Summary
כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו מועסקים התמונה המרצפת הדנדריטי מאוד בהכנה חיה של המוח הזחל Drosophila ילה , ואת הפרוטוקול שפיתחנו לכמת זמן קפיצה 3d מערכות הדמיה עבור הערכות כמותית של דנדט דינמיקה בפיתוח נוירונים.
Abstract
מאוד מורצפת הדנדריטים הדנדרידיה נמצאים באופן נרחב בנוירונים בשלבים התפתחותיים מוקדם. הענפים הדינמיים הללו מדגימות את הסביבה ומפעילים אנשי קשר עם שותפים סינפטיים פוטנציאליים. למרות הקשר בין הדינמיקה של הענף הדנדריטי לבין synaptogenesis הוא מבוסס היטב, כיצד תהליכים התפתחותיים ותלויי פעילות לווסת את הדינמיקה ענף הדנדריטים אינו מובן היטב. זה בחלקו בשל הקשיים הטכניים הקשורים הדמיה חיה ניתוחים כמותיים של אלה מבנים בסדר באמצעות מערכת vivo. הקמנו שיטה לחקור את הדינמיקה של הדנדריטים באמצעות דרוסופילה זחל ונטולי לרוחב נוירונים (lnvs), אשר ניתן לתייג באופן אינדיבידואלי באמצעות גישות גנטיות ונגישים להדמיה חיה. ניצול של מערכת זו, פיתחנו פרוטוקולים כדי ללכוד את הדינמיקה הענף של הארבור הדנדריטים כולו של מסומן בודד באמצעות הדמיה בזמן ההדמיה חי. לאחר מכן בוצעו לאחר עיבוד כדי לשפר את איכות התמונה באמצעות תיקון הסחף ופירוק, ואחריו ניתוח דינמיקת הענף ברמת הענף היחיד על ידי ביאור מיקומים מרחביים של כל מסופי הסניפים. לבסוף, פיתחנו R סקריפטים (קובץ משלים) ופרמטרים ספציפיים כדי לכמת את הענף דינמיקה באמצעות מידע הקואורדינטות שנוצר על ידי מעקב הטרמינל. באופן קולקטיבי, פרוטוקול זה מאפשר לנו להשיג תיאור כמותי מפורט של הדינמיקה הענף של ארבור הדנדריטי העצבי עם הזמן הגבוה ורזולוציה מרחבית. השיטות שפיתחנו חלות בדרך כלל על נוירונים בעלי תוויות בדלילות הן בתוך מבחנה והן בתנאים vivo.
Introduction
הדנדריטים הם תאי עצבים מיוחדים המקבלים ומעבדים את הקלט החושי והסינפטית. המבנה המורכב והסטרמוקליד של סוכת דנדריטי כבר תחת חקירה אינטנסיבית מאז גילויו. מספר מערכות מודל, כולל הנוירונים האופטיים tectal אופטי, בחורה ברשתית גנגליון תאים, ו arborization הדנדריטים (da) נוירונים במערכת Drosophila ילה , הוקמו כדי ללמוד את הפיתוח, שיפוץ ופלסטיות של . דנדריטים כפתונטים1,2,3,4 דרוזופילה ונטלי נוירונים לרוחב (lnvs) הם קבוצה של נוירונים הקרנה חזותית מזוהה בתחילה עבור הפונקציות החשובות שלהם בוויסות אחראי של התנהגויות לטוס5. מחקרים גם חשפו את התפקיד של זחל החוצה כיעד הפוסט-סינפטיות הישיר של הזחל הפוטוקטורים (PRs)6,7. חשוב לעשות זאת, כאשר מדובר בפיתוח זחלים במשטרים אור שונים, משפיע בחריפות על גודל הארבורס הדנדריטי, הממחיש את ההתאמה של אינvs כמודל חדש לחקר הפלסטיות הדנדריטי7. העבודה האחרונה מהקבוצה שלנו מצביעה עוד על כך שהגודל של הדנדריטים המורק וההתנהגות הדינמית של הענפים הדנדריטים מציגים הפלסטיות התלוי בחוויית החוויה8,9. כחלק מעבודה זו, פיתחנו הדמיה חדשה ופרוטוקול הקוונפיקציה לבצע ניתוח על הדינמיקה הדנדריטים של lnvsמ 2 או 3 הזחלים סינטסיומאיה.
