Summary
Här beskriver vi den metod vi använde för att avbilda mycket rörliga dendritiska filopodia i en levande förberedelse av Drosophila larv hjärnan, och det protokoll vi utvecklat för att kvantifiera tidsförlopp 3D Imaging dataset för kvantitativa bedömningar av Dendrit dynamik i utvecklingen av nervceller.
Abstract
Mycket rörliga dendritiska filopodia är allmänt närvarande i nervceller på tidiga utvecklingsstadier. Dessa undersökande dynamiska grenar prov den omgivande miljön och initiera kontakter med potentiella synaptiska partners. Även om sambandet mellan dendritiska grenen dynamik och synaptogenes är väl etablerad, hur utvecklings-och aktivitetsberoende processer reglera dendritiska gren dynamik är inte förstått. Detta beror delvis på de tekniska svårigheterna i samband med levande avbildning och kvantitativa analyser av dessa fina strukturer med hjälp av ett in vivo-system. Vi etablerade en metod för att studera Dendrit dynamik med hjälp Drosophila larv ventrala laterala nervceller (lnvs), som kan vara individuellt märkta med genetiska metoder och är tillgängliga för Live Imaging. Dra nytta av detta system, utvecklade vi protokoll för att fånga gren dynamiken i hela dendritiska Arbor av en enda märkt LNv genom time-lapse Live Imaging. Vi utförde sedan efter bearbetning för att förbättra bildkvaliteten genom avdrift korrigering och deconvolution, följt av att analysera gren dynamiken på en gren nivå genom att kommentera rumsliga positioner av alla gren terminaler. Slutligen utvecklade vi R-skript (kompletterande fil) och specifika parametrar för att kvantifiera filialens dynamik med hjälp av den koordinatinformation som genererats av terminalspårningen. Kollektivt, detta protokoll tillåter oss att uppnå en detaljerad kvantitativ beskrivning av gren dynamiken i neuronala dendritiska Arbor med hög temporala och rumsliga upplösning. De metoder vi utvecklat är i allmänhet tillämpas på glest märkta neuroner i både in vitro-och in vivo villkor.
Introduction
Dendriter är specialiserade neuronala fack som tar emot och bearbetar sensoriska och synaptiska indata. Den komplexa och stereotypa strukturen av dendritiska arbors har varit under intensiv utredning sedan deras upptäckt. Ett antal modellsystem, inklusive Xenopus Optic tectal nervceller, chick retinal ganglion celler, och dendritiska arborization (da) nervceller i Drosophila systemet, har inrättats för att studera utveckling, ombyggnad och plasticitet av neuronala dendriter1,2,3,4. Drosophila ventrala laterala neuroner (lnvs) är en grupp av visuella projektion neuroner initialt identifierats för sina viktiga funktioner i dygns reglering av flyga beteenden5. Studier avslöjade också rollen av larv lnvs som direkt postsynaptiska mål för larv fotoreceptorer (PRS)6,7. Viktigare, odling utveckla larver i olika ljus regimer starkt påverkar storleken på LNvs dendritiska arbors, visar lämpligheten av LNvs som en ny modell för att studera dendritiska plasticitet7. Nyligen arbete från vår grupp ytterligare visar att både storleken på LNV Dendrit och det dynamiska beteendet hos dendritiska grenar displayen Experience-beroende plasticitet8,9. Som en del av detta arbete har vi utvecklat en ny Live Imaging och kvantifiering protokoll för att utföra analyser på Dendrit dynamiken i lnvs från 2nd eller 3RD INSTAR larver.
Den transparenta karaktären hos Drosophila larv Brain gör den idealisk för levande avbildning. Men den dendritiska arbors av lnvs är belägna i tätt innerverade larv Optic neuropil (Lon) i mitten av larv Brain LOB6. För att fånga bilder av fina Dendrit grenar och filopodia i intakt hjärnvävnad, vi använder två-Photon mikroskopi, vilket ökar djupet av ljus inträngning och minskar fototoxicitet under Live Imaging experiment10. Med hjälp av denna inställning, vi framgångsrikt utfört Live Imaging experiment på LNvs för över 30 min utan att observera uppenbara morfologiska försämring av neuron. Dessutom, genetiska manipulationer med hjälp av flip-out tekniken möjligt för oss att märka de enskilda lnvs med ett membran taggade GFP, som också är kritisk för övervakning av förflyttningar av enskilda grenar11,12,13 .
