Summary
Burada, Drosophila larva beyninin canlı bir hazırlığında son derece hareketli dendritik filopodia'yı görüntülemek için uyguladığımız yöntemi ve dendritin kantitatif değerlendirmeleri için hızlandırılmış 3D görüntüleme veri kümelerini ölçmek için geliştirdiğimiz protokolü anlatıyoruz. nöronlar gelişmekte dinamikleri.
Abstract
Son derece hareketli dendritik filopodia erken gelişim evrelerinde nöronlarda yaygın olarak mevcuttur. Bu araştırmacı dinamik dallar çevredeki ortamı örneklemektedir ve potansiyel sinaptik ortaklarla temaslar başlatır. Dendritik dal dinamiği ile sinaptogenez arasındaki bağlantı iyi kurulmuş olsa da, gelişimsel ve aktiviteye bağlı süreçlerin dendritik dal dinamiği nasıl düzenlediği tam olarak anlaşılamamıştır. Bunun nedeni kısmen canlı görüntüleme ve in vivo sistemi kullanılarak bu ince yapıların kantitatif analizleri ile ilgili teknik zorluklardır. Drosophila larva ventral lateral nöronlar (LNvs) kullanarak dendrit dinamiği incelemek için bir yöntem oluşturduk, bu yöntem genetik yaklaşımlar kullanılarak ayrı ayrı etiketlenebilir ve canlı görüntüleme için erişilebilir. Bu sistemden yararlanarak, tüm dendritik çardakların dal dinamiklerini yakalamak için protokoller geliştirdik. Daha sonra sürüklenme düzeltme ve dekonvolution yoluyla görüntü kalitesini artırmak için post-processing gerçekleştirdik ve ardından tüm şube terminallerinin mekansal konumlarını ekleyerek tek dal düzeyinde dal dinamiklerini analiz ettik. Son olarak, terminal izleme tarafından oluşturulan koordinat bilgilerini kullanarak şube dinamiklerini ölçmek için R komut dosyaları(Tamamlayıcı Dosya)ve özel parametreler geliştirdik. Topluca, bu protokol bize yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük ile nöronal dendritik arbor dal dinamikleri ayrıntılı bir nicel açıklamasını elde etmek için izin verir. Geliştirdiğimiz yöntemler genellikle hem in vitro hem de in vivo koşullarda seyrek etiketli nöronlar için geçerlidir.
Introduction
Dendritler duyusal ve sinaptik girişi alan ve işleyen özel nöronal bölmelerdir. Dendritik çardakların karmaşık ve basmakalıp yapısı, keşiflerinden bu yana yoğun bir soruşturma altında. Model sistemleri, Xenopus optik tectal nöronlar, civciv retinaganglion hücreleri ve drosophila sisteminde dendritik arborization (da) nöronlar da dahil olmak üzere, geliştirme, remodeling ve plastisite incelemek için kurulmuştur nöronal dendritler1,2,3,4. Drosophila ventral lateral nöronlar (LNvs) görsel projeksiyon nöronlar bir grup başlangıçta sinek davranışları sirkadiyen düzenleme önemli işlevleri için tanımlanan5. Çalışmalar da larva fotoreseptörleri doğrudan postsinaptik hedef olarak larva LNvs rolünü ortaya (PRs)6,7. Daha da önemlisi, farklı ışık rejimlerinde gelişmekte olan larvaların kültürlenerek LNvs 'dendritik arbors boyutunu güçlü etkiler, dendritik plastisite eğitimi için yeni bir model olarak LNvs uygunluğunu gösteren7. Grubumuzdan son çalışmalar daha lnv dendrit boyutu ve dendritik dalların dinamik davranış deneyim bağımlı plastisite8,9görüntülemek gösterir. Bu çalışmanın bir parçası olarak, 2veya 3 instar larvasından LNvs'nin dendrit dinamiği üzerinde analiz yapmak için yeni bir canlı görüntüleme ve niceleme protokolü geliştirdik.