האופי השקוף של מוח הזחל דרוזוהילה הופך אותו לאידיאלי להדמיה חיה. עם זאת, סוכת הדנדריטים של lnvs ממוקמים בצפיפות innervated זחל אופטית נוירופיל (LON) במרכז האונה המוח זחל6. כדי ללכוד את התמונות של ענפים דנדריטים בסדר הרקמה ברקמת המוח שלמים, אנו מנצלים שני פוטון מיקרוסקופ, אשר מגדיל את העומק של חדירה אור ומפחית את הרעילות במהלך ניסויים הדמיה חיה10. באמצעות התקנה זו, בוצע בהצלחה ניסויים הדמיה חיה על LNvs במשך 30 דקות בלי להתבונן הידרדרות מורפולוגית הברורה של העצב. בנוסף, מניפולציות גנטיות באמצעות הטכניקה להעיף החוצה איפשר לנו לתייג את האינvs הבודד עם קרום מתויג gfp, אשר גם קריטי לניטור התנועות של ענפים בודדים11,12,13 .
כדי ללכוד את ההתנהגות הדינמית של כל הענפים על הארבור הדנדריטי עם הרזולוציה האופטית האופטימלית, הצלחנו לבצע הדמיה תלת-ממדית על-ידי הדמייה מוחית של זחל טרי עם רזולוציה מרחבית גבוהה ב 1 דקות לכל מסגרת עבור 10 עד 30 דקות. פיתוח מידע דנדריטים הם דינמיים מאוד, עם אחוז גדול של ענפים המציגים שינויים הנצפה בתוך החלון 10 דקות. זה מוביל לאחד האתגרים הטכניים העיקריים של לימוד הדינמיקה של הדנדריטים, התנהגות הענף ככמת מבוסס על ערכות נתוני התמונה 4-d. שיטות שנקבעו בעבר יש מגבלות שונות, כולל חוסר דיוק ודרישות זמן מופרז. לכן, פיתחנו למחצה אוטומטי שיטה המשלבת עיבוד לאחר התמונה, סימון ידני של מסופי הסניפים, ו-4D אוטומטי העקיבה באמצעות תוכנה ביאור תמונה. אנו מחשבים את התנועות של מסופי הענף בנקודות זמן שונות המבוססות על קואורדינטות 3D של הנקודות. לאחר מכן הנתונים יוצאו ונותחו כדי לייצר מדידות כמותיים של דינמיקת הענף. שיטה זו מעריך במדויק את המשך וההיקף של אירועי הארכה והנסיגה של ענפים קיימים, כמו גם היווצרות של ענפים חדשים, ומאפשר לנו לנטר את הדינמיקה של הדנדריטים במספר רב של נוירונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
זהירות: פרוטוקול זה כולל את השימוש של מחלקה IV לייזרים ידרוש הכשרה נאותה והנחיות בטיחות לעקוב. להימנע עין או חשיפה לעור לאור לייזר ישיר או מפוזר.
הערה: הפרוטוקול כולל שישה שלבים. זרימת העבודה מוצגת באיור 1א.
1. תיוג נוירונים בודדים באמצעות טכניקת פליפ-out
הערה: התיוג היחיד של LNvs מושגת על ידי הבעת mCD8:: GFP ב-LNvs בודד באמצעות בזלזול-בתיווך סטוכסטי תיוג. הגנוטיפ של קו הזבוב הוא: hs-flp; Pdf-Gal4; Uas-frt-CD2-להפסיק-frt-mCD8:: gfp11,12,13. תדירות השגת היחידה המסומנת בתווית אחת היא כ -10%. מניות הזבוב נשמרות במדיום הסטנדרטי בcircadian-ומבוקרת לחות של 25 ° c.
- לאסוף 100-200 ביצים בתוך 2 החלון h הפריה העמוד על צלחת מיץ ענבים עם תוספת שמרים. מחדש את העוברים ב 25 ° צ' עבור 24 שעות ולאסוף הזחלים הראשונים שבקע הראשון לשלב הבא.
- מחממים את הזחלים הראשונים שבקעו ב-37.5 ° c במשך 40 דקות, עם תקופת החלמה של 40 דקות באמצע.
- תרבות הזחלים ב -25 ° c עם שולטת מעגליות ולחות לשלב ההתפתחותי הרצוי.
