Summary
Her beskriver vi gennemførelsen og fortolkningen af resultaterne af en in vitro mammosphere selvfornyelse kvantitativ analyse.
Abstract
Brystkirtlen er karakteriseret ved omfattende regenereringsevne, da det går gennem massive hormonelle ændringer i hele livscyklussen for en kvindelig. Rollen af bryst stamceller (MASCS) er almindeligt undersøgt både i den fysiologiske/udviklingsmæssige sammenhæng og med hensyn til bryst carcinogenese. I dette aspekt, ex vivo undersøgelser fokuseret på MaSC egenskaber er meget eftertragtede. Mammosphere kulturer repræsenterer en surrogat af organdannelse og er blevet et værdifuldt redskab for både grundlæggende og Translationel forskning. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for generering af murine primære mammosphere kulturer og kvantitation af MaSC vækstegenskaber. Protokollen omfatter indsamling og fordøjelse af brystkirtler, isolering af primær bryst epiteliale celler (mecs), etablering af primære mammosphere kulturer, seriel passaging, kvantitation af mammosphere vækstparametre og fortolkning af resultaterne. Som et eksempel præsenterer vi effekten af lav-niveau konstitutiv MYC udtryk på normal MECs fører til øget selvfornyelse og spredning.
Introduction
Isolation og in vitro-kultur af bryst epitelial stilk og stamceller er blevet afgørende for at forstå deres egenskaber i bryst cellebiologi. Elegant Lineage Tracing og serielle transplantations assays har gjort det muligt at studere stamceller (SCs) og andre vævs undersæt i forbindelse med deres in vivo niche. Men denne fremgangsmåde er tidskrævende og kræver generering af reporter musemodeller1,2,3,4,5. Derfor, in vitro-kultur og formering af bryst stamceller (MASCS), mens besparende nøgle stemthed funktioner, nemlig selvfornyelse og differentiering evne, er en af de største udfordringer i marken. I de seneste år, mammosphere assay har været almindeligt anvendt til at modellere både normal bryst væv og brystkræft vækst, at kvantificere normal eller Cancer SCS (CSCS) og vurdere deres selvfornyelse evne som en surrogat reporter af deres aktivitet i deres respektive in vivo kontekst6,7,8,9,10,11.
Mammosphere assay er en effektiv og omkostningseffektiv tilgang, hvor frisk isolerede bryst epiteliale celler (mecs) dyrkes i ikke-tilhængere betingelser, med den forudsætning, at kun MASCS vil overleve og danne kugler i suspension, mens alle de andre celletyper vil dø af anoikis. Desuden er evnen til at danne flere generationer af mammokugler i serielle ikke-tilhængere passager er relateret til selvfornyelse evne af MASCS6,9,11. Her beskriver vi en detaljeret protokol for en kvantitativ mammosphere-analyse, som oprindeligt blev udviklet af dontu og kolleger7 som en ændring af den banebrydende sfære assay12, der muliggør vækst af formodede SCS i ikke-vedtagtige, serum frie forhold med tilsætning af passende vækstfaktorer7,12.
Protocol
In vivo-procedurer blev udført i overensstemmelse med EU-direktiv 2010/63 og efter godkendelse fra vores institutionelle etiske komité (organisme for dyrevelfærd--OPBA) og det italienske sundhedsministerium (IACUC Numbers 762/2015 og 537/2017).
1. murine mammary kirtel indsamling og fordøjelse
- For et typisk eksperiment, ofrer 8-10 uger gamle jomfru hunmus ved CO2 indånding. Afhængigt af eksperimentets mål skal du bruge 5-30 mus. Placer musene på dissektions brædder under en hætte. Brug nåle til at strække forbimerne og vaske dyrets pels ned med ethanol.
- Løft huden med pincet og udføre en lodret indsnit starter på niveauet af bækken området og bevæger sig hele vejen til livmoderhalsen, forlader bughinden intakt. For at undgå brud på huden eller peritoneum, brug rund kantede saks.
- Fjern forsigtigt huden fra kroppen med blide bevægelser af saksen på tværs af den laterale akse af kroppen.
- Når huden er helt løsrevet fra thorax og abdominal område, udføre fire snit på tværs af de fire lemmer af dyret og PIN ned huden med nåle. Brug saks og pincet til fuldt ud at løsne kroppen af dyret fra den udvidede hud.