Drosophila larva beyninin şeffaf doğası onu canlı görüntüleme için ideal hale getirir. Ancak, LNvs dendritik arbors larva beyin lobmerkezindeyoğun innerve larva optik nöropil (LON) bulunmaktadır 6 . Bozulmamış beyin dokusunda ince dendrit dalları ve filopodia görüntüleri yakalamak için, biz ışık penetrasyon derinliğini artırır ve canlı görüntüleme deneyleri sırasında fototoksisite azaltır iki foton mikroskopi, kullanmak10. Bu kurulumu kullanarak, nöronun belirgin morfolojik bozulmasını gözlemlemeden LNvs üzerinde 30 dakikadan fazla canlı görüntüleme deneyleri gerçekleştirdik. Buna ek olarak, Flip-out tekniğini kullanarak genetik manipülasyonlar bize bir membran gfp etiketli ile bireysel LNvs etiketlemek için etkin, hangi da bireysel dalların hareketlerini izlemek için kritik11,12,13 .
LNv dendritik arbor'daki tüm dalların dinamik davranışını optimum optik çözünürlüğe sahip olarak yakalamak için, 10 ila 30 dakika boyunca kare başına 1 dk yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip, yeni diseksiyonlu larva beyin ekstrelerinde hızlandırılmış 3D görüntüleme gerçekleştirdik. dendritler son derece dinamiktir ve dalların büyük bir yüzdesi 10 dk'lık pencerede gözlemlenebilir değişiklikler gösterir. Bu, dendrite dinamiğinin incelenmesinde, 4B görüntü veri kümelerine dayalı dal davranışının ölçülmesinde en önemli teknik zorluklardan birine yol açar. Daha önce kurulan yöntemler, doğruluk eksikliği ve aşırı zaman gereksinimi de dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar vardır. Bu nedenle, görüntü işleme sonrası, şube terminallerinin manuel işaretleme ve görüntü ek açıklama yazılımı kullanarak otomatik 4D nokta izleme birleştiren yarı otomatik bir yöntem geliştirdik. Şube terminallerinin hareketlerini noktalardaki 3B koordinatları esas alınabılarak farklı zaman noktalarında hesaplıyoruz. Veriler daha sonra dışa aktarılır ve şube dinamiğinin nicel ölçümlerini üretmek için analiz edilir. Bu yöntem, mevcut dalların uzatma ve geri çekilme olaylarının süresini ve kapsamını ve yeni dalların oluşumunu doğru bir şekilde değerlendirerek çok sayıda nöronda dendrite dinamiklerini izlememizi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DİkKAT: Bu protokol sınıf IV lazerlerin kullanımını içerir ve uygun eğitim ve güvenlik yönergeleriuyulmasını gerektirir. Doğrudan veya dağınık lazer ışığına göz veya cilt maruz kaçının.
NOT: Protokol altı adım dan oluşur. İş akışı Şekil 1A'dagösterilmiştir.
1. Flip-out Tekniğini Kullanarak Bireysel Nöronların Etiketlemi
NOT: LNvs tek etiketleme flippase aracılı stokastik etiketleme kullanarak tek LNvs mCD8 ifade ederek elde edilir::GFP. Sinek hattının genotip: hs-flp; Pdf-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8::GFP11,12,13. LNv etiketli tek bir elde etme sıklığı %10 civarındadır. Sinek stokları sirkadiyen ve nem kontrollü 25 °C kuvözlerde standart ortamda muhafaza edilir.
- Maya takviyesi ile bir üzüm suyu tabağı üzerinde 2 saat pencere sonrası döllenme içinde 100-200 yumurta toplayın. Embriyoları 25 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın ve yeni yumurtadan çıkan ilk instar larvalarını bir sonraki adım için toplayın.
- Isı şoku 37.5 °C'de yeni yumurtadan çıkan ilk instar larvaları 40 dk iki kez, arada 40 dk geri kazanım süresi.
- Kültür sirkadiyen ve nem kontrolleri ile 25 °C'de istenilen gelişim aşaması(lar).
2. Diseksiyon ve Montaj Larva Beyin Ekspekte
- Fizyolojik dış salin çözeltisinde larva beyinlerinin diseksiyonu (120 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO3,10 mM Glikoz, 10 mM Sakkaroz, 5 mM TES, 10 mM HEPES, 2 mM Ca2+, PH 7.2) diseksiyon mikroskobu altında (4.5xnifikasyon büyütme) güç) iki çift #5 standart uç diseksiyonu forceps (11 cm) ile. Larva gövdesini yerinde tutmak için bir çift forceps kullanın ve diğerini de beyni dikkatlice parçala. Göz disklerini, beyin loblarını ve ventral sinir kordonu koruyun. Görüntüleme sırasında örnek hareketlerini en aza indirmek için bağlı kasları çıkarın.
