Summary
在这里，我们描述了体外乳腺圈自我更新定量测定结果的实现和解释。
Abstract
乳腺的特点是广泛的再生能力，因为它经历了女性整个生命周期的大规模荷尔蒙变化。乳腺干细胞的作用在生理/发育方面和乳房致癌方面都有着广泛的研究。在这方面，专注于MaSC属性的外生研究非常抢手。乳腺文化是器官形成的代用品，已成为基础和转化研究的宝贵工具。在这里，我们提出了一个详细的协议，为生成鼠原乳腺圈培养和MaSC生长特性的定量。该协议包括乳腺的收集和消化，原发性乳腺上皮细胞的分离（MECs），建立原发性乳腺培养物，连续传递，对乳腺圈生长参数进行定量和结果解释。例如，我们介绍了低水平组织Myc表达对正常MECs的影响，导致自我更新和扩散的增加。
Introduction
乳腺上皮茎和祖细胞的分离和体外培养已成为了解其在乳腺细胞生物学中特性的关键。优雅的系系追踪和序列移植检测使干细胞（SC）和其他组织子集的研究能够结合其体内利基进行。但是，这种方法非常耗时，需要生成报告器鼠标模型1、2、3、4、5。因此，在体外培养和繁殖乳腺干细胞（MaCs），同时保留关键的干细胞特征，即自我更新和分化能力，是该领域最大的挑战之一。在过去的几年里，乳腺圈测定被广泛用于模拟正常的乳腺组织和乳腺癌的生长，量化正常或癌症的CS（CSCs），并评估他们作为代孕报告人在其各自体内活动6，7，8，9，10，11的自我更新能力。
乳腺圈测定是一种高效且具有成本效益的方法，在非粘附条件下培养新分离的乳腺上皮细胞（MECs），前提是只有MaCs才能存活并形成悬浮球体，而所有其他细胞类型将死于阿诺基斯。此外，在连续的非粘附段落中形成几代乳腺球的能力，与马华会第6、9、11号的自我更新能力有关。在这里，我们描述了一个定量的乳腺圈测定的详细协议，它最初由Dontu和他的同事7开发，作为开创性神经球测定12的修改，在非粘附的、无血清的条件下，通过添加适当的生长因子7，12，使假定的SC生长。
Protocol
体内程序是按照欧盟指令2010/63执行的，并经我们的机构伦理委员会（动物健康组织-OPBA）和意大利卫生部（IACUC编号762/2015和537/2017）批准后进行。
1. 马林乳腺格兰德收藏和消化
- 对于一个典型的实验，通过CO2吸入牺牲8-10周大的处女小鼠。根据实验的目的，使用5-30只小鼠。将鼠标放在发动机罩下的解剖板上。用针头伸展前肢，用乙醇冲洗动物的毛皮。
- 用钳子抬起皮肤，从骨盆区域的水平开始进行垂直切口，一直移动到子宫颈，使腹膜完好无损。为了避免皮肤或围膜破裂，请使用圆边剪刀。
- 用剪刀穿过身体的侧轴轻柔地将皮肤从身体中分离出来。
- 一旦皮肤完全脱离胸腔和腹部区域，在动物的四肢上进行四次切口，然后用针固定皮肤。使用剪刀和钳子将动物的身体与延伸的皮肤完全分离。
- 使用钳子轻轻抬起现在完全暴露的乳腺脂肪垫，并在剪刀的帮助下小心地将它们从皮肤上分离。收集每只小鼠的下胸和腹部乳腺，并将其浸入Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中，在50 mL锥形管中。每管最多收集20个腺体。把纸巾放在冰上。
注：如果需要，腺体可以留在冰上过夜。这是一个安全的停止点。以下步骤应在无菌条件下执行。 - 制备和过滤消化介质：Dulbecco的改良Eagle介质（DMEM）辅以2mM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100微克/mL链霉素、200 U/mL胶原酶和100微克/mL透明质酶（见材料表）。
- 将多达 20 个腺体转移到 100 mm 培养皿中，并使用手术刀或弯曲的剪刀切碎组织。避免将大量 DPBS 转移到菜盘。
- 使用 25 mL 血清移液器，将 10 mL 的消化介质添加到每个培养皿中，并将切碎的组织转移到 50 mL 锥形管中。
- 用副膜密封管子，并将其放在旋转器上。将旋转器设置为低速（0.03 x g），在含有 5% CO2的潮湿环境中在 37°C 下孵育 2.5 小时。
- 在继续执行后续步骤之前，目视检查悬架。如果大块组织仍未消化，在37°C下延长孵育期30分钟。
注：作为替代，消化可以在37°C，5%CO2，使用温和的胶原酶/透明蛋白酶混合13进行过夜。
