适口性西方风格自助饮食作为建立啮齿类动物饮食诱导肥胖模型的可靠方法

摘要

本方案描述了使用一种适口性极高的西式自助饮食来建立啮齿类动物暴食和肥胖模型的方法。本文详细介绍了食物的选择、制备和测量步骤，并解释了有助于产生稳定且可重复表型的方法学因素。

摘要

肥胖在发达国家和发展中国家的发病率正迅速上升，已知会引发或加重多种疾病。 肥胖及其共病状况带来的健康负担凸显了深入理解其发病机制的必要性，然而伦理限制使得在人体上开展相关研究受到制约。因此，建立具有良好外部效度的实验动物肥胖模型，对于研究超重和肥胖至关重要。 尽管已有多种动物物种被用于模拟人类肥胖所伴随的一系列变化，啮齿类动物是最常用的模型。本实验室开发了一种西方式的自助餐饮食（cafeteria diet），可使啮齿类动物持续出现显著的体重增加及代谢性疾病的标志物。该饮食通过提供多种高适口性食物诱导动物暴食，模拟现代西方的饮食环境。这种饮食可在大鼠中快速诱导体重增加和体脂积聚，从而便于研究过度进食和肥胖的影响。尽管自助餐饮食在宏量营养素和微量营养素成分的精确控制方面不如纯化高脂或高脂高糖饮食，但其通常诱导出比纯化饮食更严重的代谢表型，且更接近超重和肥胖人群所表现出的代谢紊乱特征。

引言

肥胖及其相关共病对全球健康负担有巨大影响¹，并占澳大利亚疾病负担的7%²。导致肥胖的主要危险因素是摄入富含饱和脂肪和精制碳水化合物、而缺乏膳食纤维和微量营养素的不健康饮食³。要确定治疗肥胖的干预靶点，需要能够系统评估对多种生化和生理系统影响的模型。啮齿类动物模型的应用已显著推动了我们对肥胖病因学的理解，这类模型可在受控条件下随时间研究行为、代谢和分子层面的效应，并便于对环境因素进行操控。

自助饮食（CAF）诱导肥胖模型通过在啮齿类动物的标准饲料饮食基础上，添加多种适口性强、富含饱和脂肪、精制碳水化合物或二者兼有的食物，来建立。这类食物包括蛋糕、甜饼干以及高脂肪的咸味零食（如加工肉类、奶酪和薯片）。该模型能稳定诱导啮齿类动物暴食及快速体重增加。该模型的关键特征是提供多种高度适口的食物，旨在模拟现代食物环境。短期来看，食物种类的可获得性会增加大鼠的摄食量。⁴ 以及在人类中⁵ 即使食物在适口性上相匹配，且仅在风味和嗅觉线索上有所不同^4,6然而，一项研究表明，在能量和宏量营养素相匹配的条件下，提供风味和质地不同的纯化饮食对大鼠的长期体重增加没有影响⁷，这表明不同食物的营养成分及其独特的餐后效应也可能导致过量进食。接触多种味道和质地的食物会克服感官特异性饱足感，后者描述的是相对于其他食物，对刚刚摄入的食物的进食欲望下降的现象。⁵在我们实验室的多个队列研究中，我们同样观察到，使用高适口性食物会进一步加剧过度进食。

这种CAF饮食已使用了40多年，自Sclafani⁸报道以来，暴露于一系列“超市食品”（包括棉花糖、巧克力、花生酱、饼干、萨拉米香肠和奶酪）的雌性大鼠相比对照组表现出更快的体重增加。该研究及其他早期研究指出，与单纯的高脂肪或高碳水化合物饮食相比，CAF样饮食似乎更能有效加速体重增长^8,9。20世纪80年代的研究对喂食CAF饮食大鼠的宏量营养素构成¹⁰和进食模式¹¹进行了表征，并发现其脂肪质量、胰岛素水平^9,10以及产热作用¹²发生了显著变化。我们课题组已使用CAF饮食建立肥胖模型超过二十年^13,14，在此期间我们采用了多种饮食变体。每天为大鼠提供至少两种甜味和两种咸味食物，同时辅以常规饲料和饮水。近年来，我们开始在固体CAF食物基础上补充10%的蔗糖溶液。CAF饮食可根据不同实验设计进行调整，这是该模型的一大优势。