För att fånga det dynamiska beteendet hos alla grenar på LNV dendritiska Arbor med optimal optisk upplösning, utförde vi tidsförlopp 3D-avbildning på nyligen dissekerade larv Brain djur med en hög rumslig upplösning på 1 min per ram för 10 till 30 min. utveckla LNV dendriter är mycket dynamisk, med en stor andel av grenarna visar observerbara förändringar inom 10 min fönster. Detta leder till en av de viktigaste tekniska utmaningarna i att studera Dendrit dynamik, kvantifiera gren beteende baserat på 4D bild datauppsättningar. Tidigare etablerade metoder har olika begränsningar, inklusive bristande noggrannhet och överdriven tid krav. Därför har vi utvecklat en semi-automatisk metod som kombinerar bild efter bearbetning, manuell märkning av grenterminaler, och automatisk 4D spot tracing med hjälp av en bild anteckning programvara. Vi beräknar Förflyttningar av grenterminaler vid olika tidpunkter baserat på 3D-koordinaterna för fläckarna. Data exporteras sedan och analyseras för att producera kvantitativa mätningar av filialens dynamik. Denna metod bedömer noggrant varaktigheten och omfattningen av förlängning och återgående händelser av befintliga grenar, samt bildandet av nya grenar, vilket gör att vi kan övervaka Dendrit dynamik i ett stort antal nervceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försiktighet: Detta protokoll omfattar användning av klass IV-lasrar och kommer att kräva ordentlig utbildning och säkerhetsriktlinjer som skall följas. Undvik ögon-eller hudexponering för direkt eller spridd laserljus.
Anmärkning: Protokollet innehåller sex steg. Arbetsflödet visas i figur 1A.
1. märkning enskilda nervceller med hjälp av flip-out teknik
Anmärkning: Den enda märkning av LNvs uppnås genom att uttrycka mCD8:: GFP i Single LNvs med flippase-medierad stokastiska märkning. Den genotyp av fluga linjen är: HS-FLP; PDF-Gal4; UAS--CD2-Stop-FRT-mCD8:: GFP11,12,13. Frekvensen för att få en enda märkt LNv är cirka 10%. Flug bestånd bibehålls i standard medium i cirkadiska-och fuktstyrda 25 ° c inkubatorer.
- Samla 100-200 ägg inom en 2 h fönster efter gödsling på en druvsaft tallrik med jäst tillägg. Inkubera embryona vid 25 ° c i 24 timmar och samla in nykläckt första INSTAR larver för nästa steg.
- Värme chock den nykläckte första INSTAR larverna vid 37,5 ° c för 40 min två gånger, med en 40 min återhämtningsperiod däremellan.
- Odla larverna vid 25 ° c med cirkadiska och fukt kontroller till önskat utvecklingsstadium (er).
2. dissekera och montering larval Brain Explants
- Dissekera larv hjärnor i fysiologisk extern saltlösning (120 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 3 mm KCL, 10 mm NaHCO3, 10 mM glukos, 10 mM SACKAROS, 5 mM tes, 10 mm Hepes, 2 mm ca2 +, pH 7,2) under en dissektion Mikroskop (4.5 x förstoring två par #5 standard spets dissektion tång (11 cm). Använd ett par tång för att hålla larv kroppen på plats och den andra att noggrant dissekera hjärnan. Bevara ögat diskar, hjärnan lober och ventrala nerv sladden. Ta bort bifogade muskler för att minimera prov rörelser under bildtagning.
- Förbered en glas rutschbana (25 x 75 x 1,0 mm3) och Använd en spruta för att rita en fyrkantig kammare med vakuum fett.
- Tillsätt 20 μL extern saltlösning till Kvadratisk kammare med fett barriärer.
- Överför dissekerade larv hjärnor i kammaren på glas bilden med hjälp av tång. Justera hjärnans position under dissektionens omfång för att säkerställa att ryggsidan är vänd uppåt.
- Täck kammaren med en glas täckslip (22 x 22 x 0,15 mm3). Den larv hjärnan är nu monterad på bilden i en kammare fylld med den yttre saltlösning (figur 1B).