2. 主要毛里梅的隔离
- 停止旋转器，从培养箱中取出管子。在 5 mL 血清移液器的开口处调整 P1000 尖端。如果悬架通过 P1000 尖端，请继续执行后续步骤。否则，在37°C下再延长孵育30分钟。
- 在100 x g下离心5分钟，在4°C下。小心地将上清液分清，并在 DPBS 的 3 mL 中重新悬浮每个管的颗粒。
注：低离心速度允许去除淋巴细胞和脂肪组织细胞。需要温和的操作，以避免在此步骤中移开颗粒。 - 使用 100、70 和 40 μm 细胞过滤器分别过滤每个管中的细胞悬浮液。在每个过滤步骤中，在收集通过前，用 2 mL 的 DPBS 清洗滤网。
注：从这一点开始，细胞悬浮液可以集中处理在一起。 - 在300 x g下离心5分钟，在4°C下。小心地将上清液分落，并在 DPBS 的剩余体积中重新悬浮细胞。
- 通过添加同等体积的氯化铵-钾（ACK）溶化缓冲液（见材料表），进入红细胞（RBC）溶化。通过移液混合，在冰上孵育长达5分钟。
- 在300 x g下加入10 mL的DPBS和离心机，在4°C下5分钟。小心地将上清液分清并目视地检查颗粒。如果颗粒为白色，则继续执行下一步。否则重复 RBC 莱沙步骤（步骤 2.5）。
- 在1-5 mL的乳腺球培养基中重新悬浮细胞颗粒：乳腺上皮细胞生长基底培养基（MEBM），辅以2 mM谷氨酰胺， 100 U/mL 青霉素，100微克/mL链霉素，5微克/mL胰岛素，0.5微克/mL氢皮质酮，2%B27，20纳克/mL表皮生长因子（EGF），20纳克/mL基本成纤维细胞生长因子（bFGF）和0.4 IU/mL肝素（见材料表）。
3. 串行乳腺球再电
- 为了建立乳腺圈培养物，在乳腺球培养基中以200，000个活细胞/mL的密度将细胞盘到非组织培养物上处理（超低附着力）6孔板。在37°C，5%CO2下孵育细胞7-10天。
- 在 95% 乙醇中制备和过滤 1% 聚HEMA 溶液（参见材料表）。通过每孔加入 400 μL 的 1% 聚HEMA 溶液，使乙醇完全干燥，为以下通道涂覆超低粘附 6 孔板。为了获得更好的结果，请重复涂层两次。
注：在第一次通道中使用非涂层板允许选择性地从培养物中去除成纤维细胞。 - 在7-10天培养结束时，从所有井中收集原体乳腺球，并在300 x g下离心，在4°C下采集5分钟。
- 小心地将上清液分落，并使用带有过滤尖端的 P200 移液器进行乳腺球体的机械分离。移液器约 100 次，并目视检查悬架是否存在大型球体。
注：在37°C、5%CO2下，在小体积（0.2-0.5 mL）的锥形颗粒中进行短期孵育（2-5分钟），可用于促进机械分离。准备新鲜的乳腺球介质（步骤2.7），用于每个通道的电镀。 - 在1-5 mL的新鲜乳腺球培养基中重新悬浮，并计算可存活的细胞。如果适用，在治疗组或培养条件下分裂细胞。
- 在多-HEMA涂层超低粘附6孔板上，在37°C、5%CO2下孵育2000个活细胞/mL板。
注：在细胞电镀后的5-7天内，乳腺球体达到其最大大小。如果可能，将每个样品或条件的细胞分配到多个井中，以获得技术复制。电镀密度应保持在较低水平，以避免细胞聚集。建议 6 孔板的最大 20，000 个单元/mL，24 孔板的 5，000 个单元/mL。 - 5-7天后，计算每口井的球体数。这可以手动完成，使用配备 10 倍放大镜头的显微镜，也可以使用数字图像分析（参见步骤 4）。
- 分别收集每个井的乳腺球，在300 x g下离心，在4°C下5分钟。
- 小心地将上清液分落，并使用带有过滤尖端的 P200 移液器进行乳腺球体的机械分离。移液器约 100 次，并目视检查悬架是否存在大型球体。
- 悬浮在1mL的新鲜乳腺球培养基，并计数可行的细胞。将每个样本或条件的单元格集中，并重复步骤 3.6-3.10。记录每个通道的镀层细胞数以及每个通道每孔计数的球体和细胞数。继续执行累积增长计算步骤 5。
4. 使用数字图像分析 （DIA） 进行球体枚举
- 在每个段落的末尾，扫描所有井的整个表面，并使用安装在立体镜上的数码相机获取球体的图像。将图像另存为 .tif 文件。
- 使用 ImageJ14将立体镜图像导入为图像序列。将图像的比例和类型设置为 8 位。
