycER 77,000 31,0000 193 80,000 375,000 323 80,000 380,000 217 80,000 220,000 223 80,000 170,000 155
77,000 110,000 142 80,000 505,000 396 80,000 270,000 149 80,000 290,000 194 80,000 250,000 160
Exp2 नियंत्रण 75,000 75,000 71 60,000 17,000 34 28,000 45,000 29 45,000 13,000 2 13,000 0 0
75,000 47,000 45 60,000 11,000 47
MycER 75,000 200,000 188 80,000 225,000 277 80,000 230,000 155 80,000 210,000 211 80,000 100,000 95
75,000 250,000 192 80,000 202,500 283 80,000 305,000 185 80,000 160,000 237 80,000 100,000 133
Exp3 नियंत्रण 82,500 130,000 121 80,000 45,000 105 80,000 110,000 86 80,000 58,500 75 58,500 58,500 78
82,500 125,000 177 80,000 71,250 42
MycER 82,500 325,000 457 80,000 610,000 327 80,000 367,000 309 80,000 500,000 260 80,000 115,000 146
82,500 475,000 463 80,000 455,000 392 80,000 415,000 204 80,000 470,000 295 80,000 185,000 161

तालिका 1: प्रत्येक मार्ग पर गिने गए और गिने जाने वाले कोशिकाओं की संख्या और गणना किए गए क्षेत्रों की संख्या।

Table 2
तालिका 2: चढ़ाया क्षेत्र संख्या और संचयी क्षेत्र और सेल संख्या की गणना। कृपया इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

Discussion

यहां, हम विट्रो में MaSC विकास गुणों के मात्रात्मक विवरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम सामान्य मूत्र मैट्रिक्स पर निम्न स्तर के संविलियन Myc अभिव्यक्ति के प्रभाव को प्रस्तुत करते हैं। हालांकि, इस दृष्टिकोण को विभिन्न संदर्भों पर समान रूप से लागू किया जा सकता है । मानव या मूत्र प्राथमिक कोशिकाओं, साथ ही स्थापित सेल लाइनों, मैमोस्फीयर संस्कृतियों है कि क्रमिक रूप से पारित किया जा सकता है स्थापित करने के लिए स्वतंत्र परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जा सकता है । जीन अतिअभिव्यक्ति और आरएनए हस्तक्षेप आसानी से पहले मार्ग के अंत में एक वायरल ट्रांसड्यूक्शन कदम के अलावा (चरण ३.५ के बाद) के साथ प्रोटोकॉल में पेश किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को आसंजन में संक्रमित किया जा सकता है और फिर मैमोस्फीयर के रूप में चढ़ाया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत परख का एक महत्वपूर्ण पहलू सीडिंग सेल घनत्व है, जो16,17के परिणामों की व्याख्या में हस्तक्षेप करने वाले समग्र ों की पीढ़ी से बचने के लिए पर्याप्त कम होना चाहिए। इस अस्पष्टता को हल करने के लिए मैमोस्फीयर की आकृति विज्ञान जानकारीपूर्ण हो सकती है। प्रत्येक मार्ग के अंत में केवल कॉम्पैक्ट, गोल क्षेत्रों की गणना की जानी चाहिए। स्फेरॉइड और आकार दोनों की परिपत्रता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। डीआईए की स्वचालित प्रक्रिया का उपयोग करके, यह कदम उचित थ्रेसहोल्ड के साथ एक उद्देश्य और पूर्ण तरीके से सुनिश्चित किया जाता है। अक्सर, जनक एसीनार संरचनाएं या कोशिकाओं के छोटे समूह बनाएंगे जिन्हें मैमोस्फीयर की गिनती से बाहर रखा जाना चाहिए। अंगूठे के नियम के रूप में, हम 100 माइक्रोन व्यास की सीमा का उपयोग करते हैं। अंत में, एक मार्ग से अगले तक अक्षुण्ण या गैर-पूरी तरह से विसोसिएट मैमोप्सेरे के हस्तांतरण से बचने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए। दूसरी ओर, अतिरिक्त पाइपिंग से सेल डेथ बढ़ जाएगी। इस प्रकार, यदि ऐसी कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है, तो हम हल्के ट्राइप्सिनाइजेशन या एक्यूटेज उपचार का उपयोग करने और एकल-कोशिका निलंबन की पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए 40 माइक्रोन छलनी के माध्यम से विसोशिएट क्षेत्रों को पारित करने की सलाह देते हैं।

