Summary
هنا، نقوم بوصف الطريقة التي استخدمناها لتصوير فيلوبوديا الددرية المنوية في إعداد مباشر لدماغ اليرقات دروسوفيلا، والبروتوكول الذي قمنا بتطويره لتحديد مجموعات بيانات التصوير ثلاثي الأبعاد الفاصلة زمنياً للتقييمات الكمية للدندريت ديناميات في تطوير الخلايا العصبية.
Abstract
فيلبوديا الددرية المنستيرية للغاية موجودة على نطاق واسع في الخلايا العصبية في مراحل النمو المبكرة. هذه الفروع الحيوية الاستكشافية عينة البيئة المحيطة وبدء اتصالات مع الشركاء متشابك المحتملة. على الرغم من أن العلاقة بين ديناميات الفروع التقشرية ومتشابك اتّهار، إلا أن كيف أن العمليات التنموية والمعتمدة على النشاط تنظم ديناميات الفروع التقشرية غير مفهومة جيداً. ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبات التقنية المرتبطة بالتصوير الحي والتحليلات الكمية لهذه الهياكل الدقيقة باستخدام نظام في الجسم الحي. أنشأنا طريقة لدراسة ديناميات dendrite باستخدام الخلايا العصبية الجانبية الجانبية النترجية اليرقات Drosophila (LNvs)، والتي يمكن أن توصف بشكل فردي باستخدام النهج الوراثية ويمكن الوصول إليها للتصوير الحي. الاستفادة من هذا النظام، وضعنا بروتوكولات لالتقاط ديناميات فرع من شجرة dendritic كله من LNv واحد المسمى من خلال التصوير الحي الفاصل الزمني. ثم قمنا بإجراء ما بعد المعالجة لتحسين جودة الصورة من خلال تصحيح الانجراف وdeconvolution، تليها تحليل ديناميات فرع على مستوى فرع واحد من خلال تحديد المواقع المكانية لجميع محطات الفروع. وأخيراً، قمنا بتطوير البرامج النصية R(الملف التكميلي)ومعلمات محددة لتحديد ديناميات الفروع باستخدام معلومات الإحداثيات التي تم إنشاؤها بواسطة تتبع المحطة الطرفية. بشكل جماعي، يسمح لنا هذا البروتوكول لتحقيق وصف كمي مفصل لديناميات فرع الشجرة التقشرية العصبية مع دقة زمنية ومكانية عالية. الأساليب التي طورناها تنطبق عموما على الخلايا العصبية قليلة المسمى في كل من المختبر وفي ظروف الجسم الحي.
Introduction
Dendrites هي مقصورات الخلايا العصبية المتخصصة التي تتلقى ومعالجة المدخلات الحسية ومتشابك. ويجري التحقيق المكثف في الهيكل المعقد والنمطي للأشجار التقشرية منذ اكتشافها. وقد تم إنشاء عدد من النظم النموذجية، بما في ذلك الخلايا العصبية الكتيكة البصرية Xenopus، وخلايا العقدة الشبكية الفرخ، والخلايا العصبية التأرّب التقشري (دا) في نظام دروسوفيلا، لدراسة تطوير وإعادة عرض واللدونة من الدنتيريات العصبية1،2،3،4. دروسوفيلا الخلايا العصبية الجانبية البطني (LNvs) هي مجموعة من الخلايا العصبية الإسقاط البصرية التي تم تحديدها في البداية لوظائفها الهامة في تنظيم circadian من السلوكيات يطير5. كما كشفت الدراسات عن دور اليرقات LNvs كهدف مباشر للمستقبلات الضوئية لليرقات (PRs)6،7. الأهم من ذلك، زراعة اليرقات النامية في أنظمة ضوء مختلفة يؤثر بقوة على حجم الأشجار الدنية LNvs ' ، مما يدل على ملاءمة LNvs كنموذج جديد لدراسة اللدونة الدنيستيك7. العمل الأخير من مجموعتنا يشير كذلك إلى أن كلا من حجم dendrite LNv والسلوك الديناميكي للفروع dendritic عرض اللدونة تعتمد على الخبرة8،9. كجزء من هذا العمل، قمنا بتطوير بروتوكول جديد للتصوير الحي والقياس الكمي لإجراء تحليل على ديناميات dendrite من LNvs من 2nd أو 3rd اليرقات instar.