- 复制图像堆栈，并从菜单栏上的"过程"选项卡中选择"减去背景"。检查选项光背景和滑动抛物面，然后单击按钮确定。处理堆栈的所有映像。
- 从菜单栏的选项卡图像中选择"调整"，然后选择"阈值"。通过单击"应用"，将显示一个名为"将堆栈转换为二进制"的对话窗口。选择"默认"作为方法，将"光"作为背景。选中"计算每个图像的阈值"复选框，然后单击"确定"按钮。
- 在菜单栏的选项卡"进程"下，从二进制列表中按顺序选择"分水岭"、"打开"和"侵蚀"的命令。单击显示的对话框的"是"按钮，处理堆栈的所有图像。
注：这些过程允许对接触对象、对象平滑和从对象边缘移除像素的对象进行可视化分割。 - 从"分析"菜单中选择"分析粒子"功能。将最小大小阈值设置为 10，000 μm2，循环介于 0.50 和 1.00 之间。从"显示"下拉菜单中选择"椭圆"选项。选中"总结"，在边上排除，原位显示，然后单击"确定"按钮。处理堆栈的所有图像。
- 目视检查椭圆与球体的对应关系，如果需要，可相应地更正粒子计数。求和每口井所有帧的计数，以获得每口井的乳腺球总数。
5. 累计增长曲线计算
注：在每个通道 （PN）末尾每个井中计数的乳腺球的数量反映了在 PN开始时播种的乳腺球启动细胞的数量。
- 对于每个段落 （PN），登记镀电池的数量和每个孔计数的细胞和球体数。计算每个段落末尾的球体大小：
球体大小 PN （细胞 / 球） = 细胞计数 PN / 球体计数 PN
注：PN处的球体大小是 PN种子的每个乳腺圈启动细胞增殖电位的量度。 - 通过将 PN的镀值单元数除以上一段末尾计算的球体大小（PN-1）来推断镀层球体的数量：
球体镀PN = 细胞镀PN /球体尺寸PN-1
注：按照惯例，在区域性的第一次传递期间（即球体大小 P0 = 球体大小 P1） 假定球体大小稳定。如果使用多个井作为技术复制，请使用 PN-1的平均球体大小作为分母。 - 计算每个通道每个孔的累积单元格和球体数：
累计数 PN = （计数 PN / 镀板 PN） X 累积数 PN-1。
注：按照惯例，累积数 P0 = 镀 P1。如果将多口井用作技术复制，则计算每个通道的每个样本或条件的平均累积数。 - 在半对数尺度上绘制数据点。在 x 轴（线性刻度）上显示通道数（P0到 PN）和 y 轴上的累积像元或球体数（对数刻度）。
- 将指数趋势线拟合到数据点，并计算确定系数 （R2） 以测量拟合的优度。
注：拟合到数据点的趋势线应近似指数曲线，如预期以恒定速率增长或死亡的细胞群。R2的值介于 0 和 1 之间，值最接近 1 表示更合适。 - 将趋势线的方程描述为自然指数函数，以推断区域性的增长率 （GR）：
y = y0 e（GR）x，其中y0是 y 的值，当x = 0 时。
Representative Results
在正常MEC中，霉变过度，导致乳腺圈启动细胞的频率增加。这是通过双重机制实现的：Myc提高了MaSC对称的分区率和祖进者重新编程到新的MaSC11的频率。为了测试低构成性Myc表达的效果，我们采用了Rosa26-MycER转基因小鼠模型，其中Myc活性可以通过4-羟基沙莫西芬（4-OHT）15诱导。在4-OHT缺席的情况下，我们首先在超低附着力6孔板上镀上MEC，以去除成纤维细胞。第一段之后，我们把文化一分为二：两口井未经处理（控制），两口井用200 nM 4-OHT（MycER）处理。我们计算了三个独立实验的连续5个段落的球体和细胞数（表1）。每个段落的累积单元格和球体数显示在表2上。4-OHT的感应导致球体和细胞生长速率增加，如图1所示。
图 1：代表性结果。控制和MycER乳腺球体的累积球体 （A） 和细胞 （B） 生长曲线.显示了3个独立实验的均值和标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
| 第一电镀 | 第二电镀 | 第三电镀 | 第 4 次电镀 | 第 5 次电镀 | ||||||||||||
| 细胞镀层 | 单元格计数 | 球体计数 | 细胞镀层 | 单元格计数 | 球体计数 | 细胞镀层 | 单元格计数 | 球体计数 | 细胞镀层 | 单元格计数 | 球体计数 | 细胞镀层 | 单元格计数 | 球体计数 | ||