मैमोस्फीयर संस्कृतियों में एससी या सीएससी क्वांटेशन पूर्व वीवो के लिए सरोगेट के रूप में, क्षेत्र बनाने दक्षता (SFE) का वैकल्पिक रूप से उपयोग किया गया है। SFE वास्तव में एक दिए गए सेल आबादी में स्टेम की तरह कोशिकाओं का एक उपाय है । हालांकि, यह एक कम कर्तव्यनिष्ठ दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि यह केवल अलग समय बिंदुओं पर जानकारी प्रदान करता है। संचयी क्षेत्र संख्या ओं की गणना और संचयी विकास घटता की पीढ़ी, इसके बजाय, प्रारंभिक सेल सीडिंग चरण से संस्कृति की विकास दर के अनुमान को सक्षम बनाती है जब तक कि संस्कृति निकास या अमर संस्कृतियों के मामले में, मार्ग की वांछित संख्या के लिए। विकास गुणों का मूल्यांकन गुणांक आर2 के माध्यम से घातीय वृद्धि से विचलन के मूल्यांकन की अनुमति देता है और, दूसरे चरण में, जीआर मूल्य का मूल्यांकन ही।

महत्वपूर्ण बात यह है कि सीएससी स्तर6,11पर छोटे अणु अवरोधकों या अन्य कीमोथेरेपी दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए संचयी मैमोस्फीयर वृद्धि घटता का उपयोग किया जा सकता है। सामान्य प्राथमिक मैमोस्फीयर के विपरीत, जो कार्यात्मक रूप से 5-7 मार्ग में निकास करते हैं, ट्यूमर मैमोस्फीयर अनिश्चित काल तक विस्तार करते हैं। यह फीचर अनलिमिटेड सीएससी सेल्फ रिन्यूअल एबिलिटी से जुड़ा हुआ है। प्रसार और सीएससी आत्म नवीकरण पर प्रभाव क्रमशः ट्यूमर सेल और मैमोस्फीयर विकास घटता की पीढ़ी के माध्यम से अयुग्मित किया जा सकता है । सीएससी-विशिष्ट प्रभाव के परिणामस्वरूप संचयी मैमोस्फीयर वृद्धि दर में कमी आने की संभावना है, जो संचयी कोशिका वृद्धि दर6,11पर प्रभाव के साथ या बिना प्रभाव के है ।

