यहाँ प्रस्तुत pachytene spermatocytes, गोल शुक्राणुओं को समृद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल है, और वयस्क माउस testes से बढ़ते शुक्राणुओं मानक प्रयोगशाला उपकरण ों के साथ एक discontinuous गोवाइन सीरम एल्बुमिन घनत्व ढाल का उपयोग कर.
शुक्राणुजनन के प्रत्येक चरण की विशेषता के लिए, शोधकर्ताओं को रोगाणु कोशिकाओं के विभिन्न उप-जनसंख्या को वृषणों से अलग करना चाहिए। हालांकि, अलग अलग आबादी को अलग करना चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि वयस्क वृषण में कायिक कोशिकाओं की कुछ आबादी के साथ शुक्राणुजनन के सभी चरणों से रोगाणु कोशिकाओं का एक जटिल मिश्रण होता है। पिछले कुछ दशकों में, विभिन्न तकनीकों जैसे केन्द्रापसारक उन्मूलन, फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (एफएसीएस), और एसटीए-PUT को रोगाणु कोशिकाओं के अलगाव के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। एक दोष यह है कि वे सभी समर्पित उपकरणों और विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता है. एसटीए-PUT विधि अंतर्निहित सिद्धांतों के बाद, pachytene spermatocytes के अलगाव के लिए एक सरल प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, गोल spermatids, और माउस testes से लंबे शुक्राणु. वृषण कोशिकाओं के एक एकल सेल निलंबन की तैयारी के बाद, विशिष्ट सेल आबादी एक discontinuous गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) घनत्व ढाल के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण अवसादन से समृद्ध हैं. कोशिका अंश तो मैन्युअल रूप से एकत्र कर रहे हैं और सूक्ष्म विश्लेषण किया. गोल शुक्राणुओं के लिए यह संशोधित घनत्व ढाल (एमडीआर) अवसादन प्रोटोकॉल व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है, क्योंकि यह केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणकी आवश्यकता है. इसके अलावा, प्रोटोकॉल कम से कम शुरू सामग्री की आवश्यकता है, इसकी लागत और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग को कम करने.
स्तनधारी शुक्राणुजनन के दौरान होने वाली आणविक और जैविक घटनाओं के बारे में बहुत कुछ पता नहीं है, एक जटिल प्रक्रिया जिसमें शुक्राणुजनक स्टेम कोशिकाएं अत्यधिक विशिष्ट शुक्राणुजोआ1,2में परिवर्तित हो जाती हैं . शुक्राणुजनन वृषण के अर्धनीफेरस नलिकाओं के अंदर होता है। नलिकाओं में विभेद के प्रत्येक चरण से रोगाणु कोशिकाओं का मिश्रण होता है, जिसमें शुक्राणुजनक स्टेम सेल, माइटोटिक रूप से शुक्राणुओं को विभाजित करना, मेरियोटिक शुक्राणुकोशिकाएं, और डािमियोटिक शुक्राणुओं (जो गोल से अगुणित विभेदक होते हैं) शुक्राणुओं को लंबा करने के लिए शुक्राणु, और अंत में परिपक्व शुक्राणुजोआ के लिए). वृषण की कायिक कोशिकाओं में सेर्तोली कोशिकाओं को शामिल किया गया है जो अर्धनारीश्य नलिकाओं के अंदर रोगाणु कोशिकाओं के साथ intermingled हैं, peritubular myoid कोशिकाओं है कि ट्यूब्यूल की दीवारों के रूप में, और टेस्टोस्टेरोन का उत्पादन Leydig कोशिकाओं ट्यूब्यूल्स के बीच अंतरालीय अंतरिक्ष में.
शुक्राणुजनन के दौरान आणविक और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं का अध्ययन अक्सर वृषण कोशिकाओं के एक जटिल मिश्रण से अलग रोगाणु कोशिकाओं की जुदाई की आवश्यकता है. सेल संवर्धन के लिए कई अलग-अलग कार्यनीतियां विकसित की गई हैं। सबसे सफल तरीके हैं एसटीए-पुट वेग अवसादन इकाई गुरुत्वाकर्षण3,4,5,6, केन्द्रापसारक उन्मूलन के आधार पर प्रतिप्रवाह केन्द्रीकरण7,8, और फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) जो डीएनए सामग्री और/या विशिष्ट मार्कर के अनुसार कोशिकाओं को अलग करता है। इन तरीकों आमतौर पर शुक्राणुजनन शोधकर्ताओं के बीच उपयोग किया जाता है और विशिष्ट रोगाणु सेल प्रकार के कुशल संवर्धन के लिए अनुमति देते हैं. हालांकि, इन तकनीकों की एक सीमा है कि वे विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है कि विशेष, महंगा हार्डवेयर की आवश्यकता है.