2. מתנגדים והרכבה זחל המוח הגובר
- נתח מוחות זחל בתמיסה הפיסיולוגית החיצונית (120 מ"מ מילימטר, 4 מ"מ MgCl2, 3 מ"מ kcl, 10 Mm נחקו3, 10 מ"מ סוכר, 10 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ, 10 מ"מ Hepes, 2 מ"מ Ca2 +, PH 7.2) תחת מיקרוסקופ לנתיחה (4.5 x הגדלה כוח) עם שני זוגות של #5 מלקחיים לחיתוך בקצה הרגיל (11 ס מ). השתמש זוג אחד של מלקחיים כדי להחזיק את הזחל הגוף במקום והשני כדי לנתח בזהירות את המוח. שמור על דיסקי העין, אונות המוח וחוט העצב הגחוני. הסר את השרירים המחוברים כדי למזער את התנועות לדוגמה במהלך ההדמיה.
- להכין שקופית זכוכית (25 x 75 x 1.0 מ"מ3) ולהשתמש במזרק כדי לצייר תא מרובע עם שומן ואקום.
- הוסף 20 μL של פתרון מלוחים חיצוניים לחדר מרובע עם מחסומי גריז.
- להעביר את המוח הזחל גזור לתוך התא על שקופית זכוכית באמצעות מלקחיים. התאימו את מיקום המוח מתחת לטווח החיתוך כדי להבטיח את הפנים הצדדיות.
- כסו את החדר עם כיסוי זכוכית (22 x 22 x 0.15 מ"מ3). המוח הזחל מותקן כעת על השקופית בתוך חדר מלא בתמיסה מלוחים חיצונית (איור 1ב).
הערה: הקשה בעדינות על הכיסויים מגבילה את המוח ומפחית את מדגם הנסחף בהפעלת ההדמיה הבאה.
3. הזמן פקיעה הדמיה חיה
הערה: אנו מבצעים ניסויים בהדמיה בזמן שימוש במיקרוסקופ מוקדי המצויד בלייזר רב-פוטון. יש לכוונן את פרמטרי הרכישה לצורך הגדרות דימות אחרות.
- זיהוי מתקני המוח המכילים נוירונים המסומנים בנפרד באמצעות מטרה טבילה במים 40X (NA 1.3) ו מקור אור פלורסנט. עבור אוסף תמונות, השתמש בלייזר שני פוטון מכוון 920 ננומטר וגלאי שאינו מקובץ (NDD).
- לאסוף תמונות ב 512 x 512 פיקסלים לכל מסגרת ו 1 דקות לכל Z-מחסנית עבור 10 דקות. כוונן את הזום האופטי והדיגיטלי כדי להשיג רזולוציה מספקת של x-y-Z תוך הקפדה על הכיסוי של הארבור הדנדריטים כולה בתוך 1 דקות (איור 2, וידאו משלים 1). ההגדרות יוצרות תמונות ברזולוציה של x-y-z טיפוסית של 0.11 x 0.11 x 0.25 יקרומטר3.
- לאסוף את הזמן סדרת תמונה בתוך 30 דקות של קרע במוח. נתונים עם סחיפה מוגזמת או הידרדרות מורפולוגית ברורה צריך להיות מחוץ לעיבוד וכימות.
4. תיקון ופירוק הסחף
הערה: בהתאם לאיכות התמונה, שני השלבים הם אופציונליים אך מומלצים מאוד.
- פתח קובץ תמונה שנרכש עם תוכנת תיקון סחיפה. ערוך פרמטרים מיקרוסקופיים כדי להתאים לאלה המשמשים לניסוי. עבור התוכנה (ראה טבלת חומרים), לחץ על עריכה | ערוך פרמטרים מיקרוסקופיים. קבע סוג מיקרוסקופ כשדה שטח עבור תמונות בשתי פוטון אם אין אפשרות לשני פוטונים ופעל בהתאם לזרימת העבודה המוגדרת על-ידי התוכנה. לדוגמה, פתח את הלשונית לפירוק | מייצב אובייקטובחר באפשרות ' ייצוב מסגרות זמן'.
- פתח את התמונה מתוקנת להיסחף בתוכנה לפירוק ובצע את זרימת העבודה שלה. עבור התוכנה (ראה טבלת חומרים), בחר את התמונה הייצוב ולאחר מכן לחץ על פירוק | לפירוק האקספרס. כדי לקבל תוצאה טובה יותר, כוונן בצורה משופרת את הפרמטרים באמצעות אשף פירוק.