- Cam bir slayt hazırlayın (25 x 75 x 1,0 mm3)ve vakum gresile kare bir oda çizmek için bir şırınga kullanın.
- Gres bariyerli kare haznesine 20 μL harici tuzlu çözelti ekleyin.
- Kesitlenmiş larva beyinlerini çiller kullanarak cam kaydıraktaki odaya aktarın. Disksiyon kapsamı altında beynin konumunu ayarlayarak sırt tarafının yukarı yada dönük olduğundan emin olun.
- Odayı cam kapak lı (22 x 22 x 0,15 mm3)kapatın. Larva beyni artık harici tuzlu çözeltisi ile dolu bir oda içinde slayt üzerine monte edilir (Şekil 1B).
NOT: Kapak kaymasına hafifçe basmak beyni sınırlar ve sonraki görüntüleme seansında numunenin sürüklenmesini azaltır.
3. Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme
NOT: Multifoton lazerle donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak hızlandırılmış görüntüleme deneyleri yapıyoruz. Edinme parametrelerinin diğer görüntüleme kurulumları için ayarlanması gerekir.
- 40X su daldırma hedefi (NA 1.3) ve epifloresan ışık kaynağı kullanarak tek tek etiketlenmiş nöronlar içeren beyin eksgelenetiği tanımlayın. Görüntü koleksiyonu için, 920 nm'ye ayarlanmış iki fotonlazer lazer ve descanned olmayan (NDD) dedektörü kullanın.
- Kare başına 512 x 512 piksel ve 10 dakika boyunca Z-stack başına 1 dk görüntü toplamak. 1). Ayarlar tipik bir x-y-z çözünürlüğü 0,11 x 0,11 x 0,25 μm3görüntüler oluşturur.
- Beyin diseksiyonu 30 dakika içinde zaman atlamalı görüntü serisi toplayın. Aşırı sürüklenme veya belirgin morfolojik bozulma içeren veriler post-processing ve nicelleştirme dışında tutulmalıdır.
4. Drift Düzeltme ve Deconvolution
NOT: Görüntü kalitesine bağlı olarak, her iki adım da isteğe bağlıdır, ancak şiddetle önerilir.
- Edinilmiş bir resim dosyanı bir sürüklenme düzeltme yazılımıyla açın. Deney için kullanılanlarla eşleşecek mikroskobik parametreleri edin. Yazılım için (bkz. Malzeme Tablosu), Yap | Mikroskobik parametreleri edin. İki foton seçeneği yoksa iki fotonlu görüntüler için mikroskop türünü geniş alan olarak ayarlayın ve yazılım tarafından tanımlanan iş akışını izleyin. Örneğin, Deconvolution sekmesini açın | Nesne Sabitleyicive sabitle'nin zaman çerçevelerinisabitle'yi seçin.
- Deconvolution yazılımındaki sürüklenme düzeltilmiş görüntüyü açın ve iş akışını izleyin. Yazılım için (Bkz. Malzeme Tablosu),stabilize edilmiş görüntüyü seçin ve ardından Deconvolution | Deconvolution Express. Daha iyi bir sonuç elde etmek için, Deconvolution Sihirbazıkullanarak parametreleri ince ayar.
- 4B verileri çözümleme ve görüntüdeki tanımlı noktaların uzamsal koordinatlarını raporlama yeteneğine sahip sonraki görüntü ek açıklama yazılımı tarafından desteklenen bir dosya türünde deconvolved görüntüyü kaydedin (Bkz. Malzeme Tablosu).
5. Görüntü Ek Gösterimi
- Görüntü ek açıklama yazılımındaki deconvolved görüntüyü açın. Şube ipuçlarını 3B olarak tüm zaman noktalarında inceleyin ve işaretleyin. Görüntü ek açıklama yazılımı, işaretli şube ipuçlarının uzamsal ve zamansal koordinatlarını bildirir ve saklar. Sonraki hesaplamalar için koordinat bilgilerini .csv dosyası olarak dışa aktarın.