यहाँ प्रस्तुत माउस testes के तीन सबसे प्रचुर मात्रा में सेल आबादी की समृद्ध आबादी को अलग करने के लिए एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल है: दौर शुक्राणुओं, pachytene spermatocytes, और लंबी spermatids. इस प्रोटोकॉल दौर spermatids (एमडीआर) के लिए संशोधित घनत्व ढाल के रूप में जाना जाता है, क्योंकि यह दौर spermatids को समृद्ध करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से काम करता है. एमडीआर विधि एसटीए-पुट वेग अवसादन के रूप में एक ही सिद्धांतों पर आधारित है, अभी तक यह केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है. जीवित कोशिकाओं को पृथ्वी के गुरुत्वाकर्षण क्षेत्र के तहत एक मानक 50 एमएल ट्यूब के अंदर मैन्युअल रूप से तैयार discontinuous विच्छिन्न सीरम एल्बुमिन (BSA) घनत्व ढाल के माध्यम से तलछट करने के लिए अनुमति दी जाती है। बड़ी कोशिकाएं प्रवणता के माध्यम से तेजी से गति करती हैं, जो रोगाणु कोशिकाओं की विभिन्न आबादियों को अलग करती हैं। अवसादन के बाद, तीन सेल प्रकारों के समृद्ध अंश मैन्युअल रूप से एकत्र किए जाते हैं। इन समृद्ध कोशिका ओंपियों की शुद्धता एसटीए-PUT और केन्द्रापसारक उन्मूलन द्वारा प्राप्त की गई आबादी के बराबर है।
वेग अवसादन के लिए बीएसए ढाल के निर्माण और उपयोग को कवर करने के अलावा, प्रोटोकॉल भी अर्द्धनीफेरस ट्यूब्यूल से वृषण कोशिकाओं को जारी करने के लिए एक पाचन विधि का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल कि Romrell एट अल9 द्वारा विकसित से संशोधित किया गया था और collagenase चतुर्थ और trypsin के साथ अनुक्रमिक पाचन भी शामिल है. एक बाइकार्बोनेट बफर (अर्थात, क्रेब्स समाधान) के उपयोग के साथ संयुक्त अनुक्रमिक पाचनों को रोगाणु कोशिकाओं की पृथक्करण और व्यवहार्यता को बहुत अधिक बढ़ाने के लिए दर्शाया गयाहै 9।
एमडीआर संवर्धन के दौरान, कोशिकाओं के आसपास खर्च 4 ज एक साथ seminiferous tubules के वातावरण के बाहर और तनावपूर्ण यांत्रिक बलों के अधीन नहीं हैं, जो बहाव विश्लेषण के लिए अत्यधिक व्यवहार्य सेलुलर अंशों के संग्रह के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, केन्द्रापसारक उन्मूलन और एसटीए-PUT के समान, एमडीआर प्रोटोकॉल में कोशिकाओं के किसी भी रासायनिक उपचार या लेबलिंग की आवश्यकता नहीं होती है, जो उनकी व्यवहार्यता को बनाए रखने में भी मदद करता है। महत्वपूर्ण बात, के रूप में छोटे रूप में दो वयस्क माउस testes एमडीआर अलगाव के लिए पर्याप्त हैं और इसलिए, एक वयस्क माउस दोनों आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए पर्याप्त समृद्ध कोशिकाओं प्रदान करता है. मानक STA-PUT प्रोटोकॉल सेलअलगाव6 के लिए के रूप में कई के रूप में 12 वयस्क चूहों के उपयोग की सिफारिश की; हालांकि, पूर्व अनुभव के आधार पर, यह ज्ञात है कि सफल अलगाव तीन से चार वयस्क चूहों से किया जा सकता है. केन्द्रापसारक एल्यूट्रेशन के लिए पर्याप्त होने की सूचना दी प्रारंभिक सामग्री की सबसे कम मात्रा छह माउस testes (तीन चूहों)8है. इसलिए, महंगे विशेष उपकरणों की आवश्यकता को समाप्त करने के अलावा, एमडीआर प्रोटोकॉल आवश्यक प्रयोगशाला पशुओं की संख्या को कम कर देता है।
यहाँ प्रस्तुत एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल दौर शुक्राणुओं की समृद्ध आबादी को अलग करने के लिए है, pachytene spermatocytes, और मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग कर spermatids लंबा (चित्र4 में दिखाया प्रोटोकॉल का अवलोकन). हालांकि कोई विशेषज्ञता या महंगी मशीनरी की आवश्यकता है, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि ऊतक पाचन के दौरान विचार किया जाना चाहिए रहे हैं, ढाल के निर्माण, और ढाल पर सेल निलंबन की लोडिंग.