الطبيعة الشفافة للدماغ اليرقات Drosophila يجعلها مثالية للتصوير الحي. ومع ذلك، تقع الأشجار الدنية من LNvs في اليرقات اللامعية بكثافة اليرقات العصبية البصرية (LON) في وسط فص الدماغ اليرقات6. لالتقاط صور من فروع الدندرية الدقيقة وfilopodia في أنسجة الدماغ سليمة، ونحن نستخدم اثنين من الفوتون المجهري، مما يزيد من عمق اختراق الضوء ويقلل من السمية الضوئية خلال تجارب التصوير الحي10. باستخدام هذا الإعداد، قمنا بنجاح بإجراء تجارب التصوير الحي على LNvs لأكثر من 30 دقيقة دون مراقبة التدهور المورفولوجي الواضح للخلية العصبية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التلاعبات الوراثية باستخدام تقنية الوجه تمكننا من تسمية LNvs الفردية مع غشاء الموسومة GFP، وهو أمر بالغ الأهمية أيضا لرصد تحركات الفروع الفردية11،12،13 .
لالتقاط السلوك الديناميكي لجميع الفروع على الشجرة dendritic LNv مع القرار البصري الأمثل، قمنا بإجراء التصوير 3D الفاصل الزمني على explants الدماغ اليرقات تشريح حديثا مع دقة مكانية عالية في 1 دقيقة لكل إطار لمدة 10 إلى 30 دقيقة. dendrites هي ديناميكية للغاية، مع نسبة كبيرة من الفروع عرض تغييرات يمكن ملاحظتها داخل نافذة 10 دقيقة. وهذا يؤدي إلى واحدة من التحديات التقنية الرئيسية في دراسة ديناميات dendrite، وتحديد سلوك الفرع استنادا إلى مجموعات بيانات الصورة 4D. وللأساليب المعمول بها سابقا قيود مختلفة، بما في ذلك عدم الدقة والإفراط في متطلبات الوقت. لذلك، قمنا بتطوير طريقة شبه تلقائية تجمع بين معالجة الصور اللاحقة، ووضع العلامات اليدوية على محطات الفروع، وتتبع تلقائي لبقعة 4D باستخدام برنامج تعليق توضيحي للصور. نقوم بحساب تحركات محطات الفروع في نقاط زمنية مختلفة استنادًا إلى إحداثيات الـ 3D للبقع. ثم يتم تصدير البيانات وتحليلها لإنتاج قياسات كمية لديناميات الفرع. هذا الأسلوب يقيّم بدقة مدة ومدى التمديد والتراجع الأحداث من الفروع القائمة، فضلا عن تشكيل فروع جديدة، مما يسمح لنا لمراقبة ديناميات dendrite في عدد كبير من الخلايا العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تحذير: وينطوي هذا البروتوكول على استخدام أشعة الليزر من الفئة الرابعة، وسيتطلب اتباع مبادئ توجيهية مناسبة للتدريب والسلامة. تجنب التعرض للعين أو الجلد لضوء الليزر المباشر أو المتناثر.
ملاحظة: ويتضمن البروتوكول ست خطوات. يظهر سير العمل في الشكل 1A.
1. وضع العلامات على الخلايا العصبية الفردية باستخدام تقنية الوجه التدريجي
ملاحظة: يتم تحقيق وضع العلامات واحد من LNvs عن طريق التعبير عن mCD8::GFP في LNvs واحد باستخدام التقلس بوساطة التقلسق اللايبة. النمط الجيني لخط الطيران هو: hs-flp; قوات الدفاع الشعبي-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8::GFP11,12,13. تردد الحصول على LNv واحد المسمى حوالي 10٪. يتم الحفاظ على مخزونات الطيران في المتوسط القياسي في حاضنات circadian- والرطوبة التي تسيطر عليها 25 درجة مئوية.
- جمع 100-200 البيض داخل 2 ح نافذة بعد الإخصاب على لوحة عصير العنب مع تكملة الخميرة. احتضان الأجنة في 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة وجمع اليرقات instar فقست حديثا للخطوة التالية.
- صدمة الحرارة اليرقات instar فقست حديثا الأولى في 37.5 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة مرتين، مع فترة الانتعاش 40 دقيقة في ما بين.
- زراعة اليرقات في 25 درجة مئوية مع ضوابط circadian والرطوبة إلى مرحلة (ق) التنمية المرجوة.