Anmärkning: Pressning försiktigt på täckslip begränsar hjärnor och minskar provet drivande i den efterföljande bildsessionen.
3. time-lapse Live Imaging
Anmärkning: Vi utför tidsförlopp bild experiment med hjälp av en konfokal Mikroskop utrustad med en multiphoton laser. Förvärvs parametrarna måste justeras för andra avbildnings inställningar.
- Identifiera hjärnans djur innehåller individuellt märkta nervceller med hjälp av en 40x vatten nedsänkning mål (na 1,3) och en epilys ljuskälla. För Bildinsamling, Använd en två-Photon laser stämd till 920 nm och en icke-avbeskurna (NDD) detektor.
- Samla bilder på 512 x 512 pixlar per bildruta och 1 min per Z-stack i 10 min. Justera optisk och digital zoom för att uppnå en tillräcklig x-y-Z upplösning samtidigt som täckningen av hela dendritiska Arbor inom 1 min (figur 2, kompletterande video 1). inställningarna genererar bilder med en typisk x-y-z-upplösning på 0,11 x 0,11 x 0,25 μm3.
- Samla in tidsfördröjning bildserie inom 30 min av hjärnan dissektion. Data med överdriven drift eller uppenbar morfologisk försämring bör undantas från efter behandling och kvantifiering.
4. avdrift korrigering och deconvolution
Anmärkning: Beroende på bildkvaliteten är båda stegen valfria men rekommenderas starkt.
- Öppna en förvärvad bildfil med en drift korrigering programvara. Redigera mikroskopiska parametrar för att matcha de som används för experimentet. För programvaran (se tabell över material) klickar du på Redigera | Redigera mikroskopiska parametrar. Ställ Mikroskop typ som widefield för två foton bilder om det inte finns någon två-Photon alternativ och följ arbetsflödet som definierats av programvaran. Öppna till exempel fliken deconvolution | Objekt stabilisatoroch välj stabilisera tidsramar.
- Öppna den driftskorrigerade avbildningen i deconvolution-programvaran och följ dess arbetsflöde. För programvaran (se tabell över material), Välj den stabiliserade bilden och klicka sedan på deconvolution | Deconvolution Express. För att få ett bättre resultat, finjustera parametrarna med hjälp av deconvolution Wizard.
- Spara den deconvolved bild i en filtyp som stöds av den efterföljande bild anteckning programvara som kan analysera 4D data och rapportera de rumsliga koordinaterna för definierade fläckar i bilden (se tabell över material).
5. bild anteckning
- Öppna den deconvolved bild i bild anteckning programvara. Undersök och markera gren tips vid alla tidpunkter i 3D. Bild anteckningsprogrammet rapporterar och lagrar de rumsliga och temporala koordinaterna för de markerade gren tipsen. Exportera koordinatinformationen som en CSV-fil för efterföljande beräkningar.
Anmärkning: Följande två steg är specifika för anteckningsprogrammet som vi använde (se tabell över material). Arbetsflödet kan vara olika för annan programvara. - Inom den spots modulen, klicka på "hoppa över automatisk skapande, redigera manuellt" och kontrollera botten "Auto-Anslut till vald plats" checkbox (figur 3A). Gå över ramarna i tidsserierna och välj en förgrening för anteckning. Håll Shift-tangenten och klicka på grenen terminalen tips för att lägga till en plats. Klicka dig igenom alla tidspunkter.
Anmärkning: Bild anteckningsprogrammet ansluter fläckarna mellan ramarna och genererar en bana automatiskt. Den rumsliga och temporala informationen för grenen tips är nu förknippad med markerade fläckar. Upprepa dessa steg tills alla gren spetsar har kommenterade (figur 3B). - I modulen spots klickar du på fliken statistik , väljer detaljerad och väljer specifika värden | Positionen. Den inspelade rumsliga och temporala koordinatinformationen visas på displayen. Klicka på Spara längst ned om du vill exportera informationen som en CSV-fil (figur 3C).