- Brug pincet til forsigtigt at løfte bryst fedt puder, der nu er fuldt eksponeret og forsigtigt løsrive dem fra huden ved hjælp af saksen. Saml de nedre thorax og abdominal brystkirtler af hver mus og fordybe dem i Dulbecco's fosfat Buffered saltvand (DPBS), i en 50 mL konisk rør. Saml op til 20 kirtler pr. tube. Opbevar vævene på is.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, kan kirtlerne forblive på is natten over. Dette er et sikkert stoppunkt. Følgende trin skal udføres under sterile forhold. - Fordøjelses mediet forberedes og filtreres: dulbecco's modificerede eagle's medium (DMEM) suppleret med 2 mm glutamin, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 200 U/ml kollagenase og 100 μg/ml hyaluronidase (Se tabel over materialer).
- Overfør op til 20 kirtler til en 100 mm Petri skål og hakp vævet ved hjælp af en skalpel eller buet saks. Undgå at overføre store mængder DPBS til skålen.
- Der tilsættes 10 mL fordøjelses medium til hver Petri skål, og det hakkede væv overføres til et 50 mL konisk rør ved hjælp af en 25 mL serologisk pipette.
- Forsegl rørene med parafilm, og Placer dem på en rotator. Rotator indstilles ved lav hastighed (0,03 x g) og inkubér for 2,5 h ved 37 °c i en fugtig atmosfære, der indeholder 5% Co2.
- Inspicer suspensionen visuelt, før du fortsætter til næste trin. Hvis store stykker væv forbliver ufordøjet, forlænge inkubationen ved 37 °C i yderligere 30 min.
Bemærk: Som et alternativ kan fordøjelsen udføres natten over ved 37 °C, 5% CO2, ved hjælp af en blid collagenase/hyaluronidase enzym mix13.
2. isolering af primære murine MECs
- Stop rotator og fjern rørene fra inkubator. Justér en P1000-spids ved åbningen af en 5 mL serologisk pipette. Hvis suspensionen passerer gennem P1000-spidsen, skal du gå videre til næste trin. Ellers forlænge inkubationen ved 37 °C i yderligere 30 min.
- Centrifugeres ved 100 x g, i 5 minutter ved 4 °c. Forsigtigt dekanteres supernatanten og resuspendere pellet af hvert rør i 3 ml dpbs.
Bemærk: Den lave centrifugeringshastighed gør det muligt at fjerne lymfocytter og fedtvæv celler. Blid manipulation er nødvendig for at undgå at skille pellet på dette trin. - Filtrer cellesuspensionen i hvert rør separat ved hjælp af 100, 70 og 40 μm-celle-strainere. Ved hvert filtreringstrin vaskes strainerne med 2 mL DPBS, før pass-through indsamles.
Bemærk: Fra dette tidspunkt kan celle suspensionerne samles og behandles sammen. - Centrifugeres ved 300 x g, i 5 minutter ved 4 °c. Omhyggeligt dekanteres supernatanten og resuspendere cellerne i den resterende mængde af dpbs.
- Fortsæt til røde blodlegemer (RBC) lysis ved at tilføje en tilsvarende mængde af ammonium-chlorid-kalium (ACK) lysis buffer (Se tabel over materialer). Bland ved pipettering og Inkuber på is i op til 5 minutter.
- Tilsæt 10 mL DPBS og centrifugeres ved 300 x g, i 5 minutter ved 4 °c. Forsigtigt dekanteres supernatanten og visuelt inspicere pellet. Hvis pellet er hvid, gå videre til næste trin. Ellers gentages RBC lysis-trinnet (trin 2,5).
- Resuspension celle pellet i 1-5 ml mammosphere medier: bryst epitel cellevækst basal medium (mebm), suppleret med 2 mm glutamin, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 5 μg/ml insulin, 0,5 μg/ml hydrocortison, 2% B27, 20 ng/ml epidermal vækstfaktor (EGF), 20 ng/ml grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bfgf) og 0,4 IE/ml heparin (Se tabel over materialer).
3. seriel Mammosphere re-plating
- Til etablering af mammosphere kulturer, plade cellerne på ikke-vævskultur behandlet (ultra-lav vedhæftning) 6-brønd plader ved en tæthed på 200.000 levedygtige celler/mL i mammosphere medium. Cellerne inkubates i 7-10 dage ved 37 °C, 5% CO2.
- Forbered og Filtrer 1% poly-HEMA opløsning i 95% ethanol (Se tabel over materialer). Coat ultra-lav vedhæftning 6-brønd plader til følgende passager, ved at tilføje 400 μL af 1% poly-HEMA opløsning per brønd og tillader ethanol til at tørre helt. For bedre resultater, gentages belægningen to gange.