2. تشريح وتركيب اليرقات الدماغ Explants
- تشريح أدمغة اليرقات في محلول ملحي خارجي فسيولوجي (120 مل حمض الكلس، 4 مل ملغكل2،3 م مل كل، 10 م ناهكو3،10 م م الجلوكوز، 10 م م، 10 م، 10 م، 10 م هيبيس، 2 م م كا2+، PH 7.2) تحت مجهر تشريح (4.5x التكبير السلطة) مع اثنين من أزواج من #5 ملقط تشريح طرف القياسية (11 سم). استخدام زوج واحد من الملقط لعقد الجسم اليرقات في مكان والآخر لتشريح بعناية خارج الدماغ. الحفاظ على أقراص العين وفصوص الدماغ والحبل العصبي البطني. إزالة العضلات المرفقة لتقليل حركات العينة أثناء التصوير.
- إعداد شريحة زجاجية (25 × 75 × 1.0 مم3)واستخدام حقنة لرسم غرفة مربعة مع الشحوم فراغ.
- أضف 20 ميكرو لتر من محلول ملحي خارجي إلى الغرفة المربعة مع حواجز الشحوم.
- نقل العقول اليرقات تشريح في الغرفة على الشريحة الزجاجية باستخدام ملقط. ضبط موقف العقول تحت نطاق تشريح لضمان مواجهة الجانب الظهري.
- تغطية الغرفة مع زلة غطاء زجاجي (22 × 22 × 0.15 مم3). يتم تركيب الدماغ اليرقات الآن على الشريحة داخل غرفة مليئة الحل الخارجي المالحة(الشكل 1ب).
ملاحظة: الضغط بلطف على غطاء يحد العقول ويقلل من الانجراف عينة في جلسة التصوير اللاحقة.
3. الفاصل الزمني التصوير الحي
ملاحظة: نقوم بإجراء تجارب التصوير بالفاصل الزمني باستخدام مجهر بؤري مجهز بليزر متعدد الفوتونات. يجب تعديل معلمات الامتلاك لإعدادات التصوير الأخرى.
- تحديد explants الدماغ التي تحتوي على الخلايا العصبية المسماة بشكل فردي باستخدام هدف غمر المياه 40X (NA 1.3) ومصدر ضوء الفلورسنت. لجمع الصور، استخدم ليزر فوتون اثنين ضبطها إلى 920 نانومتر وكاشف غير ممسوح (NDD).
- جمع الصور في 512 × 512 بكسل لكل إطار و 1 دقيقة لكل Z-المكدس لمدة 10 دقيقة. 1).الإعدادات توليد الصور مع دقة x-y-z نموذجية من 0.11 × 0.11 × 0.25 ميكرومتر3.
- جمع سلسلة صورة الفاصل الزمني في غضون 30 دقيقة من تشريح الدماغ. وينبغي استبعاد البيانات التي تحتوي على انحراف مفرط أو تدهور مورفولوجي واضح من المعالجة اللاحقة والتحديد الكمي.
4. تصحيح الانجراف وDeconvolution
ملاحظة: وفقًا لجودة الصورة، كلا الخطوتين اختياريتين ولكن يوصى بهما بشدة.
- افتح ملف صورة مكتسب مع برنامج تصحيح الانجراف. تحرير المعلمات المجهرية لتتناسب مع تلك المستخدمة في التجربة. للبرنامج (انظر جدول المواد)،انقر على تحرير | تحرير المعلمات المجهرية. تعيين نوع المجهر كما widefield للصور اثنين فوتون إذا لم يكن هناك خيار اثنين فوتون واتبع سير العمل المحدد من قبل البرنامج. على سبيل المثال، افتح علامة التبويب Deconvolution | تثبيت الكائن، واختر تثبيت الأطر الزمنية.
- افتح الصورة التي تم تصحيحها بالانجراف في برنامج deconvolution واتبع سير العمل الخاص بها. للحصول على البرنامج (راجع جدول المواد)،حدد الصورة المستقرة ثم انقر فوق Deconvolution | Deconvolution Express. للحصول على نتيجة أفضل، قم بضبط المعلمات باستخدام معالج Deconvolution.
- حفظ الصورة deconvolved في نوع ملف معتمد من قبل برنامج التعليق التوضيحي صورة اللاحقة قادرة على تحليل البيانات 4D والإبلاغ عن الإحداثيات المكانية للبقع المحددة في الصورة (انظر جدول المواد).