NOT: Aşağıdaki iki adım, kullandığımız ek açıklama yazılımına özgüdür (bkz. Malzeme Tablosu). İş akışı diğer yazılımlar için farklı olabilir. - Noktalar modülü içinde "Otomatik oluşturmayı atla, el ile değiştir" seçeneğini tıklayın ve alttaki " OtomatikBağlanın seçili Spot" onay kutusunu işaretleyin ( Şekil3A). Zaman serisindeki çerçevelerin üzerinden gidin ve ek açıklama için bir dal seçin. Shift tuşunu basılı tutun ve bir nokta eklemek için şube terminal ucunu tıklatın. Tüm zaman noktaları üzerinden tıklayın.
NOT: Görüntü ek açıklama yazılımı kareler arasındaki noktaları bağlar ve otomatik olarak bir yörünge oluşturur. Şube ipuçlarının mekansal ve zamansal bilgileri artık işaretli noktalarla ilişkilidir. Tüm şube uçları açıklamalı olana kadar bu adımları tekrarlayın(Şekil 3B). - Noktalar modülünde İstatistikler sekmesini tıklatın, Ayrıntılı'yı seçin ve Belirli Değerler'i seçin | Pozisyon. Kaydedilen mekansal ve zamansal koordinat bilgileri sergilenecek. Bu bilgileri .csv dosyası olarak dışa aktarmak için Altyap'ı tıklatın (Şekil 3C).
6. Dendritik Dal DinamiğiNin Hesaplanması
NOT: Koordinat bilgileri kullanılarak, şube uçlarının 3B olarak yer değiştirmesi kolayca hesaplanabilir. Çalışmamızda tüm dendritik dal hareketleri Uzatma veya Geri Çekmeolarak kategorize edilir. Aşağıdaki adımlar, .csv dosyalarının özel yazılmış R komut dosyalarını(Tamamlayıcı Dosya)kullanarak ve manuel düzenleme yoluyla yön bilgilerini ekleyerek nasıl işleneceğiaçıklanmıştır.
- .csv dosyasını elektronik tablo olarak açın. İzLE Kimliği sütununa tıklayın, En Küçükten En Büyüğe Sırala seçeneğini tıklatın ve seçimi genişlet'i kabul edin. Sıralamadan sonra, Track ID her benzersiz dendritik dalı tanımlar ve aynı daldaki noktalar aynı Track KIMLIĞINI paylaşır. Zaman sütunu farklı zaman dilimlerinin bilgilerini depolar.
- Elektronik tabloya Bir Mesafe sütunu ekleyin. Koordinatlarını kullanarak her iki zamansal bitişik noktanın uzaklıklarını hesaplayın ve değerleri Uzaklık sütununa koyun(Şekil 4A).
- Tek voxel düzeyinde küçük hareketler. Görüntüleme ayarlarına göre, 0,3 μm genellikle düzeltilmemiş sürüklenen veya kusurlu görüntü ek açıklama gelen eserlerdir. 0,3 μm'den 0'a kadar olan tüm Mesafe değerlerini sıfırlayarak bu hareketleri filtreleyin. Birden çok .csv dosyayı el ile işleyin veya R komut dosyası toplu sütun filtrelememizi kullanın. R (Ek Dosya).
- Elektronik tabloda Yer değiştirme adlı yeni bir sütunel olarak oluşturun. Uzaklık sütunundaki değerleri yer değiştirme sütununa kopyalayın. Her şube ucu için uzantı ve geri çekme olaylarını el ile atayın. Bu bir uzantıysa, değiştirilen değeri değiştirmeden bırakın, bu da pozitif bir değerdir. Bu bir geri çekilme ise, karşılık gelen Yer Değiştirme değerini negatif bir değere (örneğin, 0,35'ten -0,35'e)değiştirin( Şekil 4B).
- Olayadlı yeni bir sütun oluşturun. Bu sütunda, tek tek uzantı ve geri çekme olayları için Yer Değiştirme değerlerini el ile toplayın (Şekil 4B).