Bemærk: Brugen af ikke-belagte plader under den første passage tillader selektiv fjernelse af fibroblaster fra kulturen. - I slutningen af 7-10 dage kultur, indsamle de primære mammokugler fra alle brønde og centrifuge ved 300 x g, i 5 min ved 4 °c.
- Forsigtigt dekanteres supernatanten og gå videre til mekanisk dissociation af mammokugler ved hjælp af en P200 pipette med filtrerede spidser. Pipetten i ca. 100 gange, og Undersøg visuelt suspensionen for tilstedeværelsen af store sfæroider.
Bemærk: En kort inkubation (2-5 min) af kugle pellet i et lavt volumen (0,2-0,5 mL) trypsin eller Accutase ved 37 °C, 5% CO2, kan anvendes til at lette mekanisk dissociation. Forbered frisk mammosphere medium (trin 2,7) til plating af hver passage. - Resuspension i 1-5 mL frisk mammosphere medium og tælle de levedygtige celler. Hvis det er relevant, opdele cellerne i behandlingsgrupper eller kulturforhold.
- Plade 20.000 levedygtige celler/mL på poly-HEMA-belagt ultra-lav vedhæftning 6-brønd plader og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2.
Bemærk: Mammokugler nå deres maksimale størrelse inden for 5-7 dage efter celle plating. Når det er muligt, distribuere cellerne i hver prøve eller tilstand til flere brønde for at opnå tekniske replikater. Plating tæthed bør holdes lav for at undgå celle sammenlægning. Maksimalt 20.000 celler/mL anbefales til 6-brønd plader og 5.000 celler/mL til 24-brønd plader. - Efter 5-7 dage, tælle antallet af kugler per brønd. Dette kan gøres enten manuelt, ved hjælp af et mikroskop udstyret med en 10x forstørrelse linse, eller ved hjælp af digital billedanalyse (Se trin 4).
- Saml mammosfærerne af hver brønd separat og centrifugeres ved 300 x g, i 5 minutter ved 4 °c.
- Forsigtigt dekanteres supernatanten og gå videre til mekanisk dissociation af mammokugler ved hjælp af en P200 pipette med filtrerede spidser. Pipetten i ca. 100 gange, og Undersøg visuelt suspensionen for tilstedeværelsen af store sfæroider.
- Resuspension i 1 mL frisk mammosphere medium og tælle de levedygtige celler. Du skal samle cellerne i hver prøve eller tilstand og gentage trin 3.6-3.10. Optag antallet af celler belagt og antallet af kugler og celler tælles per brønd for hver passage. Fortsæt til trin 5 for den kumulative vækst beregning.
4. Sphere-optælling ved hjælp af digital billedanalyse (DIA)
- I slutningen af hver passage, scanne hele overfladen af alle brønde og erhverve billeder af sfærer ved hjælp af et digitalt kamera monteret på et stereoskop. Gem billederne som. tif-filer.
- Importer stereoskop billederne som en billedsekvens ved hjælp af ImageJ14. Indstil skalaen og billedtypen til 8-bit.
- Dupliker stakken af billeder, og vælg subtrahere baggrund fra fanen proces på menulinjen. Kontroller mulighederne lys baggrund og glidende på og klik på knappen OK. Behandle alle billeder af stakken.
- Vælg Juster og derefter tærskel fra fanen billede af menulinjen. Ved at klikke på Anvend, vises et dialogvindue med titlen Konverter stak til binær . Vælg standard som metode og lys som baggrund. Marker afkrydsningsfeltet Beregn tærskel for hvert billede , og klik på knappen OK.
- Vælg sekventielt kommandoerne vandskuret, åbne og udhule fra den binære liste under fanen proces af menulinjen. Behandl alle billeder af stakken ved at klikke på knappen Ja i den dialogboks, der vises.
Bemærk: Disse processer giver mulighed for visuel segmentering af objekter, der rører, objekt udjævning og fjernelse af pixels fra kanten af objekterne. - Vælg funktionen Analysér partikler fra menuen Analysér. Angiv minimums størrelsesgrænsen ved 10.000 μm2 og cirkularitet mellem 0,50 og 1,00. Vælg indstillingen ellipser i rullemenuen Vis . Check opsummere, udelukke på kanter og in situ show og klik på knappen OK. Behandl alle billeder af stakken.