अंत में, ब्याज का एक और क्षेत्र वयस्क ऊतक अनुसूचित जाति पुनर्प्रोग्रामिंग में से एक है। पूरी तरह से विकसित मैमोस्फीयर में एक फेनोआमतौर पर विषम कोशिका आबादी होती है, जिसमें केवल एक छोटा सा अंश स्टेम जैसी विशेषताओं को बरकरार रखता है, जिसमें मैमोस्फीयर-शुरू करने की क्षमता और वीवो6,9,11,18,19में प्रत्यारोपण पर मैममैरी ग्रंथि उत्थान शामिल है। मैमेरी प्रोजेनिटर्स को स्थापित सतह मार्कर2,3का उपयोग करके या तो इन विट्रो लेबल-रिटेनिंग परख6,9,11 या, पूर्व वीवो का उपयोग करके अलग-थलग किया जा सकता है। विशेष रूप से, मैममैरी जनक एनोइकिस जीवित नहीं रहते हैं और मैमोस्फीयर बनाने में असमर्थ होते हैं। लागू Myc अभिव्यक्ति को PKHneg11के रूप में अलग मैममैरी जनक ों को मैमोस्फीयर दीक्षा क्षमता प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप एक संस्कृति की पीढ़ी है जिसे अनिश्चित काल के लिए पारित किया जा सकता है। इसी तरह, एक ही परख का उपयोग करके शारीरिक पुनर्प्रोग्रामिंग के नकारात्मक नियामकों के हस्तक्षेप का परीक्षण किया जा सकता है। इस संदर्भ में, एक आम मुद्दा जो उत्पन्न हो सकता है वह है सेल इनपुट की सीमित संख्या। यदि सेल इनपुट 10,000 कोशिकाओं से कम है, तो हम 24-अच्छी प्लेटों (अधिकतम 5,000 व्यवहार्य कोशिकाओं/mL) में सीडिंग की सलाह देते हैं। फिर भी, एंकोरेज स्वतंत्र संस्कृति की स्थिति को पुनर्प्रोग्रामिंग स्कोरिंग के लिए बहुत कठोर साबित किया जा सकता है, खासकर उन मामलों में जहां रीप्रोग्रामिंग प्रभाव तत्काल नहीं है। ऐसे मामलों में, सहायक मैट्रिक्स और 3-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का उपयोग20अधिक उपयुक्त हो सकता है।

कुल मिलाकर, मैमोस्फीयर परख एक लागत प्रभावी विकल्प है जिसे सामान्य और ट्यूमर एमईसी आबादी में स्टेम जैसे गुणों को स्कोरिंग के लिए आसानी से नियोजित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में लिया गया मात्रात्मक दृष्टिकोण विभिन्न परिस्थितियों में किए गए संस्कृतियों के बीच तुलना की सुविधा प्रदान करता है या विविध उत्तेजनाओं के संपर्क में आता है। जब कड़ाई से पीछा किया जाता है, तो यह एक अपेक्षाकृत सरल पूर्व वीवो मॉडल प्रणाली प्रदान करता है जो कई खिलाड़ियों को अनयुग्मन की अनुमति देता है जो वीवो में स्टेम गुणों को परिभाषित करते हैं, जो अधिक विस्तृत मशीनिस्ट अध्ययन की संभावना प्रदान करते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Rosa26-MycER ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के तरह उपहार के लिए ब्रूनो अमती शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को WWCR, AIRC, ईआरसी, और इटली के स्वास्थ्य मंत्रालय से P.G.P. T.V. और X.A. से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था FIRC और एएस द्वारा एक FUV अनुदान द्वारा समर्थित थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACK lysis buffer Lonza 10-548E Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL.
B27 Invitrogen 17504-044 B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v.
bFGF Peprotech 100-18B Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v.
Collagenase Sigma C2674 Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v.
DMEM Lonza 12-614F Dulbecco's modified Eagle's medium
DPBS Microgem S17859L0615 Dulbecco's phosphate buffered saline
EGF Tebu-Bio AF-100-15 Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v.
Glutamine Lonza 17-605E L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v.
Heparin PharmaTex 34692032 Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v.
Hyaluronidase Sigma H4272 Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v.
Hydrocortisone Sigma H0888 Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v.
Insulin SAFCBiosciences 91077C Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v.
Low attachment 6-well plates Corning 351146 Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid.
MEBM Lonza CC-3151 Mammary epithelial cell growth basal medium
Penicllin-Streptomycin mixture Lonza 17-602F Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v.
Poly-HEMA Sigma P3932 Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use.

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक १५३ Myc मैमोस्फीयर विकास वक्र आत्म नवीकरण परख स्तन ग्रंथि स्टेम सेल जनक स्तन कैंसर
मिमूत्र मैमोस्फीयर संस्कृतियों में आत्म-नवीकरण का परिमाणीकरण
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Vlachou, T., Aobuli, X., D'Elia, E., Santoro, A., Moroni, M. C., Pelicci, P. G. Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures. J. Vis. Exp. (153), e60256, doi:10.3791/60256 (2019).

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