- Değiştirilen elektronik tabloyu işleyip, R komut dosyası toplu sütun toplamını kullanarak uzantı ve geri çekme olaylarını yer değiştirme değerlerine göre ölçün. R (Ek Dosya). Çıkış parametreleri uzantı olay sayısı, geri çekme olayı sayısı, Kümülatif uzunluk uzatılmış, Kümülatif uzunluk geri çekilir, Net uzunluk değiştive toplam uzunluk .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan canlı görüntüleme protokolünü kullanarak, sonraki analizler ve niceleme için yüksek çözünürlüklü görüntü yığınları yakalarız. Ek Video 1, tek tek etiketli lnv. Şekil 2B, görüntü serisinin sekiz karesinin ilgili montajını gösteren bir temsilciden toplanan maksimum yoğunluklu (MIP) görüntü serisini gösterir. Her iki panelde de ok uçları geri çekme olaylarını işaretler ve oklar uzatma olaylarını işaretler.
Daha sonra, bir görüntü ek açıklama yazılımı(Tablo Malzemeler)kullanarak şube terminallerinin yarı otomatik 4D izleme gerçekleştiriyoruz. Şekil 3 B, tek tek etiketlenmiş bir temsilciden dinamik şube terminallerinin ek açıklamalarını gösterir. Bu yazılımı kullanarak görüntü yığınlarını 3B olarak görselleştiririz, tüm şube terminallerini manuel olarak işaretlerve terminallerin hareketlerini izlemek için Noktalar modüllerini kullanırız zaman içinde. Bu yazılım dendritik arbor dinamik olayların görsel temsilleri olarak hizmet veren, her açıklamalı şube terminali için zaman damgalı yörüngeleri oluşturur.
Daha sonra her zaman noktasında şube hareketlerinin yönünü ve mesafesini hesaplamak için açıklamalı dal uçlarından gelen koordinat bilgilerini kullanırız. Şekil 4A,B'deki ekran görüntüleri bunun nasıl sağlandığını gösterir. İşlenen elektronik tablolar, dinamik dalların yüzdesi, yeni şube sayısı, seyahat edilen kümülatif mesafe ve şube hareketi olaylarının sayısı da dahil olmak üzere dört parametreyle dendrite dinamiklerini ölçmek için kullandığımız çıktı dosyaları oluşturur. Şekil 4 C, farklı gelişim evrelerinden ayrı olarak etiketlenmiş LNvs için dendritik dal dinamiği karşılaştırmalarını gösterir. Memeli nöronlar ve zebra balığı tectal hücrelerinde bulgular ile tutarlı, LNv dendrite dinamikleri gelişimsel olarak düzenlenir14,15. Genç larvalarda LNv dendritler, 48-72 h sonra yumurta yumurtlama (AEL), eski larvalar göre önemli ölçüde daha dinamik, 96-120 h AEL, dört parametre ile ölçülen, ve dinamik tendritler arasında meydana gelen 72-96 h AEL8.
Şekil 1: Dendrit dinamiği görüntüleme ve niceleme protokolünün iş akışı. (A)Protokol, örnek hazırlama, görüntü toplama, görüntü işleme ve dendrite dinamiğinin yarı otomatik olarak ölçülmesini kapsayan altı adım içerir. (B) Dorsal tarafı yukarı monte edilmiş larva beyin ekstronu içeren bir görüntüleme odasını gösteren şematik bir diyagram. Beyin ekstrüzyonu her lobda ayrı ayrı lnv olarak etiketlenmiş ve dış salin çözeltisi dalmış. Vakum gres bariyerleri kapak sıvısının ağırlığını destekler ve beynin hareket etmesini engelleyen küçük bir oda oluşturur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dendritik dal dinamiğinin 3boyutlu zaman atlamalı görüntülemesi. (A)3'üncü yıldız larvasından ayrı olarak etiketlenmiş lnv'nin dendritik çardak. (B) (A)'nın temsili dal hareketlerini gösteren ilgili montaj görüntüsü. Ok başlıkları (Yeşil) geri çekme olaylarını işaretler; oklar (Kırmızı) işareti uzantısı olayları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Görüntü ek açıklama yazılımında dendritik dal terminallerinin manuel ek açıklama ve otomatik takibi. (A) Ekran görüntüsü, Noktalar modüllerini kullanarak şube terminal izleme ayarlarını gösterir. Kırmızı oval, Manuel İzleme seçeneğini özetler. (B) Tek tek etiketlenmiş LNv. Ölçek çubuğunda görüntü açıklama yazılımı tarafından oluşturulan açıklamalı şube terminallerinin (sarı noktalar) temsili zaman damgalı yörüngeleri = 5 μm. (C) Ekran