5. تعليق توضيحي للصور
- افتح الصورة المتكشّلة في برنامج التعليق التوضيحي للصورة. فحص ووضع علامة نصائح فرع في جميع نقاط الوقت في 3D. يقوم برنامج التعليق التوضيحي للصور بالإبلاغ عن الإحداثيات المكانية والزمنية لتلميحات الفرع المميز وتخزينها. تصدير معلومات الإحداثيات كملف .csv للحسابات اللاحقة.
ملاحظة: الخطوات التالية محددة لبرنامج الشرح الذي استخدمناه (راجع جدول المواد). قد يختلف سير العمل عن البرامج الأخرى. - ضمن الوحدة النمطية البقع، انقر فوق"تخطي الإنشاء التلقائي، تحرير يدويا"والتحقق من الجزء السفلي"الاتصال التلقائي إلى بقعة محددة" خانة الاختيار(الشكل 3A). انتقل إلى الإطارات في السلسلة الزمنية وحدد فرعًا للتعليق التوضيحي. اضغط على المفتاح Shift وانقر فوق تلميح محطة الفرع لإضافة بقعة. انقر من خلال جميع النقاط الزمنية.
ملاحظة: يربط برنامج التعليق التوضيحي للصور البقع بين الإطارات وينشئ مسارًا تلقائيًا. وترتبط الآن المعلومات المكانية والزمنية لنصائح الفرع ببقع محددة. كرر هذه الخطوات حتى يتم شرح كافة تلميحات الفرع(الشكل 3B). - ضمن الوحدة النمطية للبقع، انقر على علامة التبويب إحصائيات، واختر مفصلًا وحدد قيم محددة | المنصب. وسيتم عرض المعلومات المسجلة عن الإحداثيات المكانية والزمنية. انقر فوق حفظ أسفل لتصدير هذه المعلومات كملف .csv (الشكل 3C).
6. حساب ديناميات فرع الددريتيك
ملاحظة: باستخدام معلومات الإحداثيات، يمكن حساب إزاحة أطراف الفرع في 3D بسهولة. في دراستنا، يتم تصنيف جميع حركات الفروع الددرية على أنها تمديد أو تراجع. تصف الخطوات التالية كيفية معالجة ملفات .csv باستخدام البرامج النصية R المكتوبة حسب الطلب(ملف تكميلي)وعن طريق إضافة معلومات الاتجاه من خلال التحرير اليدوي.
- افتح ملف .csv كجدول بيانات. حدد العمود تعقب المعرف، وانقر فوق الخيار فرز أصغر إلى أكبر وقبول توسيع التحديد. بعد الفرز، يحدد Track ID كل فرع من الفروع التقشرية الفريدة، وتشترك البقع من نفس الفرع في نفس معرّف المسار. يخزن العمود الوقت معلومات الأطر الزمنية المختلفة.
- في جدول البيانات، أضف عمود المسافة. احسب مسافة كل موقعين متجاورين زمنياً باستخدام إحداثياتهما ووضع القيم في عمود المسافة (الشكل 4A).
- حركات طفيفة على مستوى voxel واحد. استناداً إلى إعدادات التصوير، 0.3 ميكرومتر عادة ما تكون قطع أثرية من الانجراف غير مصححة أو تعليق توضيحي صورة غير مكتملة. تصفية هذه الحركات عن طريق إعادة تعيين كافة قيم المسافة أصغر من 0.3 ميكرومتر إلى 0. معالجة ملفات .csv متعددة يدويًا أو استخدام تصفية عمود الدفعة النصيR. R (ملف تكميلي).
- إنشاء عمود جديد باسم الإزاحة يدوياً في جدول البيانات. نسخ القيم من عمود المسافة إلى عمود الإزاحة. تعيين أحداث الإضافة والتراجع يدويًا لكل طرف فرع. إذا كان ملحقاً، اترك قيمة الإزاحة دون تغيير، وهي قيمة موجبة. إذا كان التراجع، تغيير قيمة الإزاحة المقابلة إلى قيمة سالبة (على سبيل المثال، 0.35 إلى -0.35)(الشكل 4B).
- إنشاء عمود جديد يسمى حدث. في هذا العمود، يدوياً جمع قيم الإزاحة للملحق الفردي وأحداث التراجع(الشكل 4B).