- שמור את התמונה לפירוק בסוג קובץ הנתמך על ידי התוכנה ביאור תמונה הבאים מסוגל לנתח נתונים 4D ודיווח על קואורדינטות מרחבית של נקודות מוגדרות בתמונה (ראה טבלת חומרים).
5. ביאור תמונה
- פתחו את התמונה לפירוק בתוכנת הביאור של התמונה. בדוק וסמן עצות בענף בכל נקודות הזמן ב-3D. תוכנת הביאור של התמונה מדווחת ומאחסנת את הקואורדינטות המרחבית והטמפורלית של תיאורי הענף המסומנים. יצא את מידע הקואורדינטות כקובץ. csv לצורך חישובים עוקבים.
הערה: שני השלבים הבאים הם ספציפיים לתוכנת הביאור בה השתמשנו (ראה טבלת חומרים). ייתכן שזרימת העבודה שונה עבור תוכנות אחרות. - בתוך המודול ' נקודות ', לחץ על 'דלג על יצירה אוטומטית, ערוך באופן ידני' ובדוק את תיבת הסימון 'התחבר אוטומטית לספוט שנבחר' (איור 3א). עבור על המסגרות בסידרת הזמן ובחר ענף לביאור. החזק את המקש Shift ולחץ על קצה המסוף של ההסתעפות כדי להוסיף נקודה. לחץ על כל נקודות הזמן.
הערה: תוכנת הביאור של התמונה מחברת בין הנקודות בין מסגרות ויוצרת מסלול באופן אוטומטי. המידע המרחבי והזמני של תיאורי הענף משויך כעת לנקודות מסומנות. חזור על שלבים אלה עד לקבלת כל תיאורי הסתעפות (איור 3ב). - בתוך המודול ' נקודות ', לחצו על הכרטיסייה ' סטטיסטיקה ', בחרו באפשרות ' מפורט ' ובחרו ערכים ספציפיים | . בעמדהשלך מידע הקואורדינטות המרחבי והזמני המוקלט יוצג. לחץ על שמור בתחתית כדי לייצא מידע זה כקובץ Csv (איור 3ג).
6. חישוב הענף הדנדריטים דינמיקה
הערה: באמצעות מידע הקואורדינטות, ניתן לחשב בקלות עקירה של עצות ההסתעפות ב-3D. במחקר שלנו, כל תנועות הענף הדנדריטי מסווגים כשלוחה או הנסיגה. השלבים שלהלן מתארים כיצד לעבד את קבצי ה-. csv באמצעות קבצי script מותאמים אישית של R (קובץ משלים) ועל-ידי הוספת המידע כווני באמצעות עריכה ידנית.
- פתח את קובץ ה-. csv כגיליון אלקטרוני. בחרו בעמודת מזהה הרצועה , לחצו על האפשרות ' מיון קטן לגדול ביותר ' ולקבלת הרחבת הבחירה. לאחר המיון, מזהה הרצועה מזהה כל ענף דנדריטי ייחודי, וכתמים מאותו ענף חולקים את אותו מזהה רצועה. העמודה Time מאחסנת את המידע של מסגרות זמן שונות.
- בגיליון האלקטרוני, הוסף עמודת מרחק . חשב את המרחק של כל שני כתמים סמוכים באופן זמני באמצעות נקודות הציון שלהם ולשים את הערכים בעמודה המרחק (איור 4א).
- תנועות משניות ברמת voxel אחת. בהתבסס על הגדרות דימות, 0.3 יקרומטר הם בדרך כלל פריטים מתוך הביאור נסחף או ביאור תמונה לא מושלם. סנן תנועות אלה על-ידי איפוס ערכי המרחק הקטנים מ-0.3 יקרומטר ל-0. עבד קבצי. csv מרובים באופן ידני או השתמש בסינון עמודת ה-script של האצווה שלנו. R (קובץ משלים).
- צור באופן ידני עמודה חדשה בשם הזחה בגיליון האלקטרוני. העתק את הערכים מעמודת המרחק לעמודה הזחה . הקצה באופן ידני את אירועי ההרחבה והנסיגה עבור כל קצה ענף. אם זוהי הארכה, השאר את ערך ההזחה ללא שינוי, שהוא ערך חיובי. אם זוהי הכחשה, שנה את ערך ההזחה המתאים לערך שלילי (לדוגמה, 0.35 to-0.35) (איור 4ב).