görüntüsü görüntüleme için arabirimi gösterir ve spotlar modülünden koordinat bilgilerini ihraç etmek. Şekil 3B, Sheng, C. ve ark. 20188'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Dal terminallerinin koordinat bilgilerini kullanarak dendritik dal dinamiğinin ölçülmesi. (A) Ekran görüntüsü, X, Y ve Z koordinatlarını, Parça lı ilikleri ve bitişik çerçevedeki noktaların yer değiştirmesini hesaplamak için kullanılan formülü içeren elektronik tabloyu gösterir. (B) Ekran görüntüsü, bir şubenin izlenmesinden elde edilen temsili sonuçları gösterir. Küçük hareketler (<0.3 μm) filtrelendi. Geri çekilmeler, değerlerini negatife (Mesafe sütununa) atayarak işaretlenir. Bitişik pozitif/negatif değerleri toplayarak, her biyolojik uzantının/geri çekmenin yer değiştirmesi hesaplanır (Olaylar sütunu). (C) Dendrite dinamiğinin gelişimsel düzenlemesini gösteren sonuçların temsili niceliği. Veriler bir kutu çizimi (kutu, %25-75; orta çizgi, ortanca) nokta çizimi (tek tek veri noktaları) ile kaplanır olarak sunulur. Şekil 4C Sheng, C. ve ark. 20188'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: Saniyede 2 kare hızda oynanan on maksimum yoğunluklu projeksiyon (MIP) görüntü. Tüm dendritik çardak Z-yığını başına 1 dk olarak görüntülendi. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklayın).
Ek Dosya 1: Toplu Sütun Filtreleme.R Script. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Ek Dosya 2: Toplu Sütun Toplamı.R Script. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, Drosophila larva beyinlerinde tek tek etiketlenmiş nöronlarda dendritik dalların dinamik davranışını kaydetmek ve ölçmek için geliştirdiğimiz bir protokolü tanımlıyoruz. Özellikle, canlı görüntüleme protokolümüz, bir larva LNv'nin dendritik arbor'unu yakalamamızı ve dendrit dallarının dinamik durumunu küresel olarak görmemizi sağlayan özel parametreler içerir. Ancak, sayısallaştırma yöntemlerimiz ağırlıklı olarak dal terminallerinin ek açıklamalarına dayandığından, karmaşık dendritik yapılara ve yoğunlaştırılmış arborizasyonlara sahip nöronlar bu analiz için uygun konular değildir.
Örnek hazırlama, görüntü edinme ve işleme sonrası bu protokolün kritik adımlarıdır. Dendrite dinamiğinin doğru ölçülmesi için tek LNv'lerin yüksek kaliteli ham görüntüleri gereklidir. Verilerimiz, LNv dendrite morfolojisi ve fizyolojik yanıtlarının 30 dakika içinde özenle hazırlanmış larva beyin ekstrüzyonlarında iyi korunduğunu göstermektedir. Görüntüleme ve niceleme için gözlemlenebilir beyin dokusu bozulması, uzamış dendritik arbors ve dal kırılması ile örnekler kullanılmamalıdır. Düşük arka plana sahip ve gözlemlenebilir hareketlere sahip veri kümeleri için isteğe bağlı olsa da, şube terminallerinin ve otomatik inanca ek açıklama için önemli olan görüntü kalitesini artırmak için sürüklenme düzeltme ve dekonvolution adımlarını eklemenizi şiddetle tavsiye ediyoruz. nokta izleme. Çalışmalarımızda kullanılan ticari yazılımın yanı sıra, ImageJ/Fiji'nin Doğru 3D sürüklenme (Eklentiler | Kayıt | Doğru 3D drift) ayrıca drift düzeltme için iyi çalışır.
Bizim protokol ve mevcut yöntemler arasındaki en büyük farklardan biri, tek tek şube ipuçları nın hareketlerini izlemek değil, tüm dendritik arbor olduğunu. Toplam dendritik uzunluk ve mimarinin ölçülmesinde yararlı olsa da, tüm dendritik arborların yeniden inşası, 3D görüntüleme veri kümelerini kullanarak dinamik çalışmalar için ideal değildir. Ardışık Z-yığın dilimleri için, otomatik izleme programları genellikle farklı "dalları" kombinasyonları oluşturmak ve dendritik arbor farklı yeniden, özellikle farklı zaman noktaları arasında tek dal düzeyinde karşılaştırma yapma Zor. Buna ek olarak, tüm dendritik arbor izleme ile karşılaştırıldığında, terminal izleme önemli ölçüde işlem süresini ve hesaplama gücü gereksinimleri azaltır.