| Exp1 | 控制 | 77,000 | 50,000 | 31 | 65,000 | 58,500 | 41 | 57,000 | 30,000 | 32 | 30,000 | 22,000 | 5 | 22,000 | 0 | 0 |
| 77,000 | 81,000 | 41 | 65,000 | 55,000 | 23 | |||||||||||
| 迈克尔 | 77,000 | 31,0000 | 193 | 80,000 | 375,000 | 323 | 80,000 | 380,000 | 217 | 80,000 | 220,000 | 223 | 80,000 | 170,000 | 155 | |
| 77,000 | 110,000 | 142 | 80,000 | 505,000 | 396 | 80,000 | 270,000 | 149 | 80,000 | 290,000 | 194 | 80,000 | 250,000 | 160 | ||
| Exp2 | 控制 | 75,000 | 75,000 | 71 | 60,000 | 17,000 | 34 | 28,000 | 45,000 | 29 | 45,000 | 13,000 | 2 | 13,000 | 0 | 0 |
| 75,000 | 47,000 | 45 | 60,000 | 11,000 | 47 | |||||||||||
| 迈克尔 | 75,000 | 200,000 | 188 | 80,000 | 225,000 | 277 | 80,000 | 230,000 | 155 | 80,000 | 210,000 | 211 | 80,000 | 100,000 | 95 | |
| 75,000 | 250,000 | 192 | 80,000 | 202,500 | 283 | 80,000 | 305,000 | 185 | 80,000 | 160,000 | 237 | 80,000 | 100,000 | 133 | ||
| Exp3 | 控制 | 82,500 | 130,000 | 121 | 80,000 | 45,000 | 105 | 80,000 | 110,000 | 86 | 80,000 | 58,500 | 75 | 58,500 | 58,500 | 78 |
| 82,500 | 125,000 | 177 | 80,000 | 71,250 | 42 | |||||||||||
| 迈克尔 | 82,500 | 325,000 | 457 | 80,000 | 610,000 | 327 | 80,000 | 367,000 | 309 | 80,000 | 500,000 | 260 | 80,000 | 115,000 | 146 | |
| 82,500 | 475,000 | 463 | 80,000 | 455,000 | 392 | 80,000 | 415,000 | 204 | 80,000 | 470,000 | 295 | 80,000 | 185,000 | 161 | ||
表1：每个段落的球数和镀的细胞数。
表2：计算镀球数和累积球体数和像元数。请点击此处查看此表的较大版本。（右键单击下载。
Discussion
在这里，我们描述了一个在体外对MaSC生长特性进行定量描述的协议。例如，我们介绍了低水平组织Myc表达对正常鼠马Cs的影响。但是，这种方法同样适用于各种上下文。人类或鼠原细胞，以及已建立的细胞系，可以在锚固独立条件下培养，以建立可以连续传递的乳腺圈培养物。基因过度表达和RNA干扰可以很容易地引入协议，在第一个段落的末尾（步骤3.5之后）增加了病毒转导步骤。或者，细胞可以在粘附中感染，然后被镀为乳腺球体。
这里提出的测定的一个关键方面是播种细胞密度，它应该足够低，以避免聚集的产生干扰对结果16，17的解释。乳腺球的形态可以信息化，以解决这种歧义。每个段落的末尾只应列举紧凑的圆形球体。应考虑到球体的循环和尺寸。使用 DIA 的自动化流程，以客观和绝对的方式确保使用适当的阈值。通常，祖细胞会形成细胞结构或较小的细胞簇，这些细胞群应排除在乳腺圈计数之外。根据经验，我们使用直径为 100 μm 的阈值。最后，应注意避免将完整或完全分离的乳腺从一条通道转移到下一条通道。另一方面，过量的移液会导致细胞死亡增加。因此，如果遇到这样的困难，我们建议使用温和的胰蛋白酶化或Accutase治疗，并通过40μm滤网分离球，以确保产生单细胞悬浮液。