- معالجة جدول البيانات المعدل وتحديد مقدار أحداث التوسيع والتراجع استناداً إلى قيم الإزاحة الخاصة بهم باستخدام مجموع عمود دفعة البرنامج النصي R. R (ملف تكميلي). تتضمن معلمات الإخراج عدد أحداث الإضافة، وعدد أحداث التراجع، والطول التراكمي الموسع، والطول التراكمي المسحوب، وطول صافي التغيير، والطول الإجمالي للسفر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام بروتوكول التصوير الحي الموضح أعلاه، نقوم بالتقاط مكدسات صور عالية الدقة للتحليلات اللاحقة والقياس الكمي. يُظهر الفيديو التكميلي 1 الحد الأقصى للكثافة المتوقعة (MIP) سلسلة الصور التي تم جمعها من ممثل يحمل اسم LNv بشكل فردي. في كلا الفريقين، وضع علامة على أحداث التراجع وعلامة الأسهم لأحداث التمديد.
بعد ذلك، نقوم بإجراء تتبع 4D شبه مؤتمتة للمحطات الطرفية للفروع باستخدام برنامج تعليق توضيحي للصور(جدول المواد). الشكل 3 B يظهر التعليقات التوضيحية للمحطات فرع ديناميكية من ممثل يسمى بشكل فردي LNv. باستخدام هذا البرنامج، ونحن تصور مكدسات الصور في 3D، يدويا وضع علامة على جميع محطات الفرع واستخدام وحدة البقع لتتبع تحركات المحطات الطرفية مع مرور الوقت. هذا البرنامج يولد مسارات مختومة بالوقت لكل محطة فرع مشروح، بمثابة تمثيلات بصرية للأحداث الديناميكية على الشجرة التقشرية.
ثم نستخدم معلومات الإحداثيات من نصائح الفرع المشروح لحساب اتجاه ومسافة حركات الفروع في كل نقطة زمنية. لقطات الشاشة في الشكل 4A، B تظهر كيف يتم تحقيق ذلك. تقوم جداول البيانات المجهزة بإنشاء ملفات الإخراج التي نستخدمها لتحديد مقدار ديناميكيات dendrite مع أربعة معلمات، بما في ذلك النسبة المئوية للفروع الديناميكية، وعدد الفروع الجديدة، والمسافة التراكمية التي تم قطعها، وعدد أحداث حركة الفروع. الشكل 4 C يظهر مقارنات ديناميات فرع dendritic لLNvs المسمى بشكل فردي من مراحل التنمية المختلفة. تمشيا مع النتائج في الخلايا العصبية الثدييات والخلايا tectal حمار وحشي، يتم تنظيم ديناميات dendrite LNv التنمية14،15. DNv dendrites في اليرقات الأصغر سنا، 48-72 ساعة بعد زرع البيض (AEL)، هي أكثر ديناميكية بكثير بالمقارنة مع تلك الموجودة في اليرقات القديمة، 96-120 ح AEL، كما تقاس بجميع المعلمات الأربعة، والانتقال التنموي من الدينامية إلى حالة مستقرة تحدث بين 72 إلى 96 ح AEL8.
الشكل 1: سير عمل بروتوكول التصوير والقياس الكمي لديناميات الدندرية. (أ)يحتوي البروتوكول على ست خطوات تغطي إعداد العينات، وجمع الصور، ومعالجة الصور، والقياس الكمي شبه الآلي لديناميات الدندريت. (ب)رسم تخطيطي يوضح غرفة تصوير تحتوي على مزرع للدماغ اليرقات مثبت مع الجانب الظهري. يحتوي explant الدماغ على LNv المسمى بشكل فردي في كل فص ومغمور في محلول ملحي خارجي. حواجز الشحوم فراغ دعم وزن غطاء ويشكل غرفة صغيرة تمنع الدماغ من التحرك. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصوير بالفاصل الزمني لديناميات الفروع التقشرية في الأبعاد الأبعاد الأبعاد الثلاثة. (أ)الشجرة الددرية من LNv المسمى بشكل فردي من يرقات instar3 rd. (ب)صورة المونتاج المقابلة من (أ) توضح حركات الفرع التمثيلي. رؤوس الأسهم (الأخضر) علامة التراجع الأحداث; الأسهم (الأحمر) علامة أحداث التمديد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الشرح التوضيحي اليدوي والتتبع التلقائي لمحطات الفروع التقشرية في برنامج تعليق توضيحي للصور. (أ)لقطة شاشة تعرض إعدادات تتبع محطة الفرع باستخدام وحدة البقع. يحدد الشكل البيضاوي الأحمر خيار التتبع اليدوي. (ب)مسارات زمنية تمثيلية مختومة من محطات الفروع المشروحة (البقع الصفراء) التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج التعليق التوضيحي للصورة في شريط مقياس يحمل اسم LNv بشكل فردي = 5 ميكرومتر . (C) تظهر لقطة شاشة واجهة للعرض و تصدير معلومات الإحداثيات من الوحدة النمطية البقع. تم تعديل الشكل 3B من Sheng, C. et al. 20188. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحديد الكمي لديناميات الفروع التقشرية باستخدام معلومات الإحداثيات الخاصة بمحطات الفروع. (أ) تعرض لقطة شاشة جدول البيانات الذي يحتوي على إحداثيات X وY وZ وأجهزة تتبع المعيّات والصيغة المستخدمة لحساب إزاحة البقع في الإطارات المجاورة. (B)لقطة شاشة تظهر النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها من تتبع فرع واحد. تمت تصفية الحركات الثانوية (<0.3 μm). يتم وضع علامة على عمليات السحب بتعيين قيمتها إلى سالب (عمود المسافة). وعن طريق تلخيص القيم الإيجابية/السلبية المجاورة، يحسب إزاحة كل امتداد/تراجع بيولوجي (عمود الأحداث). (ج)التحديد الكمي التمثيلي للنتائج التي تبين التنظيم الإنمائي لديناميات الدندرية. يتم عرض البيانات كقطعة مربع (مربع، 25-75٪؛ خط الوسط، وسيط) متراكبة مع مؤامرة نقطة (نقاط البيانات الفردية). تم تعديل الشكل 4C من Sheng, C. et al. 20188. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو تكميلي 1: يتم تشغيل عشر صور إسقاط قصوى الكثافة (MIP) بسرعة 2 إطار في الثانية. تم تصوير الشجرة التقشرية بأكملها في 1 دقيقة لكل Z-المكدس. الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن لتحميل).
ملف تكميلي 1: البرنامج النصي تصفية العمود الدفعي.R. الرجاء النقر هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن لتحميل).
ملف تكميلي 2: البرنامج النصي Sum.R عمود دفعي. الرجاء النقر هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن لتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، ونحن نصف بروتوكول وضعنا لتسجيل وقياس السلوك الديناميكي للفروع dendritic في الخلايا العصبية المسماة بشكل فردي في العقول اليرقات Drosophila. وتجدر الإشارة إلى أن بروتوكول التصوير الحي لدينا يحتوي على معلمات محددة تمكننا من التقاط الشجرة الددرية الكاملة لـ LNv اليرقات وتوفير رؤية عالمية للحالة الديناميكية لفروعها. ومع ذلك، لأن أساليب نا القياس الكمي تعتمد بشكل كبير على شرح محطات فرع، الخلايا العصبية مع هياكل التقشر ية معقدة والأشجار المكثفة ليست مواضيع مناسبة لهذا التحليل.
إعداد العينات، والحصول على الصور، ومرحلة ما بعد المعالجة هي الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. الصور الخام عالية الجودة من LNvs واحدة ضرورية للقياس الكمي الدقيق لديناميات dendrite. تشير بياناتنا إلى أن مورفولوجيا الدندرية LNv واستجاباتها الفسيولوجية محفوظة بشكل جيد في مزرع الدماغ اليرقات المعدة بعناية في غضون 30 دقيقة من تشريح. لا ينبغي استخدام العينات مع تدهور أنسجة الدماغ يمكن ملاحظتها، والأشجار التقشرية ممدود وكسر فرع للتصوير والقياس الكمي. على الرغم من اختياري لمجموعات البيانات ذات الخلفية المنخفضة وعدم وجود حركات يمكن ملاحظتها، نوصي بشدة بما في ذلك تصحيح الانجراف وخطوات deconvolution لتحسين جودة الصورة، وهو أمر مهم للتعليق التوضيحي للمحطات الطرفية فرع والتلقائي تتبع بقعة. إلى جانب البرامج التجارية المستخدمة في دراساتنا، ImageJ / فيجي الانجراف 3D الصحيح (الإضافات | التسجيل | تصحيح الانجراف 3D) كما يعمل بشكل جيد لتصحيح الانجراف.