Çeşitli değişiklikler, yöntemimizin verimliliğini ve analitik özelliklerini potansiyel olarak artırabilir. Zaman atlamalı görüntü serisinden nicel konumsal bilgi ayıklamak için, şube uçlarının her zaman noktalarında doğru ek açıklama kritik öneme sahiptir. Bu adım şu anda el ile gerçekleştirilir, bu yalnızca zaman alıcı değil, aynı zamanda değişkenlik tanıtır. Açık kaynak 3D görselleştirme yazılımındaki yeni gelişmeler, mevcut teknik sınırlamaları ele alabilir ve bu kritik adımın otomasyonunu mümkün kılabilir. Birkaç yeni geliştirilen yazılım araçlarıfilopodia16,17,18,19,20,21 ve olabilir çalışmalar için otomatik nicelik fonksiyonu sağlamak potansiyel olarak test edilmiş ve dendrite dal dinamiği üzerine çalışmalar için benimsenmiştir.
Şu anda el ile gerçekleştirilen bir diğer adım da uzantı ve geri çekme olaylarının tanımlanmasıdır. Bu adımın otomasyonu, şube çatallama sitelerinin 3B koordinatlarını gerektirir. Dallanma alanına olan mesafeleri iki zaman noktasında karşılaştırarak, terminal yer değiştirmelerinin yönünü atamak için özel olarak yazılmış bir scrip geliştirilebilir. Aynı mantığı izleyerek, dal içinde meydana gelen uzatma ve geri çekme olaylarını analiz etmek için dal boyunca ek 3B koordinatlar da kullanılabilir. Bu eklentiler sadece protokolümüzün iş akışını optimize etmekle kalmaz, aynı zamanda farklı zamansal ölçeklerde dendritik arborların yapısal değişiklikleriyle ilgili bilgi içeriğini de artırır.
Özetle, deneyime bağlı dendrit plastisite çalışmalarımızı desteklemek için, gelişen nöronlarda hızlı dal dinamiği nin değerlendirilmesini gerçekleştirmek için hızlandırılmış canlı görüntüleme protokolleri ve yarı otomatik nicelleştirme yöntemleri geliştirdik. Burada açıklanan yöntemlerle elde edilen sonuçlara dayanarak, çalışmamız Drosophila merkezi nöronlarda son derece hareketli dendritik filopodia saptandı ve artan dendrit dinamiği ile sinaptogenez arasında gelişimsel bir koordinasyon ortaya çıkardı. Görüntü edinimi ve otomasyon düzeyinde ki gelecekteki gelişmeler bu protokolün potansiyelini büyük ölçüde artıracak ve dendrite dinamiği ve yapısal plastisite üzerine çalışmaları kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Proje numarası 1ZIANS003137.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chameleon Vision II multiphoton laser | Coherent | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | 79751-30 | |
| LSM 780 two-photon laser scanning confocal microscope | Carl Zeiss | upright configuration | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | for processing .csv files | |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | for drift correction and deconvolution | |
| Imaris | Oxford Instruments | for 3D visualization and image annotation | |
| Reagents | |||
| Glucose | |||
| HEPES | |||
| KCl | |||
| MgCl2 | |||
| NaCl | |||
| NaHCO3 | |||
| PBS | |||
| Sucrose | |||
| TES |
References
- Wong, W. T., Wong, R. O. L. Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis. Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).
- Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation. The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nature Reviews Neuroscience. 11, 316 (2010).
- Cline, H., Haas, K. The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).
- Helfrich-Forster, C., et al. Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).
- Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil. Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).
- Yuan, Q., et al. Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System. Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).
- Sheng, C., et al. Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis. Nature Communications. 9 (1), 3362 (2018).
- Yin, J., et al. Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity. Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
- Harrison, D. A., Perrimon, N. Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila. Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9, 47 (2011).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Niell, C. M., Smith, S. J. Live optical imaging of nervous system development. Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).
- Jacquemet, G., et al. FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387 (2017).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Systems Biology. 7 (1), 66 (2013).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Urbančič, V., et al. Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia. The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).