- צור עמודה חדשה בשם אירוע. בעמודה זו, סכם באופן ידני את ערכי ההזחה עבור אירועי הארכה והנסיגה הבודדים (איור 4ב).
- לעבד את הגיליון האלקטרוני שהשתנה ולכמת את הסיומת ואת אירועי הנסיגה בהתבסס על ערכי התזוזה שלהם באמצעות סיכום העמודה של האצווה הסקריפט. R (קובץ משלים). פרמטרי הפלט כוללים את מספר אירועי ההרחבה, מספר אירועי הנסיגה, אורך מצטבר מורחב, אורך מצטברושוב, אורך נטו השתנה, ואורך כולל נסע .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול הדמיה חיה המתואר לעיל, אנו ללכוד ערימות תמונה ברזולוציה גבוהה עבור ניתוחים וכימות הבאים. וידאו משלים 1 מראה את העוצמה המקסימלית מוקרן (mip) סדרת תמונה שנאסף נציג באופן אינדיבידואלי המסומן Lnv. איור 2B מציג את המיזוג המקביל של שמונה מסגרות של סדרת התמונות. בשני החלוניות, ראשי החצים מציינים אירועים וחיצים מציינים אירועי הרחבה.
לאחר מכן, אנו מבצעים מעקב אוטומטי למחצה של מסופי הסניפים באמצעות תוכנת ביאור תמונה (טבלת חומרים). איור 3 B מציג ביאורים של מסופי הסניפים הדינאמיים מנציג המסומן באופן אינדיבידואלי ל-Lnv. באמצעות תוכנה זו, אנו מדמיינים את ערימות התמונות ב-3d, מסמנים ידנית את כל מסופי הסניפים ומשתמשים במודול ' נקודות ' כדי לעקוב אחר תנועות המסופים בזמן תוכנה זו מייצרת מסלולים חותמת זמן עבור כל מסוף ענף מסומן, המשמש כייצוגים חזותיים של האירועים הדינמיים על הארבור הדנדריטי.
לאחר מכן נשתמש בנתוני הקואורדינטות מקצות הענף המארים כדי לחשב את הכיוון והמרחק של תנועות הענף בכל פעם. צילומי מסך באיור 4א, B להראות כיצד זה מושגת. הגיליונות האלקטרוניים המעובדים יוצרים קבצי פלט שאנו משתמשים בהם לכמת את הדינמיקה של הדנדריטים עם ארבעה פרמטרים, כולל אחוז הענפים הדינאמיים, מספר הענפים החדשים, המרחק המצטבר שעבר ומספר אירועי תנועת הענף. איור 4 ג . מראה השוואות של הדינמיקה של הענף הדנדריטי עבור היחידה המסומנת באופן אינדיבידואלי משלבים התפתחותיים שונים. בהתאם לממצאים בנוירונים ובתאי tectal, הדינמיקה של הדנדריטים מוסדרות14,15. ב-48-72 h לאחר הנחת ביצים, הינם דינמיים באופן משמעותי בהשוואה לאלה שבזחלים מבוגרים יותר, 96-120 h, כפי שנמדד בכל ארבעת הפרמטרים, והמעבר ההתפתחותי מהמצב הדינמי למצב יציב בין 72 ל-96 ח. ל.8.