6. beräkning av dendritiska Grendynamiken
Anmärkning: Med hjälp av koordinatinformationen kan förskjutning av gren tipsen i 3D enkelt beräknas. I vår studie, alla dendritiska gren rörelser kategoriseras som förlängning eller indragning. Stegen nedan beskriver hur du bearbetar CSV-filer med hjälp av specialskrivna R-skript (tilläggsfil) och genom att lägga till riktnings informationen genom manuell redigering.
- Öppna CSV-filen som ett kalkylblad. Markera kolumnen spår-ID , klicka på alternativet Sortera minst till störst och acceptera expandera markeringen. Efter sortering identifierar spår-ID varje unik dendritiska gren och fläckar från samma gren delar samma spår-ID. I kolumnen tid lagras information om olika tidsramar.
- Lägg till en avstånds kolumn i kalkylarket. Beräkna avståndet mellan varje två temporalt angränsande punkter med hjälp av deras koordinater och placera värdena i avstånds kolumnen (figur 4a).
- Mindre rörelser på den enskilda Voxel-nivån. Baserat på bildinställningar, är 0,3 μm vanligtvis artefakter från okorrigerad drivande eller ofullkomlig bild anteckning. Filtrera dessa rörelser genom att återställa alla avstånds värden som är mindre än 0,3 μm till 0. Bearbeta flera CSV-filer manuellt eller Använd vår R-skript batch kolumn filtrering. R (kompletterande fil).
- Generera en ny kolumn med namnet förskjutning i kalkylbladet manuellt. Kopiera värdena från distans kolumnen till förskjutnings kolumnen. Tilldela manuellt Anknytnings-och återgångshändelserna för varje gren tips. Om det är ett tillägg lämnar du förskjutnings värdet oförändrat, vilket är ett positivt värde. Om det är ett återgående, ändra motsvarande förskjutnings värde till ett negativt värde (t. ex. 0,35 till-0,35) (figur 4B).
- Generera en ny kolumn med namnet Event. I den här kolumnen ska du manuellt summera förskjutnings värdena för enskilda händelser för förlängning och indragning (figur 4B).
- Bearbeta det ändrade kalkylbladet och kvantifiera tillägg och återgående händelser baserat på deras förskjutningsvärden med hjälp av R-skript batch kolumnsumma. R (kompletterande fil). Utdataparametrarna inkluderar antal förlängnings händelser, antal återgångshändelser, kumulativ längd förlängd, ackumulerad längd indragna, netto längd ändradoch Total längd rest .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av Live Imaging-protokollet som beskrivs ovan, fångar vi högupplösta bild stackar för efterföljande analyser och kvantifiering. Kompletterande video 1 visar den maximala intensitet projicerade (MIP) bildserie som samlats in från en representant individuellt märkta LNV. figur 2B visar motsvarande montage av åtta bildrutor i Image-serien. I båda panelerna, pilspetsar Markera indragning händelser och pilar mark Extension händelser.
Därefter utför vi semi-automatiserad 4D spårning av filialerna terminaler med hjälp av en bild anteckning programvara (tabell över material). Figur 3 B visar anteckningar från de dynamiska gren terminalerna från ett representativt individuellt märkt LNV. använda denna programvara, vi visualiserar bildstackar i 3D, manuellt markera alla gren terminaler och använda fläckar modulen för att spåra terminalerna rörelser genom tiden. Denna programvara genererar tidsstämplade banor för varje kommenterade gren Terminal, som fungerar som visuella representationer av de dynamiska händelserna på dendritiska Arbor.
Vi använder sedan koordinatinformation från kommenterade gren tips för att beräkna riktningen och avståndet för gren rörelser vid varje tidpunkt. Skärmdumpar i figur 4A, B visar hur detta uppnås. De bearbetade kalkylbladen genererar utdatafiler som vi använder för att kvantifiera Dendrit Dynamics med fyra parametrar, inklusive procent av dynamiska grenar, antal nya grenar, kumulativ tillryggalagd sträcka och antal gren förflyttnings händelser. Figur 4 C visar jämförelser av dendritiska gren dynamiken för individuellt märkta lnvs från olika utvecklingsstadier. I överensstämmelse med resultaten i däggdjurs neuroner och zebrafiskar tectal celler, den LNV Dendrit dynamiken är utvecklingsstörda reglerade14,15. LNv dendriter i yngre larver, 48-72 h efter äggläggning (AEL), är betydligt mer dynamisk jämfört med de i äldre larver, 96-120 h AEL, mätt med alla fyra parametrar, och utvecklingen övergången från den dynamiska till stabila tillstånd inträffar mellan 72 till 96 h AEL8.