واحدة من الاختلافات الرئيسية بين بروتوكولنا والأساليب القائمة هو أن نتتبع حركات نصائح فرع الفردية ولكن ليس الشجرة التقشركله. إعادة بناء الأشجار التقشرية بأكملها، على الرغم من أنها مفيدة لقياس الطول الكلي والهندسة المعمارية، ليست مثالية للدراسات الديناميكية باستخدام مجموعات بيانات التصوير ثلاثي الأبعاد. بالنسبة لشرائح Z-stack المتتالية، غالبًا ما تولد برامج التتبع التلقائي مجموعات مختلفة من "الفروع" وتعيد بناء الشجرة التقشرية بشكل مختلف، مما يجعل المقارنة على مستوى الفرع الواحد بين نقاط زمنية مختلفة بشكل خاص الصعب. وبالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع تتبع الشجرة dendritic كله، تتبع المحطة الطرفية يقلل بشكل كبير من وقت المعالجة والمتطلبات على قوة الحساب.
العديد من التعديلات يمكن أن تحسن من كفاءة والميزات التحليلية لأسلوبنا. لاستخراج المعلومات الموضعية الكمية من سلسلة صور الفاصل الزمني، فإن الشرح الدقيق لنصائح الفرع في جميع نقاط الوقت أمر بالغ الأهمية. يتم تنفيذ هذه الخطوة حاليا يدويا، والتي لا تستغرق وقتا طويلا فحسب، ولكن أيضا يدخل التباين. ومن المحتمل أن تعالج التطورات الجديدة في برمجيات التصور ثلاثية الأبعاد المفتوحة المصدر القيود التقنية الحالية وأن تجعل التشغيل الآلي لهذه الخطوة الحاسمة ممكناً. العديد من أدوات البرمجيات التي تم تطويرها مؤخرا توفير وظيفة القياس الكمي التلقائي للدراسات على filopodia16،17،18،19،20،21 ويمكن أن يكون يحتمل اختبارها واعتمادها للدراسات على ديناميات فرع dendrite.
الخطوة الأخرى التي يتم تنفيذها حاليايدوياً هو تعريف ملحق مقابل أحداث التراجع. يتطلب أتمتة هذه الخطوة إحداثيات ثلاثية الجوانب لمواقع التشعب الفرعية. من خلال مقارنة المسافات إلى موقع المتفرعة في نقطتين زمنيتين، يمكن تطوير scrip مكتوب حسب الطلب لتعيين اتجاه الإزاحات الطرفية. باتباع نفس المنطق، يمكن أيضًا استخدام إحداثيات ثلاثية الدُعد إضافية على طول الفرع لتحليل أحداث التمديد والتراجع التي تحدث داخل الفرع. هذه الإضافات لن تعمل فقط على تحسين سير عمل بروتوكولنا، ولكن أيضا زيادة محتويات المعلومات المتعلقة بالتغيرات الهيكلية للأشجار التقشرية على نطاقات زمنية مختلفة.
وباختصار، لدعم دراساتنا حول اللدونة dendrite تعتمد على الخبرة، وضعنا بروتوكولات التصوير الحي الفاصل الزمني وطرق القياس الكمي شبه الآلي لإجراء تقييمات لديناميات فرع سريع في تطوير الخلايا العصبية. استناداً إلى النتائج الناتجة عن الأساليب الموضحة هنا، حددت دراستنا فيلبوديا الددرية المنضوية للغاية في الخلايا العصبية المركزية دروسوفيلا وكشفت عن تنسيق تنموي بين ديناميات الدندرية المرتفعة وتناسل المشبك. ومن شأن التحسينات المستقبلية على مستوى الحصول على الصور والتشغيل الآلي أن تعزز إلى حد كبير إمكانات هذا البروتوكول وتيسر الدراسات المتعلقة بديناميات الدندرية واللدونة الهيكلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل برنامج البحوث داخل الجدارية التابع للمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، والمعاهد الوطنية للصحة. المشروع رقم 1ZIANS003137.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
- Wong, W. T., Wong, R. O. L. Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis. Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).
- Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation. The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).
- Cline, H., Haas, K. The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).
- Helfrich-Forster, C., et al. Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).
- Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil. Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).
- Yuan, Q., et al. Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System. Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).
- Sheng, C., et al. Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis. Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).
- Yin, J., et al. Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity. Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Harrison, D. A., Perrimon, N. Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila. Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9, 47 (2011).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Niell, C. M., Smith, S. J. Live optical imaging of nervous system development. Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).
- Jacquemet, G., et al. FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Urbančič, V., et al. Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).