CAF 饮食可导致立即出现的多食症（即在最初 24 小时内）以及持续增加的体重和脂肪量。然而，最大化饮食多样性的后果是无法控制宏量营养素和微量营养素的摄入量，这一点被部分学者视为不可克服的缺陷¹⁵。饮食诱导肥胖的研究更常使用纯化的高脂（HF）或联合高脂高糖（HFHS）饮食，这类饮食可精确控制营养成分，且相比 CAF 模型更省时省力，因为后者需要每日监测并仔细规划和执行饮食安排。 commercially available 纯化高脂饮食在转化医学中的相关性仍存在持续争议，因其脂肪酸谱以及脂肪和蔗糖的比例可能与人类的实际膳食摄入不一致¹⁶。尽管 CAF 饮食在营养成分控制方面不如纯化饮食精确，但它旨在模拟大多数现代社会中食物选择所具有的适口性和多样性。

方案

本方案已针对大鼠的使用进行了优化。尽管我们已成功在小鼠中使用过CAF饮食^17,18，但软质食物的研磨可能引入额外误差，从而降低食物摄入量测量的可靠性¹⁹。本方案已获得新南威尔士大学动物护理与伦理委员会批准，并符合澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）发布的《科学用途动物使用与护理指南》（第8版）的要求。

注意：在我们的短期研究中（即自由摄取CAF饮食少于<10周），观察到的不良反应极少；没有证据表明摄取CAF饮食的大鼠在整体健康、活动能力、社交行为或类似焦虑行为方面发生改变²⁰。在较长时间（超过>16周）后，摄取CAF饮食的大鼠中偶有极少数心血管事件被观察到。

1. 动物适应性饲养与管理

1. 大鼠到达后，在设施中适应5–7天，期间自由摄取对照饮食和水。从到达后24小时开始，每天进行抓取操作；由于CAF饮食需要每日与笼具互动，因此规律性的抓取操作非常重要。
2. 确保所有笼具均提供环境丰富化措施。标准笼具内应包含一个红色聚甲基丙烯酸甲酯盒子、筑巢材料和一根木质咀嚼棒，这一点尤为重要，因为CAF饮食提供的软质食物可能导致大鼠在缺乏较硬咀嚼物的情况下发生咬合不正。
3. 在开始CAF饮食前，将笼具分配至CAF组或标准饲料组，并通过比较各组间体重的均值和范围，必要时重新分配，以确保起始体重相匹配。由于光照暴露会影响昼夜节律、摄食量和活动水平，因此需确保CAF组和标准饲料组的笼具在饲养室内均匀分布。
   注意：啮齿类动物在群养时会形成社会等级（尤其是雄性）。通过将体重相近的大鼠同笼饲养（以减少笼内欺凌行为），可部分控制社会应激的影响。此外，应将自助饮食均匀分布在笼具内，确保所有大鼠均可接触到饮食。

2. 饮食选择与设置

1. 饮食安排
   1. 确保常规饲料和饮水始终供应充足，并每天额外提供至少两种甜味和两种咸味食物（每周饮食安排示例如表1所示；图1展示了3天的食物选择）。可选附加食物包括高脂高糖饲料和10%蔗糖溶液。
   2. 每个类别中的食物应尽量保持宏量营养素比例相似：所有甜味食物的碳水化合物含量应相对高于脂肪，而所有咸味食物的脂肪含量应高于碳水化合物。每日CAF饮食组合应尽量提供相近比例的脂肪、碳水化合物、糖和蛋白质。
   3. 在整个实验过程中定期监测摄食量，以便必要时调整菜单以维持暴食状态。表2提供了多种示例食物的能量密度和宏量营养素信息，以及针对200 g雄性Sprague Dawley大鼠的建议起始供给量。
   4. 避免连续多日或一周内过于频繁地提供同一种食物，以免降低该食物的摄入量。若发生此类情况，应暂停该食物数日后再重新纳入饮食计划。
      注意：大鼠可能存在新食物恐新症，大多数新食物需多次暴露后才能确定是否被接受。大鼠通常不喜欢含酵母的食物（如面包、披萨等）或具有柑橘味或咖啡味的食物。
2. 湿性食物
   1. 对于含水量较高的食物，可考虑使用如金枪鱼罐头之类的容器盛放，以避免污染垫料。若采取此方式，对照组笼具中也应提供相同空容器作为对照。
3. 饮食来源
   1. 确保所用CAF食物为常规稳定供应品，或为整个实验准备足量食物，以保证食物种类的一致性，避免中途更换。
4. 饮食储存
   1. 根据包装说明储存食物，或于-20 °C保存，并在使用前夜解冻。干燥食品（如饼干）应存放在密封容器中。
5. 蔗糖溶液（可选）
   1. 通常配制10%（w/v）的蔗糖溶液，批量制备（2–5 L），不使用时储存于4 °C。
   2. 每周至少更换一次蔗糖瓶（最低要求），以防止细菌或真菌生长。每日检查瓶子，若发现生长迹象则立即更换。
      注意：蔗糖溶液是除始终供应的饮水之外的额外补充。