איור 1: תהליך עבודה של הדמיה של הדינמיקה של הדנדריטים ושל פרוטוקול הקוונט. (א) הפרוטוקול מכיל שישה שלבים המכסים הכנה לדוגמה, אוסף תמונות, עיבוד תמונה וכימות למחצה אוטומטיות של הדינמיקה של הדנדריטים. (ב) תרשים סכמטי הממחיש את חדר ההדמיה המכיל את המוח הזחל שנטען עם הצד השמאלי למעלה. המוח החוקר יש מסומן בנפרד באופן אינדיבידואלי בכל אונה והוא שקוע בתמיסת המלח החיצוני. המחסומים שומן ואקום לתמוך במשקל של שמיכות וצורות תא קטן המונע את המוח מלזוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זמן הדמיה של הדינמיקה של הענף הדנדריטי ב-3d. (א) הארבור הדנדריטי של האדם המסומן באופן אינדיבידואלי מתוך זחלשלישי . (ב) תמונת המונטאז ' של (א) המדגימה את תנועות הענף הייצוגי. ראשי חץ (ירוק) מציינים אירועי הכחשה; החצים (אדום) לסמן אירועי הרחבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביאור ידני ומעקב אוטומטי של מסופי ענף דנדריטים בתוכנת ביאור תמונה. (א) צילום מסך מציג את ההגדרות עבור מעקב אחר מסוף הענף באמצעות המודול ' כתמים '. האליפסה האדומה מתווה את אפשרות המעקב הידנית . (ב) מסלולים בעלי חותמת זמן של מסופי סניפים מסומנים (כתמים צהובים) שנוצרו על ידי תוכנת הביאור של התמונה באופן אינדיבידואלי בקנה מידה של Lnv. Scale = 5 μm. (ג) מסך מראה את הממשק לצפייה ייצוא מידע הקואורדינטות מהמודול ' נקודות '. איור 3B השתנה מ שנג, C. ואח ' 20188. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כימות הדינמיקה של הענף הדנדריטי באמצעות מידע הקואורדינטות של מסופי הסניפים. (א) צילום מסך מציג את הגיליון האלקטרוני המכיל את קואורדינטות X, Y ו-Z, מזהי מעקב ונוסחה המשמשים לחישוב עקירה של נקודות במסגרות הסמוכות. (ב) צילום מסך מראה תוצאות מייצגות שהתקבלו ממעקב אחר ענף אחד. התנועות המשניות (< 0.3 μm) סוננו. הretractions מסומנים על-ידי הקצאת ערכם לשלילי (עמודת מרחק). על-ידי סיכום ערכים חיוביים/שליליים סמוכים, ההזחה של כל הרחבה/הכחשה ביולוגית מחושבת (עמודת אירועים). (ג) כימות הייצוג של התוצאות המציגות את הוויסות ההתפתחותי של הדינמיקה של הדנדריטים. נתונים מוצגים כגרש תיבה (תיבת, 25-75%; קו מרכז, חציון) מצופה בעלילה נקודה (נקודות נתונים בודדות). איור 4C השתנה מ שנג, C. ואח ' 20188. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו משלים 1: עשר מקסימום עוצמה הקרנה (MIP) תמונות שיחק במהירות של 2 מסגרות לשנייה. כל הארבור הדנדריטי. הייתה בתמונה ב-1 דקות לכל Z אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
קובץ משלים 1: סינון עמודות אצווה. R סקריפט. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
קובץ משלים 2: סיכום עמודת אצווה. R סקריפט . אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפיתחנו כדי להקליט ולכמת את ההתנהגות הדינמית של ענפים דנדריטים באופן אינדיבידואלי התווית נוירונים במוח זחל דרוסופילה . בעיקר, פרוטוקול ההדמיה החי שלנו מכיל פרמטרים ספציפיים שמאפשרים לנו ללכוד את כל הארבור הדנדריטי של זחל החוצה ולספק תצוגה גלובלית של המצב הדינמי של הענפים הדנדריטים שלה. עם זאת, בגלל שיטות הקוונציות שלנו מסתמכות בכבדות על הביאור של מסופי הענף, נוירונים עם מבנים דנדריטים מורכבים והארבורידים מרוכז אינם נושאים מתאימים לניתוח זה.
הכנה לדוגמה, רכישת תמונות ועיבוד שלאחר הם השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה. תמונות raw באיכות גבוהה של מודד יחיד הם חיוניים לקוונפיקציה מדויקת של הדינמיקה דנדט. הנתונים שלנו מצביעים על כך שהמיורפולוגיה של ה-LNv והתגובות הפיסיולוגיים שלה שמורים היטב במוח זחל מוכן בקפידה בתוך 30 דקות של ניתוח. דוגמאות עם הידרדרות רקמת המוח הנצפה, סוכת דנדריטי מוארך וענף שבירה לא צריך לשמש לדימות וכימות. למרות שהאופציה האופציונלית של מערכות נתונים עם רקע נמוך וללא תנועות מסוימות, אנו ממליצים בחום כולל תיקון הסחף ושלבי הפירוק כדי לשפר את איכות התמונה, החשובה לביאור של מסופי סניפים ואוטומטיים . מעקב אחר מקום מלבד התוכנה המסחרית המשמשת בלימודים שלנו, הסחף הנכון של הצילום התלת- ממדי של פיג'י (תוספים | רישום | נכון הסחף 3D) גם עובד היטב עבור תיקון הסחף.