Figur 1: arbetsflöde för Dendrit Dynamics Imaging-och kvantifieringsprotokollet. A) protokollet innehåller sex steg som omfattar provberedning, Bildinsamling, bildbehandling och halvautomatisk kvantifiering av dendritedynamiken. Bett Schematiskt diagram som illustrerar en bildbehandlings kammare som innehåller en larv hjärna som är monterad med ryggsidan uppåt. Hjärnan explantat har en individuellt märkt LNv i varje lob och är nedsänkt i den externa saltlösning. De vakuum fett barriärer stödja vikten av täckslip och bildar en liten kammare som hindrar hjärnan från att röra sig. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: fotografering med tidsförlopp av dendritiska gren dynamiken i 3D. Aden dendritiska Arbor av en individuellt märkt LNV från en 3RD INSTAR larv. Bmotsvarande montage bild av a som illustrerar de representativa gren rörelserna. Pilspetsar (grön) mark indragning händelser; pilar (röda) Markera förlängnings händelser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: manuell anteckning och automatisk spårning av dendritiska grenterminaler i en bild anteckningsprogram. (A) en skärmdump visar inställningarna för Branch Terminal Tracking med hjälp av spots modulen. Den röda ovalen beskriver det manuella spårnings alternativet. B) representativa tidsstämplade banor för kommenterade grenterminaler (gula fläckar) som genereras av bild anteckningsprogrammet i en individuellt märkt LNV. Scale bar = 5 μm. (C) en skärmbild visar gränssnittet för visning och Exportera koordinatinformationen från spots-modulen. Figur 3b har modifierats från Sheng, C. et al. 20188. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: kvantifiering av dendritiska grendynamiken med hjälp av koordinatinformationen för grenterminalerna. (A) en skärmdump visar kalkylbladet som innehåller X, Y och Z-koordinater, spår-ID och formel som används för att beräkna förskjutning av fläckar i de intilliggande ramarna. (B) en skärmbild visar representativa resultat från spårning av en filial. De mindre rörelserna (< 0,3 μm) filtrerades ut. Tillbakadraganden markeras genom att tilldela deras värde till negativ (avstånds kolumn). Genom att summera intilliggande positiva/negativa värden beräknas förskjutningen av varje biologisk utvidgning/indragning (kolumnen händelser). C) representativ kvantifiering av resultat som visar den utvecklingsmässiga regleringen av dendritedynamiken. Data presenteras som en ruttomt (box, 25-75%; mittlinje, median) överlagras med en dot Plot (individuella datapunkter). Figur 4c har modifierats från Sheng, C. et al. 20188. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video 1: tio maximal intensitet-projektion (MIP) bilder spelas med en hastighet av 2 bilder per sekund. Hela dendritiska Arbor var avbildad på 1 min per Z-stack. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande fil 1: batch-kolumn filtrering. R skript. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Tilläggsfil 2: batch-kolumn sum. R-skript. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll som vi utvecklat för att registrera och kvantifiera det dynamiska beteendet hos dendritiska grenar i individuellt märkta neuroner i Drosophila larv hjärnor. Särskilt vår Live Imaging-protokollet innehåller specifika parametrar som gör det möjligt för oss att fånga hela dendritiska Arbor av en larv LNV och ge en global bild av det dynamiska tillståndet i dess Dendrit grenar. Men eftersom våra kvantifieringsmetoder starkt förlitar sig på anteckningen av filial terminaler, är neuroner med komplexa dendritiska strukturer och kondenserade arborizations inte lämpliga ämnen för denna analys.