球体形成效率（SFE）已被交替使用，作为在乳腺圈培养物中的SC或CSC定量前体的替代物。SFE确实是一个特定细胞群中干细胞的量度。然而，它代表一种不太认真的做法，因为它只在不同的时间点提供信息。相反，计算累积球数和生成累积增长曲线，可以推断培养物从初始细胞播种步骤到培养物耗尽，或者，在未朽培养物的情况下，可以推断所需的段落数。对生长特性的评估允许通过系数 R2评估指数增长的偏差，并在第二步评估 GR 值本身。
重要的是，累积的乳腺生长曲线可用于评估小分子抑制剂或其他化疗药物在CSC级别6，11中选择性的效果。与正常原发性乳腺球相反，肿瘤乳腺球体在5-7个通道中功能性耗尽，肿瘤乳腺球体倾向于无限扩张。此功能链接到无限的 CSC 自我更新能力。通过肿瘤细胞和乳腺圈生长曲线的生成，可以分离对增殖和CSC自我更新的影响。CSC特异性效应预计将导致累积乳腺球增长率的下降，无论是否对累积细胞增长率影响6，11。
最后，另一个感兴趣的领域是成人组织SC重新编程。完全生长的乳腺球体由表型异质细胞群组成，其中只有一小部分保留类似干细胞的特征，包括乳腺球启动能力和移植体内6、9、11、18、19时的乳腺再生。因此，可以使用体外标签保留测定剂6、9、11或前体，使用已建立的表面标记2、3进行分离。值得注意的是，乳腺祖体不能存活，无法形成乳腺球。强制执行的Myc表达已被证明赋予乳腺圈启动潜力，作为PKHneg11被隔离的乳腺祖传，导致一种可以无限期地传递的文化的产生。同样，对生理重编程的负稳压器的干扰也可以使用相同的测定测试。在这种情况下，可能会出现一个常见问题是单元输入的数量有限。如果细胞输入低于10，000个细胞，我们建议在24孔板（最多5，000个活细胞/mL）中播种。然而，锚固独立培养条件可以证明过于苛刻，无法重新编程评分，尤其是在重新编程效果不立的情况下。在这种情况下，使用支持矩阵和三维有机体培养物可能更合适20。
总体而言，乳腺球测定是一种经济高效的选择，可以很容易地用于在正常和肿瘤MEC人群中对类似茎的特性进行评分。本议定书采用的定量方法有助于在不同条件下进行或受到各种刺激的培养物之间的比较。严格遵循后，它提供了一个相对简单的外生模型系统，允许定义体内茎特性的多个参与者脱钩，从而提供了更详细的机械研究的可能性。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢布鲁诺·阿玛蒂送给罗莎26-MycER转基因小鼠模型的友好礼物。这项工作由WWCR、AIRC、ERC和意大利卫生部向P.G.P.T.V.和X.A.提供的赠款资助，由FIRC和A.S.提供FUV赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
| Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
| DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
| DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
| EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
| Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
| Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
| Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
| Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |
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