- Visuelt inspicere korrespondancen af ellipser med kugler og, hvis det er nødvendigt, korrigere partikel tælling i overensstemmelse hermed. Summen af tællinger fra alle de rammer af hver brønd for at opnå den samlede optælling af mammokugler per brønd.
5. beregning af kumulativ vækstkurve
Bemærk: Antallet af mammokugler, som tælles i hver brønd ved slutningen af hver passage (Pn), afspejler antallet af mammosphere-initierende celler, som er seedet i begyndelsen af pn.
- For hver passage (PN), registrere antallet af belagte celler og antallet af celler og kugler tælles per brønd. Beregn kugle størrelsen i slutningen af hver passage:
kugle størrelse Pn (celler/kugle) = celler optalt pn /sfærer talt pn
Bemærk: Kugle størrelsen ved pn er et mål for den proliferativ potentiale af hver mammosphere-initierende celle seedet på pn. - Udlede antallet af belagte kugler ved at dividere antallet af celler, som er belagt med Pn , med den kugle størrelse, som er beregnet ved slutningen af den foregående passage (Pn-1):
sfærer belagt Pn = celler belagt pn /kugle størrelse Pn-1
Bemærk: Ved overenskomst antages kugle størrelsen at være stabil under den første passage af kulturen (dvs. kugle størrelse P0 = kugle størrelse p1). Hvis der anvendes flere brønde som tekniske replikater, skal du bruge den gennemsnitlige sfære størrelse ved PN-1 som nævner. - Beregn det kumulative celle-og Sphere-nummer for hver brønd pr. passage:
kumulativt talp n = ( antal pn /belagt pn) X kumulativt tal pn-1.
Bemærk: Ved overenskomst, kumulativt tal P0 = belagt p1. Hvis der anvendes flere brønde som tekniske replikater, beregnes det gennemsnitlige kumulative antal pr. prøve eller betingelse for hver passage. - Afbild datapunkterne på en semi-logaritmisk skala. Vis passage nummeret (P0 til pN) på x-aksen (lineær skala) og det kumulative celle-eller Sphere-nummer på y-aksen (logaritmisk skala).
- Tilpas en eksponentiel Trend-line til datapunkterne og Beregn koefficienten for bestemmelse (R2) for at måle godheden af pasformen.
Bemærk: Den trend linje, der er monteret på datapunkterne, skal tilnærme sig en eksponentiel kurve, som det forventes for en cellepopulation, som vokser eller dør med en konstant hastighed. R2 tager værdier mellem 0 og 1, med værdier tættest på 1 indikerer en bedre pasform. - Skildrer ligningen af Trend-line som en naturlig eksponentiel funktion til at udlede vækstraten (GR) af kulturen:
y = y0 e(GR) x, hvor y0 er værdien af y, når x = 0.
Representative Results
MYC overekspression i normale MECs, fører til en øget hyppighed af mammosphere initierende celler. Dette opnås gennem en dobbelt mekanisme: MYC øger satsen for MaSC symmetriske divisioner og hyppigheden af stamfader omprogrammering til nye MaSCs11. For at teste effekten af lav konstitutiv MYC udtryk, vi brugte Rosa26-MycER transgene musemodel, hvor MYC aktivitet kan induceres af 4-hydroxytamoxifen (4-OHT)15. Vi først belagt MECs på ultra-lav vedhæftning 6-brønd plader til at fjerne fibroblaster, i mangel af 4-OHT. Efter den første passage, vi opdele kulturen i to: to brønde blev holdt ubehandlet (kontrol) og to brønde blev behandlet med 200 nM 4-OHT (MycER). Vi har talt kugle-og celle numrene på 5 på hinanden følgende passager for tre uafhængige eksperimenter (tabel 1). De kumulative celle-og sfære numre pr. passage er vist i tabel 2. Induktion med 4-OHT fører til øget sfære og cellevækst rater, som vist i figur 1.