3. 自助饮食制备

1. 解冻
   1. 提前约24小时取出适量CAF食物进行解冻。可使用微波炉解冻，但食物不得在温热状态下提供。
2. 每日补充 CAF 饮食
   1. 每日更换CAF饮食食物可最大限度地增加食物种类，并减少笼具污染。由于大鼠通常在暗周期初期摄入其每日大部分食物量，因此应将CAF饮食的补充时间安排在暗周期开始前，以确保此时食物新鲜。在食物摄入量较低的日子补充CAF饮食。 不 被测量。
   2. 以确保该组具有相似的每日体验的方式喂养饲料组，具体如下。
      1. 将水瓶倒置（瓶嘴朝上），把笼子放在工作区并打开盖子。
      2. 轻轻搅动垫料约20秒，以模拟从CAFE笼具的垫料中收集食物的过程。
      3. 从饲料斗中取少量颗粒饲料放入垫料中，以使笼内垫料上的食物暴露情况保持一致。
      4. 将笼盖放回并放回架上，待笼子稳定后再更换水瓶，以尽量减少溢出。
   3. 喂养自助餐厅组
      1. 将CAF饮食项目分别装入已标记的容器中，每个笼子对应一个容器。
      2. 将水瓶翻转（瓶嘴朝上），把笼子放在工作台上并打开盖子。
      3. 尽可能从垫料中清除旧的 cafeteria 饮食。
      4. 将新鲜的餐食饲料放入笼中。
      5. 关闭笼子并放回架子。
      6. 更换水和蔗糖瓶。
         注意： 为避免普通饲料大鼠接触CAF饮食，可考虑先饲喂普通饲料笼，再饲喂CAF饮食笼，或顺序相反。处理不同饮食组大鼠之间应更换手套。
3. 根据需要补充饲料、水和蔗糖瓶。在完成其他操作后再进行补充更为高效，因为补充饲料和水后鼠盒会更重。
   注意： CAF 小鼠盒笼垫料污染更快，需更频繁更换，以避免因接触潮湿垫料及强烈气味而引发应激反应。应每日检查垫料状况，并根据需要及时更换。

4. 24小时内的食物摄入量

注意： 食物摄入量的测量在连续的24小时内进行 每周数次周期性进行。

1. 开始CAF饮食时，至少每周两次测量体重和24小时食物摄入量，以监测饮食效果。食物摄入量的测量应接近黑暗期开始时进行。在测量食物摄入量的日子里，应提供相同的一组CAF食物，以确保风味和能量密度的一致性，从而准确监测随时间的变化。
   注意： 这可能不适用于需要 >每周进行两次食物摄入量测量，因为对相同食物的过度暴露可能会随时间推移减少暴食行为。
2. CAF 和对照饮食摄入量的测量
   1. 配制CAF饮食，为每笼分配并放入已标记的容器中，称重并记录各组分。 图1 显示一套完整的癌相关成纤维细胞（CAF）培养基。 表3 包含一份食物摄入监测表示例。
   2. 根据需要补充水、蔗糖和饲料的量。
3. 对照饲料（对照）笼具
   1. 将水瓶倒置（瓶嘴朝上），把笼子放在工作台上并打开盖子。
   2. 称重后，将大鼠转移至铺有新鲜垫料并配备环境丰富化设施的笼具中。
   3. 记录水瓶和饲料的重量。
   4. 更换笼盖，将笼子放回笼架，然后将水瓶调转方向。可在笼子上添加标有“食物摄入量”的小标签，以提醒饲养人员和研究人员不要触碰水瓶和饲料。
4. 对于CAF笼子：
   1. 执行与步骤4.3相同的操作。此外，在将大鼠转移前，将已预先称重的含CAF食物的容器分散放置于垫料新鲜的笼具内。
   2. 让大鼠静置24小时，期间尽量减少干扰。记录任何未预期的干扰情况（例如，新大鼠进入饲养室或环境噪音的变化）。
5. 完成食物摄入量测量
   1. 记录水瓶和饲料的重量，并仔细检查垫料中是否有饲料碎片。完成后，从笼子上取下“食物摄入”标签。
   2. 为CAF饲养笼准备新鲜的CAF饮食。
   3. 每个 CAF 笼具
      1. 记录水、饲料和蔗糖的重量。
      2. 移除笼盖和环境丰富物。
      3. 小心地将CAF组织碎片从垫料中取出，并放入不同的容器中。先移除较大的组织块，然后使用轻柔的扫动动作，系统地将笼内垫料从一端到另一端彻底筛检一遍。
         注意： 收集食物时，应对每个笼子保持相同的谨慎程度。记录下特别杂乱的笼子位置——在某些情况下，大鼠会将食物块或饼干研磨成细粉，难以收集，这可能导致食物摄入量的测量值被人为高估。
      4. 将新的CAF饮食分散放置于笼内，恢复环境丰富化物品，盖上笼盖并放回笼架，取下“食物摄入”标识。
      5. 记录每种CAF食物的重量，精确至0.1 g。用初始食物重量减去剩余食物重量，计算每笼食物总消耗量，然后除以每笼大鼠数量（假设摄入量相等）。
      6. 将每种食物的消耗量（克/只大鼠）乘以制造商提供的能量密度（千焦/克）。
         注意： 为计算宏量营养素摄入量，我们采用以下能量密度值：碳水化合物和蛋白质为16.7 kJ/g，脂肪为37 kJ/g。