אחד ההבדלים העיקריים בין הפרוטוקול שלנו לבין השיטות הקיימות היא שאנחנו עוקבים אחר התנועות של טיפים בענף הפרט אבל לא את כל הארבור הדנדריטי. שחזור של arbors הדנדריטים שלמים, למרות שימושי למדידת אורך הדנדריטי הכולל, הוא לא אידיאלי עבור מחקרים דינמיים באמצעות הדמיה 3D מערכות נתונים. עבור פרוסות מחסנית Z רצופות, תוכניות העקיבה האוטומטיות יוצרות בדרך כלל צירופים שונים של "ענפים" ומשחזרים את הארבור הדנדריטי באופן שונה, מה שהופך את ההשוואה לרמת ההסתעפות היחידה בין נקודות זמן שונות במיוחד קשה. בנוסף, השוואת להתחקות אחר הארבור הדנדריטים כולו, מעקב משמעותי מפחית את זמן העיבוד ואת הדרישות של כוח המחשוב.
מספר שינויים עלולים לשפר את היעילות והתכונות האנליטיות של השיטה שלנו. כדי לחלץ מידע כמותי מתוך סדרת תמונות הזמן, ביאור מדויק של עצות הסניף בכל נקודות הזמן הוא חשוב באופן ביקורתי. שלב זה מבוצע כרגע באופן ידני, דבר שאינו רק זמן רב, אלא גם מציג את השונות. התפתחויות חדשות בקוד פתוח תלת-ממד ויזואליזציה יכול להתמודד עם מגבלות טכניות נוכחיות ולהפוך אוטומציה של שלב זה קריטי אפשרי. מספר כלי תוכנה שפותחו לאחרונה מספקים פונקציית קוונפיקציה אוטומטית למחקרים על filפאות16,17,18,19,20,21 ויכול להיות שנבדקו ואומצו למחקרים על הדינמיקה של הענף הדנדט.
שלב נוסף המתבצע כעת באופן ידני הוא זיהוי של הסיומת לעומת אירועי הנסיגה. האוטומציה של שלב זה מחייבת את הקואורדינטות התלת-מימטיות של אתרי ביוקטיון של ענף. על-ידי השוואת מרחקים לאתר ההסתעפות בשתי נקודות זמן, ניתן לפתח מרשם שנכתב בהתאמה אישית כדי להקצות את הכיווניות של displacements המסוף. בעקבות אותו הגיון, ניתן להשתמש בקואורדינטות תלת-ממד נוספות לאורך הענף גם לניתוח ההרחבה ואירועי הנסיגה המתרחשים בתוך הענף. תוספות אלה לא רק לייעל את זרימת העבודה של הפרוטוקול שלנו, אלא גם להגדיל את תוכן המידע לגבי שינויים מבניים של סוכת הדנדריטים בסולמות הזמני שונים.
לסיכום, כדי לתמוך את המחקרים שלנו על הפלסטיות מותנית בניסיון, פיתחנו הזמן לשגות פרוטוקולים הדמיה בשידור חי למחצה אוטומטי שיטות לבצע הערכות של הדינמיקה ענף מהיר בפיתוח נוירונים. בהתבסס על התוצאות שנוצרו על ידי השיטות המתוארות כאן, המחקר שלנו זיהה מאוד מורצפת הדנדריטי בתוך הנוירונים המרכזי של Drosophila ילה וחשף תיאום התפתחותי בין הדינמיקה דנדריטים מוגברת ו synaptogenesis. שיפורים עתידיים ברכישת התמונה וברמת האוטומציה ישפרו מאוד את הפוטנציאל של פרוטוקול זה ויקל על המחקרים על הדינמיקה של הדנדריטים והפלסטיות המבנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית מחקר הפנים של המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ, המכונים הלאומיים לבריאות. . פרויקט מספר 1ZIANS003137
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
- Wong, W. T., Wong, R. O. L. Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis. Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).
- Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation. The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).
- Cline, H., Haas, K. The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).
- Helfrich-Forster, C., et al. Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).
- Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil. Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).
- Yuan, Q., et al. Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System. Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).
- Sheng, C., et al. Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis. Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).
- Yin, J., et al. Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity. Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Harrison, D. A., Perrimon, N. Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila. Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9, 47 (2011).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Niell, C. M., Smith, S. J. Live optical imaging of nervous system development. Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).
- Jacquemet, G., et al. FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Urbančič, V., et al. Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).