Figur 1: repræsentative resultater. Kumulativ sfære (A) og celle (B) vækstkurver for kontrol og mycer mammokugler. Gennemsnitlig og standardafvigelse på 3 uafhængige eksperimenter vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 1. belægning | 2. belægning | 3. belægning | 4. belægning | 5. belægning | ||||||||||||
| Celler belagt | Celletal | Sphere Count | Celler belagt | Celletal | Sphere Count | Celler belagt | Celletal | Sphere Count | Celler belagt | Celletal | Sphere Count | Celler belagt | Celletal | Sphere Count | ||
| Exp1 | Kontrol | 77.000 | 50.000 | 31 | 65.000 | 58.500 | 41 | 57.000 | 30.000 | 32 | 30.000 | 22.000 | 5 | 22.000 | 0 | 0 |
| 77.000 | 81.000 | 41 | 65.000 | 55.000 | 23 | |||||||||||
| MycER | 77.000 | 31, 0000 | 193 | 80.000 | 375.000 | 323 | 80.000 | 380.000 | 217 | 80.000 | 220.000 | 223 | 80.000 | 170.000 | 155 | |
| 77.000 | 110.000 | 142 | 80.000 | 505.000 | 396 | 80.000 | 270.000 | 149 | 80.000 | 290.000 | 194 | 80.000 | 250.000 | 160 | ||
| Exp2 | Kontrol | 75.000 | 75.000 | 71 | 60.000 | 17.000 | 34 | 28.000 | 45.000 | 29 | 45.000 | 13.000 | 2 | 13.000 | 0 | 0 |
| 75.000 | 47.000 | 45 | 60.000 | 11.000 | 47 | |||||||||||
| MycER | 75.000 | 200.000 | 188 | 80.000 | 225.000 | 277 | 80.000 | 230.000 | 155 | 80.000 | 210.000 | 211 | 80.000 | 100.000 | 95 | |
| 75.000 | 250.000 | 192 | 80.000 | 202.500 | 283 | 80.000 | 305.000 | 185 | 80.000 | 160.000 | 237 | 80.000 | 100.000 | 133 | ||
| Exp3 | Kontrol | 82.500 | 130.000 | 121 | 80.000 | 45.000 | 105 | 80.000 | 110.000 | 86 | 80.000 | 58.500 | 75 | 58.500 | 58.500 | 78 |
| 82.500 | 125.000 | 177 | 80.000 | 71.250 | 42 | |||||||||||
| MycER | 82.500 | 325.000 | 457 | 80.000 | 610.000 | 327 | 80.000 | 367.000 | 309 | 80.000 | 500.000 | 260 | 80.000 | 115.000 | 146 | |
| 82.500 | 475.000 | 463 | 80.000 | 455.000 | 392 | 80.000 | 415.000 | 204 | 80.000 | 470.000 | 295 | 80.000 | 185.000 | 161 | ||
Tabel 1: antal sfærer talt og antal celler, som er belagt og talt ved hver passage.
Tabel 2: beregning af belagte kugle numre og kumulative kugle-og cellenumre. Klik her for at se en større version af denne tabel. (Højreklik for at downloade.)
Discussion
Her beskriver vi en protokol for den kvantitative beskrivelse af MaSC Growth Properties in vitro. Som et eksempel præsenterer vi effekten af lav-niveau konstitutiv MYC udtryk på normale murine MaSCs. Denne fremgangsmåde kan dog også anvendes i forskellige sammenhænge. Humane eller murine primærceller, samt etablerede cellelinjer, kan dyrkes i forankring uafhængige betingelser for at etablere mammosphere kulturer, der kan være serielt passaged. Genet overekspression og RNA-interferens kan let introduceres i protokollen med tilsætning af et viral transduktionstrin i slutningen af den første passage (efter trin 3,5). Alternativt kan celler være inficeret i adhæsion og derefter belagt som mammokugler.
Et kritisk aspekt af analysen præsenteres her er såning celletæthed, som bør være lav nok til at undgå generering af aggregater blande sig med fortolkningen af resultaterne16,17. Morfologien i mammosfærerne kan være informativ for at løse denne tvetydighed. Kun kompakte, runde kugler skal optælles i slutningen af hver passage. Både cirkularitet af sfæroider og størrelsen bør tages i betragtning. Ved hjælp af den automatiserede proces af DIA, dette trin er sikret med passende tærskler på en objektiv og absolut måde. Ofte vil progenitorer danne acinic strukturer eller mindre klynger af celler, som bør udelukkes fra mammosphere tællinger. Som en tommelfingerregel bruger vi en tærskel på 100 μm diameter. Endelig skal der udvises forsigtighed for at undgå overførsel af intakte eller ikke-fuldt dissocierede mammopsheres fra en passage til den næste. På den anden side, overskydende pipettering vil føre til øget celledød. Hvis sådanne vanskeligheder opstår, anbefaler vi, at du bruger mild trypsinisering eller Accutase-behandling og passerer de dissocierede sfærer gennem en 40 μm-si for at sikre dannelse af enkelt celle suspensioner.