结果

如图2A所示，基于三组雄性Sprague Dawley大鼠的数据，与普通饲料对照组相比，CA F饮食导致能量摄入量增加2.5倍，该差异在6周内保持稳定。其他研究已证实，这种程度的摄食过多在持续10²¹和16²²周的实验中仍可维持。体重变化曲线（图2B）显示，在饮食干预3–4周后，CA F饮食组与对照组之间的平均体重差异达到20%，这一增幅与人类肥胖发生初期的体重增长程度相当。在第6周时，CA F组与对照组之间的平均体重增长差异达67%（图2C），通过EchoMRI测定的体脂率约增加一倍（图2D）。食用自助餐式饲料的大鼠通常每日摄入其总能量的5–10%为普通饲料（约5 g/只...

讨论

通过让大鼠接触多种高脂肪、高糖且适口性极佳的食物，本文所述的CAF饮食方案为许多人群所食用的所谓“西方饮食”提供了一种可靠且稳定的动物模型。在暴露后的最初24小时内即可观察到摄食过多——表现为与对照组相比能量摄入显著增加，数周内即可观察到具有统计学意义的体重差异。因此，CAF是啮齿类动物饮食诱导肥胖的一种有效模型。

多项研究报道，与纯化高脂（HF）或高脂高糖（HFHS）饮食相比，自助餐式（CAF）饮食会导致更显著的肥胖表型。Sampey 等人²⁶发现，与饲喂高脂饮食的大鼠相比，CAF饮食暴露导致更严重的肝脏和脂肪组织炎症、更差的葡萄糖耐受能力以及更强的胰岛素抵抗。尽管该研究采用的是以猪油为基础的高脂饮食（HFD），但另外两项实验发现，与基于黄油²⁷和椰子油²⁸的高脂饮食相比，CAF饮食会进一步增加体脂含量。类似地，Higa 等人发现，在小鼠中，尽管高脂饮食和CAF饮食均会增加内脏脂肪（相对于对照饮食），但只有CAF饮食会增加摄食量，并加速高...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-5 L 塑料瓶			配制10%蔗糖溶液（如适用）
砧板			建议使用塑料制品
冷冻机			用于储存 CAF 食品
戈登氏维持性啮齿类动物饲料	戈登特种饲料（澳大利亚）		我们实验室使用的维持饮食（14 kJ/g；碳水化合物占65%，脂肪占13%，蛋白质占22%，以能量计）
大型塑料储物箱			上述所有物品均可存放于容器中，以便于取用
大勺			用于 CAF 饮食制备
微波			对于 CAF 饮食解冻（如需要时）
非锯齿刀			用于 CAF 饮食制备
纸巾			在制备CAF过程中，清洁工作台面和刀具至关重要
塑料容器			这些用于在测量日称量 CAF 食物样品
塑料漏斗			配制10%蔗糖溶液（如适用）
红光			由于CAF饮食应在每天暗期开始前更换，因此在黑暗环境中操作时可使用红光辅助
金枪鱼罐头			用于盛装含水量较高的 CAF 食物样品。塑料容器也可能适用
称量容器 × 3			应使用不同的容器分别称量大鼠和饲料 &和瓶子，以及咖啡因食品
体重秤			建议使用感量为 0.1 g 的天平
白砂糖			如适用，配制10%蔗糖溶液