Provberedning, bild anskaffning och efter behandling är de kritiska stegen i detta protokoll. Högkvalitativa RAW-bilder av Single lnvs är viktiga för en korrekt kvantifiering av Dendrit dynamik. Våra data tyder på att LNV Dendrit morfologi och dess fysiologiska svar är välbevarade i en omsorgsfullt förberedd larv hjärnan explantat inom 30 min av dissektion. Prover med observerbar hjärnvävnad försämring, långsträckt dendritiska arbors och gren brott bör inte användas för avbildning och kvantifiering. Även frivillig för datauppsättningar med låg bakgrund och inga observerbara rörelser, rekommenderar vi starkt inklusive drift korrigering och deconvolution steg för att förbättra bildkvaliteten, vilket är viktigt för anteckning av grenuttag och automatisk plats spårning. Förutom den kommersiella programvara som används i våra studier, ImageJ/Fijis rätt 3D drift (plugins | Anmälan | Korrekt 3D-drift) fungerar också bra för avdrift korrigering.
En av de stora skillnaderna mellan vårt protokoll och befintliga metoder är att vi spårar förflyttningar av enskilda gren tips men inte hela dendritiska Arbor. Rekonstruktion av hela dendritiska arbors, även användbar för att mäta den totala dendritiska längd och arkitektur, är inte idealisk för dynamiska studier med 3D-Imaging DataSet. För efterföljande Z-stack skivor, automatisk spårning program ofta generera olika kombinationer av "grenar" och rekonstruera dendritiska Arbor annorlunda, vilket gör jämförelsen på den enda grenen nivå mellan olika tidpunkter särskilt Svårt. Dessutom, jämfört med att spåra hela dendritiska Arbor, minskar terminalspårning avsevärt bearbetningstiden och kraven på beräkningskraft.
Flera modifieringar kan potentiellt förbättra effektiviteten och analytiska funktioner i vår metod. För att extrahera kvantitativ positions information från tids fördröjnings bildserien är korrekt anteckning av gren tips vid alla tidpunkter oerhört viktigt. Det här steget utförs för närvarande manuellt, vilket inte bara är tidskrävande, utan också introducerar variationer. Nya utvecklingar i Open source 3D visualiseringsprogramvara kan potentiellt hantera aktuella tekniska begränsningar och göra automatisering av detta kritiska steg möjligt. Flera nyligen utvecklade mjukvaruverktyg ger automatisk kvantifieringsfunktion för studier på filopodia16,17,18,19,20,21 och kan potentiellt testad och antagen för studier på Dendrit Branch Dynamics.
Ett annat steg som för närvarande utförs manuellt är identifieringen av tillägg kontra återgångshändelser. Automatisering av det här steget kräver 3D-koordinater för grenen bifurkation webbplatser. Genom att jämföra avstånd till förgrening plats vid två tidpunkter, en specialskriven väska kan utvecklas för att tilldela riktningen av terminalens förskjutningar. Efter samma logik, kan ytterligare 3D-koordinater längs grenen också användas för att analysera förlängning och återgående händelser som inträffar inom grenen. Dessa tillägg kommer inte bara att optimera arbetsflödet i vårt protokoll, men också öka informationsinnehållet om strukturella förändringar av dendritiska arbors vid olika tidsmässiga skalor.
Sammanfattnings, för att stödja våra studier på erfarenhet beroende Dendrit plasticitet, utvecklade vi Time-lapse Live Imaging protokoll och semi-automatiserade kvantifieringsmetoder för att utföra bedömningar av snabba gren dynamik i utvecklingen av nervceller. Baserat på de resultat som genereras av de metoder som beskrivs här, vår studie identifierade mycket rörliga dendritiska filopodia i Drosophila centrala nervceller och avslöjade en utvecklingsmässig samordning mellan förhöjd Dendrit dynamik och synaptogenesis. Framtida förbättringar på bild förvärv och automation nivå kommer att avsevärt öka potentialen i detta protokoll och underlätta studier på Dendrit dynamik och strukturell plasticitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av intramural forsknings program för nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke, National Institutes of Health. Projektnummer 1ZIANS003137.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
- Wong, W. T., Wong, R. O. L. Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis. Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).
- Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation. The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).
- Cline, H., Haas, K. The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).
- Helfrich-Forster, C., et al. Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).
- Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil. Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).
- Yuan, Q., et al. Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System. Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).
- Sheng, C., et al. Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis. Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).
- Yin, J., et al. Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity. Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Harrison, D. A., Perrimon, N. Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila. Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9, 47 (2011).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Niell, C. M., Smith, S. J. Live optical imaging of nervous system development. Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).
- Jacquemet, G., et al. FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Urbančič, V., et al. Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).