Sfære, der danner effektivitet (SFE), er blevet anvendt alternativt som et surrogat for SC eller CSC-kvantitation ex vivo i mammosphere-kulturer. SFE er faktisk et mål for Stem-lignende celler i en given cellepopulation. Det er imidlertid en mindre samvittighedsfuld tilgang, da den kun giver oplysninger på særskilte tidspunkter. Beregningen af kumulative sfære numre og generering af kumulative vækstkurver, i stedet, gør det muligt at udlede af vækstraten af kulturen fra den indledende celle såning trin, indtil kulturen udstøde eller, i tilfælde af udødeliggjort kulturer, for det ønskede antal passager. Vurderingen af vækstegenskaber gør det muligt at evaluere afvigelsen fra den eksponentielle vækst gennem koefficienten R2 og, på et andet trin, vurderingen af selve gr-værdien.
Vigtigere, kumulative mammosphere vækstkurver kan bruges til at evaluere effekten af små molekyle hæmmere eller andre kemoterapeutiske lægemidler selektivt på CSC niveau6,11. I modsætning til normale primære mammokugler, som funktionelt udstødning i 5-7 passager, tumor mammokugler tendens til at ekspandere på ubestemt tid. Denne funktion er knyttet til ubegrænset CSC selvfornyelse evne. Virkningerne på spredning og CSC selvfornyelse kan være koblet gennem generation af tumor celle og mammosphere vækstkurver, hhv. En CSC-specifik effekt forventes at resultere i et fald i den kumulative mammosphere-vækstrate med eller uden virkning på den kumulative cellevækst rate6,11.
Endelig er et andet område af interesse er den ene af voksne væv SC omprogrammering. Fuldt dyrkede mammokugler består af en fænotypisk heterogene cellepopulation, hvor kun en mindre fraktion bevarer Stem-lignende egenskaber, herunder mammosphere-initiering evne og Brystkirtel Regeneration ved transplantation i vivo6,9,11,18,19. Bryst progenitorer kan således isoleres enten ved hjælp af in vitro-mærke-tilbageholdelse af assays6,9,11 eller ex vivo ved hjælp af etablerede overflade markører2,3. Især bryst forfædre ikke overlever anoikis og er i stand til at danne mammokugler. Tvungen MYC-ekspression har vist sig at give mammosphere Initierings potentiale til bryst-stamceller isoleret som pkhneg11, hvilket resulterer i dannelse af en kultur, der kan urerne på ubestemt tid. Tilsvarende kan interferens fra negative regulatorer af fysiologisk omprogrammering testes ved hjælp af den samme analyse. I denne sammenhæng er et begrænset antal celle input et fælles problem, der kan opstå. Hvis celle input er lavere end 10.000 celler, anbefaler vi såning i 24-brønd plader (maksimum 5.000 levedygtige celler/mL). Ikke desto mindre kan forankringen af uafhængige dyrkningsbetingelser påvises at være for barsk til at score omprogrammering, især i tilfælde, hvor omprogrammerings effekten ikke er umiddelbar. I sådanne tilfælde kan brugen af en støttende matrix og 3-dimensionelle organoid kulturer være mere passende20.
Samlet set mammosphere assay er en omkostningseffektiv løsning, der let kan anvendes til at score Stem-lignende egenskaber i normal og tumor MEC populationer. Den kvantitative tilgang i denne protokol letter sammenligningen mellem kulturer, der gennemføres under forskellige forhold eller udsættes for forskellige stimuli. Når det følges nøje, giver det et relativt simpelt ex vivo model system, der tillader afkobling af de mange spillere, der definerer Stam egenskaber in vivo, giver mulighed for mere detaljerede Mekanistiske undersøgelser.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Bruno Amati for den slags gave af Rosa26-MycER transgene musemodel. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra WWCR, AIRC, ERC og det italienske sundhedsministerium til P.G.P. T.V. og X.A. blev støttet af FIRC og A.S. af en FUV Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
| Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
| DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
| DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
| EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
| Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
| Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
| Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
| Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |
References
- Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland. Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).
- Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).
- Pece, S., et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140 (1), 62-73 (2010).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Santoro, A., et al. p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value. Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gao, H., et al. Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters? Springerplus. 5, 140 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Murphy, D. J., et al. Distinct thresholds govern Myc's biological output in vivo. Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).
- Bailey, P. C., et al. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 8, 29-39 (2018).
- Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Panciera, T., et al. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