रोगाणु कोशिकाओं को लगातार एंजाइमी पाचनों द्वारा अर्धनाश नलिकाओं से जारी किया जाता है। कोलैजाज़ चतुर्थ के साथ पहला पाचन अंतरालीय कोशिकाओं को हटाने के द्वारा seminiferous ट्यूब्यूल अलग करता है। लंबे समय तक पाचन समय ट्यूबल को नुकसान पहुंचा सकता है और शुक्राणुओं की हानि का कारण बन सकता है, क्योंकि (यदि इस चरण के दौरान ट्यूबल से जारी किया जाता है) वे निम्न चरणों में छोड़ दिए जाएंगे। ट्रिप्सिन के साथ दूसरा पाचन चरण अर्धनीशुक्र नलिकाओं से रोगाणु कोशिकाओं को मुक्त करता है। वहाँ कभी कभी सेल lysis हो सकता है और आम तौर पर कुछ clumps जारी जीनोमिक डीएनए के कारण फार्म. पाचन की सिफारिश की अवधि या तापमान से अधिक की सलाह नहीं दी जाती है, क्योंकि इससे गरीब व्यवहार्यता, सेल lysis में वृद्धि हो सकती है, और क्लंपिंग हो सकती है। यदि हल्के clumping होता है, clumps नजरअंदाज किया जा सकता है. हालांकि, महत्वपूर्ण clumping और कोशिकाओं की हानि के मामलों में, trypsin पाचन समय या एकाग्रता कम किया जाना चाहिए. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि ट्रिप्सिन की एंजाइमी गतिविधि बैचों के बीच और भंडारण के लंबे समय के दौरान भिन्न हो सकती है। Trypsin पाचन के दौरान DNase मैं की मात्रा भी अतिरिक्त clumps को दूर करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, लेकिन यह एक माध्यमिक समाधान माना जाना चाहिए. पूर्व-उपचार के अंत में एक समरूप एकल सेल निलंबन प्राप्त करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि क्लंप्ड कोशिकाएं तेजी से तलछट करेंगी, भिन्नों को दूषित करेंगी और ढाल को बाधित करेंगी।
ग्रेडिएंट का निर्माण करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है. यदि एक पिपेट नियंत्रक के साथ एक 5 एमएल पिपेट टिप का उपयोग कर परेशानी है, यह एक चिकनी पिस्टन के साथ एक सामान्य 1 एमएल यांत्रिक पिपेट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है तो व्यास में $ 3 मिमी के एक एपर्चर के लिए पिपेट युक्तियों में कटौती (चित्र 1बी)। बीएसए समाधान की एक व्यापक एपर्चर और चिकनी लोडिंग ढाल मिश्रण का खतरा कम हो जाएगा। जब ठीक से तैयार किया जाता है, तो उनके विभिन्न अपवर्तक सूचकांकों के कारण आसन्न बीएसए समाधानों के बीच की सीमाओं को देखना संभव है। ग्रेडिएंट का उपयोग करने से पहले सीधे उत्पादित किया जाना चाहिए। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि कोई भी छोटा मिलाते हुए या कंपन ढाल को परेशान कर सकता है, इसलिए ढाल को ऐसे वातावरण में स्थापित किया जाना चाहिए जहां इसे परेशान नहीं किया जाएगा।
ग्रेडिएंट पर सेल निलंबन की लोडिंग बहुत सावधानी से की जानी चाहिए। लोड करने के बाद, सेल निलंबन ढाल के शीर्ष पर रहना चाहिए, जिसमें से कोशिकाओं को धीरे-धीरे पहली परत के माध्यम से तलछट करने के लिए शुरू कर देंगे। यदि कोशिकाओं के बड़े समूहों को ग्रेडिएंट के माध्यम से तेजी से आगे बढ़ते हुए देखा जाता है, तो कोशिकाओं को संभवतः सावधानी से पुन: निलंबित नहीं किया गया था या अतिरिक्त झुरमुट है। यदि कोशिकाओं लोड हो रहा है पर discontinuous बीएसए ढाल के शीर्ष पर नहीं रहते हैं, लेकिन तुरंत 1% और 2% बीएसए परतों (चरण 3.6) के बीच सिंक, सेल निलंबन की संभावना भी घने है. इस प्रोटोकॉल एक वयस्क माउस के दो testes का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है (80-120 mg/testis) प्रारंभिक सामग्री के रूप में; हालांकि, शुरू सामग्री की कम मात्रा का उपयोग कर सफल isolations किया गया है. प्रोटोकॉल upscale और testes की उच्च संख्या से अधिक समृद्ध रोगाणु कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, ढाल के साथ अधिक 50 एमएल ट्यूब शुरू किया जाना चाहिए.
प्रोटोकॉल शुरू में विकसित किया गया था और वयस्क माउस testes से अगुणित दौर शुक्राणुओं को समृद्ध करने के लिए अनुकूलित, और दौर spermatid अंशों की शुद्धता से अधिक होने की उम्मीद है 90%. अत्यधिक शुद्ध दौर spermatid अंशों के अलावा, pachytene spermatocytes और लंबी spermatids के संवर्धन के लिए संतोषजनक परिणाम प्राप्त किए गए. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एरिथ्रोसाइट्स लंबे शुक्राणुओं के अंशों को दूषित कर सकते हैं, और उन्हें खत्म करने के लिए आगे कदम उठाए जाने चाहिए यदि उनकी उपस्थिति से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में हस्तक्षेप करने की उम्मीद की जाती है। हम एमडीआर प्रोटोकॉल का उपयोग कर वयस्क चूहों से premeiotic या जल्दी meiotic कोशिकाओं (pachytene चरण के लिए पूर्व) के रूप में अन्य सेल प्रकार को समृद्ध करने में सक्षम नहीं किया गया है.
इसके अतिरिक्त, एसटीए-PUT अवसादन सफलतापूर्वक जन्म13के बाद दिए गए समय बिंदु पर एकत्र किशोर testes का उपयोग कर शुक्राणुगोनिया या preleptotene, लेप्टोटेन, और युग्मनज शुक्राणु कोशिकाओं के समृद्ध अंश प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह दृष्टिकोण शुक्राणुजनन की पहली लहर के दौरान इन कोशिका प्रकारों की उपस्थिति का लाभ लेता है। एक ही दृष्टिकोण की संभावना एमडीआर संवर्धन के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन यह अभी तक व्यवहार में परीक्षण नहीं किया गया है. एक अन्य विधि है कि भेदभाव के विशिष्ट चरणों में premeiotic और meiotic कोशिकाओं की शुद्धि के लिए एक अच्छा विकल्प है FACS है, जो उपस्थिति विशिष्ट मार्करों के आधार पर विशिष्ट कोशिकाओं प्रकार के अलगाव की अनुमति का महत्वपूर्ण लाभ है14 ,15,16,17.
कुल मिलाकर, एमडीआर वेग अवसादन रोगाणु सेल संवर्धन के लिए एक उपयोगी विधि के रूप में कार्य करता है। हालांकि इस विधि की शुद्धता या समृद्ध कोशिकाओं की मात्रा के मामले में अन्य अच्छी तरह से स्थापित तरीकों से बेहतर नहीं है, इसके स्पष्ट लाभ अपनी सादगी और कम सेट अप लागत हैं. यह, एक साथ आवश्यक प्रारंभिक सामग्री की कम राशि के साथ, इस प्रोटोकॉल spermatogenesis क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एक बढ़िया विकल्प प्रदान करते हैं और अन्य क्षेत्रों में जो विशेष हार्डवेयर या जानवरों के बड़े समूहों में निवेश करने की इच्छा नहीं हो सकता है.
The authors have nothing to disclose.
हम प्रोटोकॉल के विकास के दौरान उनके योगदान के लिए सभी कोटाजा प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं, और सक्रिय उपयोग और उनके अनुसंधान परियोजनाओं में प्रोटोकॉल के परीक्षण. विशेष रूप से हम प्रोटोकॉल के अनुकूलन में मदद के लिए जन Lindstrm के योगदान की सराहना करते हैं. इस अध्ययन फिनलैंड की अकादमी द्वारा समर्थित किया गया था, सिग्रिड Jus-lius फाउंडेशन, और आणविक चिकित्सा के Turku डॉक्टरेट कार्यक्रम.
4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
Dextrose | Preference of researcher | ||
DNase I | Worthington | LS006355 | |
GAPDH | HyTest | 5G4 | |
HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
KCl | Preference of researcher | ||
KH2PO4 | Preference of researcher | ||
MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
NaCl | Preference of researcher | ||
NaHCO3 | Preference of researcher | ||
NH4Cl | Preference of researcher | ||
Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
Trypsin | Worthington | LS003703 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1.5 mL or 2 ml tubes | Preference of researcher | ||
40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
cell culture incubator | Preference of researcher | ||
centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
microdissection scissors | Preference of researcher | ||
microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
tips for 1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
water bath | Preference of researcher | ||
widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |