Summary
Her beskriver vi en pre-klinisk dyremodell for å studere patofysiologi av iskemi-reperfusion skade i rekonstruktiv mikrokirurgi. Denne gratis hud klaff modell basert på overfladisk caudal epigastriet fartøy i rotte kan også tillate evaluering av ulike terapier og forbindelser for å motvirke iskemi-reperfusion skade-relaterte skader.
Abstract
Ischemia-reperfusion skade er den viktigste årsaken til klaff svikt i rekonstruktiv mikrokirurgi. Rotta er det foretrakk prekliniske dyr modell inne mange arealer av biomedisinsk forskning på grunn av dens bekostning-effektiviteten og dens oversettelse å human. Denne protokollen beskriver en metode for å opprette en prekliniske gratis hud klaff modell i rotter med iskemi-reperfusion skade. Den beskrevne 3 cm x 6 cm rotte gratis hud klaff modellen er lett oppnås etter plassering av flere vaskulære ligaturer og den delen av vaskulære pedicle. Så, 8 h etter iskemiske fornærmelse og gjennomføring av mikrokirurgisk anastomose, den frie huden klaff utvikler vevet skade. Disse iskemi-reperfusion skade-relaterte skader kan bli studert i denne modellen, noe som gjør det til en passende modell for å evaluere terapeutiske midler for å løse denne patofysiologiske prosessen. Videre er to viktigste overvåking teknikker beskrevet i protokollen for vurdering av denne dyre modellen: transitt-tid ultralydteknologi og laser speckle kontrast analyse.
Introduction
Mikrokirurgi har blitt en vanlig kirurgisk teknikk for rekonstruksjon som gjør det mulig for intervensjoner (f. eks, gratis vev overføringer) for å gjenopprette komplekse vevs feil, replantation av amputert lemmer, og selv kompositt vev allotransplantations.
Mikrokirurgisk rekonstruksjoner er ideelle for en rekke defekter forårsaket av traumatiske skader, brannskader, eller onkologiske reseksjoner. Men det er en lav prosentandel av gratis klaff svikt, blant hvilke iskemi-reperfusion (I/R) skade er en av de viktigste ansvarlige faktorer. Alle microsurgically overført vev tåle en obligatorisk periode med iskemi etterfulgt av reperfusion. Denne perioden av primær iskemi er vanligvis godt tolerert; dermed overstiger suksessraten for mikrokirurgisk prosedyrer 90%1,2. Men bare 63,7% av klaffer som krever kirurgisk revisjon kan være fullstendig lagret3. I tillegg, i tilfeller av replantation av finger avulsion Kader, er suksessraten 66%4; og i tilfeller av kompositt vev allografting lidelse I/r skade, avslag prosenter er økt siden i/r skaden aktiverer medfødt immunitet5,6.
Derfor er studiet av dette patofysiologiske fenomenet av interesse. Animal modeller er avgjørende for å undersøke fysiologiske mekanismer og vurdere romanen terapier før den kan brukes til mennesker7. Fartøy anatomi og fysiologiske likheter mellom rotter og mennesker gjør rotter en ideell modell for etterforskning av biologiske prosesser som I/R skade.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for etablering av en rotte gratis hud klaff modell med I/R personskade, samt ulike muligheter for intra-og postoperative vurderinger. Det overordnede målet med denne metoden er å beskrive en nyttig prekliniske modell for å studere I/R skade og mulige behandlinger for å redusere sine relaterte skader.
Protocol
Alle prosedyrer ble gjennomført i samsvar med etisk komité av Jesús Usón minimalt invasiv kirurgi senter og velferd retningslinjer for den regionale regjeringen som er basert på europeisk lovgivning.
1. presurgical og kirurgisk forberedelse
- House Wistar rotter som veier 290 – 350 gram i bur ved 22 – 25 ° c med fri tilgang til mat og vann. Acclimate for 1 uke før operasjonen for å hindre stress-indusert problemer.
- Plasser en rotte i en bedøvelse induksjon kammer, levere 5 min av oksygen (0,5-1 L/min), og bruk en fordamper for å levere 5% desflurane å indusere anestesi.
- Ta rotta ut av kammeret når anestesi er indusert. Plasser innånding ansiktsmaske på rotte og gi en strømningshastighet på 2% desflurane å opprettholde anestesi. Sjekk for mangelen på respons på en tå knipe.
- Bruk en øyebeskyttelse salve for å hindre hornhinnen tørking og skade.
- Overvåk dyret under narkose som følger: Plasser et rektal termometer (35.9 – 37.5 ° c), sjekk slimhinnen farge, og plassere en gnager puls oximeter for å se etter O2 metning (> 95%) og hjertefrekvens (250 – 450 BPM).
- Bruk en varme støtte (elektrisk oppvarming pads eller sirkulerende vann pledd) for å unngå nedkjøling og forbedre post-prosessuelle anestesi utvinning.
- Injiser 5 mL varm subkutan fysiologisk saltløsning for å opprettholde riktig hydrering.
- Gi smertestillende og anti-inflammatoriske legemidler (meloksikam 1 mg/kg/dag) og forebyggende antibiotika (enrofloksacin 7,5 mg/kg/dag) subkutant før inngrepet og i 5 dager postoperativt.
- Barbere dyrets abdominal og lysken områder.
- Påfør aktuell povidon-jod, etterfulgt av 70% etanol. Dekk dyret med en steril gardin.
2. gratis Skin klaff modell kirurgi
- Ved hjelp av en kirurgisk markør tegner du en 3 cm x 6 cm klaff som matcher en av de 6 cm sidene med mage midtlinjen. Deretter lage en 6 cm hud snitt på midtlinjen av magen og to vinkelrett 3 cm snitt i øvre og nedre del av 6 cm midtlinjen snitt.
- For å starte dissekere den utformede 3 cm x 6 cm hud klaff, bruk saks og Adson tang for å heve klaffen (i stedet for en skalpell) på grunn av hudens mobilitet.
- Forsiktig trekke klaffen fra skallen området mot caudal området for å hjelpe til med disseksjon og identifisere epigastriet pedicle omgitt av rikelig løs bindevev.
- Analysere klaffen pedicle uten å berøre den eller ved å fatte adventitia så lite som mulig for å unngå skade på fartøyet veggen.
- Bruk 8/0 nylon sting for å tette av ligaturer de proksimale caudal lår fartøy, lateral cirkumfleks lår fartøy, og saphenavenen fartøy. Derved er den av klaffen gitt av lårarterien og fortsetter direkte gjennom den overfladiske caudal epigastriet arterien, mens venøs drenering utføres av den overfladiske caudal epigastriet vene mot lår Bens venen.
- Klemme den vaskulære pedicle og deretter klippe det å starte 8 h ischemia perioden. Under prosedyren bruke elektriske tepper for å opprettholde temperaturen. To 5 ml injeksjoner av varm (25 ° c) 0,9% saltoppløsning administreres subkutant. Den første administrasjonen er utført 2 timer etter begynnelsen av prosedyren; og den andre på slutten av prosedyren for å få en skikkelig utvinning av dyret.
- Bruk heparinisert saltoppløsning (100 U/mL) for å perfuse klaffen og fjerne stillestående blod fra mikrosirkulasjonen.
- Bruk 10/0 nylon sting for å utføre mikrokirurgisk anastomoser.
- Etter 8 h av iskemi, reperfuse klaffen ved å fjerne mikrovaskulær klemmer og sjekk vaskulære patency som beskrevet nedenfor.
3. intraoperativ vurdering
- Utfør en manuell patency test (tom og refill test) for vene og arterien. For å gjøre dette, bruker to mikrokirurgisk tang, plassere dem på anastomose og utføre melking. Slipp den nærmeste pinsett til det anastomose stedet først. Hvis blodgjennomstrømningen fortsetter etter at en vaskulær del er tømt, er anastomose patent.
- Vurdere blodstrømmen ved hjelp av en transitt-tid ultralyd flowmeter og mikrokirurgisk sonder.
- Mål diameteren på de pedicle fartøyene for å velge riktig størrelse for strømnings sonder.
Merk: En 0,7 mm strømnings sonde kan måle fartøy som spenner fra 0,4 mm til 0,7 mm; en 1,0 mm strømnings sonde kan måle fartøy som spenner fra 0,7 mm til 1,0 mm; en 1,5 mm strømnings sonde kan måle fartøy som spenner fra 1,0 mm til 1,5 mm. - Plasser mål fartøyet i ultralyd sensorvinduet (mellom reflektor og transdusere) i strømnings proben for å kvantifisere strømnings volumet.
Merk: Hold sonden nøytral til flyet av fartøyet, for å unngå spenning eller trekking. - Kontroller kvaliteten på den akustiske koblingen ved å observere at alle stolpene er grønne på skjermen.
Merk: Hvis det er vanskelig å få god akustisk kopling, bruk ultralyd gelé eller fysiologisk saltløsning lokalt. - Når det oppnås god kopling og fartøyet plasseres i det akustiske vinduet uten spenning, klikk på opptaks knappen på skjermen for å lagre dataene.
Merk: For å oppnå en pålitelig og korrekt måling, sørg for at bølgemønsteret kontinuerlig gjentas.
- Mål diameteren på de pedicle fartøyene for å velge riktig størrelse for strømnings sonder.
- Når ferdig, bruk Polyglycolic acid (PGA) 4-0 absorberbare flettet sting (16 mm 3/8 trekantet nål) for å lukke huden. Bruk et enkelt avbrutt mønster for å opprettholde styrke og vevs posisjon hvis en del av Sutur blir bitt av rotte postoperativt.
- Vurder klaffen er mikrosirkulasjonen ved hjelp av laser speckle kontrast analyse (LASCA).
- Lag en nyinnspilling for hvert dyr og for hver oppfølging av studien. For dette klikker du på fil/nyinnspilling. Et nytt vindu åpnes, og Oppsett panelet vises. Rediger deretter informasjonen for prosjektnavnet, emnet, operatoren og Innspillings navnet.
- For maksimal reproduserbarhet, standardisere følgende parametere: arbeidsavstand, Måleområde, punkttetthet, bildefrekvens og omgivelseslys.
- Juster arbeidsavstand ved å flytte laseren i forhold til vevet. Zoom inn eller ut laser hodet mot vevet av interesse. Klikk på bildeoppsettfor å se etter den målte verdien. Her, satt til 12,0 cm.
- Standardisere måleområdet ved å angi ønsket bredde og høyde ved bildeoppsett. Den utformede klaffen måler 3 cm x 6 cm. For denne målingen velger du en bredde på 4,0 cm og en høyde på 7,0 cm for å få litt ekstra plass.
- Angi punkttettheten som høy i bildeoppsett. Høy, middels og lav er de tre alternativene.
- Under installasjonen av Image Capture velger du bildefrekvens (10 bilder/s) for opptaket og varigheten (1 min) av opptaket.
Merk: Har samme omgivelseslys tilstand i operasjonsstuen mens du bruker eller utfører vurderingene. - Klikk på Record -knappen for å starte innspillingen. Oppsetts panelet erstattes av opptakspanelet. Data lagres automatisk. Ta øyeblikksbilder under prosedyren for å muliggjøre videre sammenligning.
Merk: Effekt skalaen kan endres for å forbedre visualiseringen (Klikk verktøy | Filtre og fargeskalaer | Målestokk | Manuell 0-150), men de målte verdiene vil ikke påvirkes. Før og etter innspillingen kan det opprettes ulike interesseområder (ROIs) for å måle hvor de er. Her vurderte vi bare det området av praktisert klaff (3 cm x 6 cm).
- Bruk ImageJ programvare for å måle overlevelse og nekrose områder.
- Finn en linjal på siden av klaffen og deretter ta kontroll bilder for makroskopisk målinger av klaffen overlevelse området.
- Du kan evaluere bilder ved å åpne ImageJ-brukergrensesnittet. Klikk på fil og Åpne bildet som skal måles.
- Velg rett linje i verktøykassen, og tegn en rett linje over 1 cm av linjalen. Klikk på analyser | Angi skala og innføre i tekstboksen for kjent avstand verdien av 1 cm.
- Klikk på polygon Selection Tool og tegne polygon linjene over klaffen for å beregne levedyktig område. Til syvende og sist, klikk på analyser | Mål for å oppnå områdeverdien.
- Plasser en postoperativ dressing på dyret før bolig for å hindre selvskading av operasjonsområdet. Etter prosedyrene, dyr er plassert i bur individuelt, i et rom med temperaturkontroll (22 ° c til 25 ° c).
4. postoperativ vurdering og vevs prøving
- Bedøve rotta på 7 postoperative dager for klaffen vurdering og vevsprøver ved å følge samme fremgangsmåte som tidligere beskrevet i denne protokollen (trinn 1,2 og 1,3). Sjekk for dybden av anestesi ved mangel på respons på tå knipe.
- Fotografere operasjonsområdet for å muliggjøre makroskopisk målinger av klaffen overlevelse og nekrose områder. Gjør de postoperative makroskopisk målingene etter de samme trinnene i intraoperativ vurderingen som har blitt forklart før i protokollen (trinn 3,5).
Merk: Vær oppmerksom mens du bruker polygon markeringsverktøyet ved å tegne linjene på klaffen som avgrenser det levedyktige området (målt i cm2). Prosentandelen av levedyktig område kan beregnes som (cm2 av levedyktig område/cm2 av totalt klaff område) × 100. - Vurder mikrosirkulasjonen til klaffen ved hjelp av LASCA-teknikken (trinn 3,4) for å visualisere og kvantifisere
- Etter makroskopisk analyse, fjerne 4/0 sting og stige klaffen for å revurdere den vaskulære pedicle blodstrøm ved hjelp av transitt-tid ultralyd.
-
Utfør vevsprøver ved lengderetningen dele klaffen i to deler av 1,5 cm x 6 cm.
- Dypp en del i en biopsi beholder med 4% paraformaldehyde ved romtemperatur for videre histologiske analyser.
- Introduser den andre delen av vevet i et kryonisk bevaring rør, dypp det i flytende nitrogen og deretter lagre nedfryste røret ved å lagre det på-80 ° c for fremtidige molekylære analyser.
- Euthanize rotte under generell innånding anestesi ved hjelp av en rask intrakardielle injeksjon av 2 M KCl/kg i henhold til etiske komiteen anbefalinger.
Representative Results
Umiddelbart etter etableringen av mikrokirurgisk anastomoser, oppnådde vi høyere blodstrøm volumer enn minimum renn anbefalt i litteraturen8; Dermed ble alle mikrokirurgisk anastomoser patent 1 uke etter operasjonen (figur 1).
Figur 1: transitt-tid ultralyd blodstrøm vurdering. (A) plassering av mikrokirurgisk strømnings sonde for å vurdere blodstrøm. (B) blodstrøm mønster og kvantifisering innhentet av endetarms fartøy av klaffen pedicle. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Observasjon av microcirculatory deprivasjon av blodstrøm under iskemiske fornærmelse var mulig med LASCA teknikk, inkludert umiddelbar Hyper-blod under klaffen reperfusion, og, perioperatively, de ulike områdene med mindre og høyere risiko for postoperativ klaff nekrose som faktisk var necrotized 7 dager etter slutten av studien (figur 2).
Figur 2: Laser speckle kontrast analyse teknologi. (A) visualisering av microcirculatory vev blod i den fysiologiske tilstand. (B) visualisering av microcirculatory vev blod i løpet av iskemi. (C) visualisering av microcirculatory vev blod under reperfusion. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Klaffen overlevelse området etter 8 h av iskemi og påfølgende reperfusion var rundt 40%. Tidligere publiserte resultater9 viste statistisk signifikante forskjeller når denne modellen ble sammenlignet med klaffer der ingen iskemiske fornærmelse ble påført.
Discussion
Mikrokirurgisk gratis vev overføringer har blitt metoden for valg for rekonstruere store defekter. En periode med iskemi oppstår under slike frie vev overføringer. Når denne perioden overskrider vevet toleranse, kan jeg/R skade forårsake svikt i praktisert gratis klaff9. Beskrivelsen av metodikken for å utvikle en kostnadseffektiv og translational prekliniske modell for å studere i/R skade i rekonstruktiv mikrokirurgi kan bidra til å lede studiet av ulike forbindelser for å motvirke denne patofysiologiske prosessen.
I den beskrevne dyremodell, etter at vaskulære ligaturer ble plassert og den frie klaffen ble hevet, ingen hindlimb bentap blodstrøm kompromisser ble notert, eller smerte eller slapp. Som Kochi et al.10 beskrev, vår modell også igjen tre sivile ruter gjennom intramuskulær nettverk.
Overvåking av frie klaffer er av stor betydning11, som berging er omvendt knyttet til varigheten mellom iskemi utbruddet og dens klinisk anerkjennelse. For dette formålet, bør frie klaffer bli studert intra-og postoperativt.
Intraoperatively, den mye brukte tom og refill test eller akustisk Doppler aktivere identifisering men ikke kvantifisering av flyt tilstedeværelse eller fravær gjennom en anastomose12. Av denne grunn har vi brukt transitt-tid ultralydteknologi, en ny metode som gjør at kirurger å kvantifisere blodstrømmen av mikrokirurgisk anastomoser13. I vår studie, alle mikrokirurgisk anastomoser ble patent etter 8 h av iskemiske fornærmelse samt på slutten av studien. Umiddelbart etter etableringen av mikrokirurgisk anastomoser, noterte vi høyere blodstrøm volumer enn minimumskrav anbefalt i litteraturen8. Dette spådde god pedicle på slutten av studien, viser at resultatene ikke var påvirket av mikrokirurgisk teknikk, men heller av i/R skade kaskade av hendelser. Denne teknikken er imidlertid ikke uten begrensninger. For å oppnå pålitelige resultater, må mikrokirurgisk sonder holdes nøytral til flyet av fartøyet, ikke trekke den eller skape noen spenning. En god akustisk kopling er nødvendig for å oppnå et riktig signal, som kan oppnås ved hjelp av ultralyd gel eller saltvann. En høy kvalitet koplings signal, levert av utstyret, er en viktig parameter for å vurdere under målingene.
Vi har brukt LASCA, også kjent som laser speckle kontrast Imaging eller laser speckle Imaging, postoperativt14. Denne teknologien representerer en verdifull teknikk for semi-kvantitativ sann tids kartlegging av flyt i frie klaffer som er verifisert her. En av begrensningene er at resultatene er gitt i vilkårlige enheter og ikke direkte relatert til faktiske strømnings verdier. I denne forstand er videre forskning nødvendig for å validere denne sammenhengen. Laser Doppler flowmetry er mer vanlig, men begrenset av det faktum at det bare måler i ett punkt i klaffen, mens LASCA tillater påvisning av regionale endringer i huden i klaffen15. Videre indikerte en fersk studie16 at LASCA kan perioperatively forutsi regionene med høy risiko for postoperativ klaff nekrose. Våre resultater tyder på at LASCA er en lovende teknikk for Peri-og postoperativ overvåkning av frie klaffer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskningen prosjektet ble utført på Jesús Usón minimal invasiv kirurgi Center (CCMIJU), en del av IKT Nanbiosis. Studien ble utført med hjelp fra følgende Nanbiosis enheter: U21, eksperimentell operasjonsstue; U22, dyr bolig; og U14, celle terapi. Dette arbeidet ble støttet av ISCIII prosjektet PI16/02164. Funder hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller manuskript forberedelse. Spesiell takk er utvidet til María Pérez for å forberede tallene og til Fernanda Carrizosa for å gi konstant oppmuntring og støtte den vitenskapelige bibliografi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AureFlo Unit | Transonic (Ithaca, USA) | N/A | Transit-time ultrasound flowmeter equipment |
| Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle) | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | RHR-SET. Art.No.00795 | Set of microsurgical instruments |
| FLOW-i | Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) | N/A | Anesthesia Delivery System |
| Micro clamps ABB-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00408V | Double microvascular clamp with frame |
| Micro clamps ABB-11 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00414V | Double microvascular clamp without frame |
| Micro clamps B-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00396V | Sigle microvascular clamp |
| Nylon suture 10/0 | Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) | 19921 | Microsurgical suture |
| OPMI Pentero 800 | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | N/A | Surgical microscope |
| PeriCam PSI System | Perimed AB (Järfälla, Sweden) | N/A | Laser speckle contrast analysis equipment |
| Philips Intellivue MX450 | Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) | N/A | Monitoring system |
| Protector posoperatorio para roedores | Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain) | P201400272 | Postoperative protector for rodents |
References
- Siemionow, M., Arslan, E. Ischemia/reperfusion injury: a review in relation to free tissue transfers. Microsurgery. 24 (6), 468-475 (2004).
- Wang, W. Z., Baynosa, R. C., Zamboni, W. A. Update on ischemia-reperfusion injury for the plastic surgeon: 2011. Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (6), 685-692 (2011).
- Chen, K. T., et al. Timing of presentation of the first signs of vascular compromise dictates the salvage outcome of free flap transfers. Plastic and Reconstructive Surgery. 120 (1), 187-195 (2007).
- Sears, E. D., Chung, K. C. Replantation of finger avulsion injuries: a systematic review of survival and functional outcomes. The Journal of Hand Surgery. 36 (4), 686-694 (2011).
- Caterson, E. J., Lopez, J., Medina, M., Pomahac, B., Tullius, S. G. Ischemia-reperfusion injury in vascularized composite allotransplantation. The Journal of Craniofacial Surgery. 24 (1), 51-56 (2013).
- Amin, K. R., Wong, J. K. F., Fildes, J. E. Strategies to Reduce Ischemia Reperfusion Injury in Vascularized Composite Allotransplantation of the Limb. The Journal of Hand Surgery. 42 (12), 1019-1024 (2017).
- Barre-Sinoussi, F., Montagutelli, X. Animal models are essential to biological research: issues and perspectives. Future Science OA. 1 (4), (2015).
- Shaughness, G., Blackburn, C., Ballestin, A., Akelina, Y., Ascherman, J. A. Predicting Thrombosis Formation in 1-mm-Diameter Arterial Anastomoses with Transit-Time Ultrasound Technology. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (6), 1400-1405 (2017).
- Ballestin, A., et al. Ischemia-reperfusion injury in a rat microvascular skin free flap model: A histological, genetic, and blood flow study. PloS One. 13 (12), 0209624 (2018).
- Kochi, T., et al. Characterization of the Arterial Anatomy of the Murine Hindlimb: Functional Role in the Design and Understanding of Ischemia Models. PloS One. 8 (12), (2013).
- Smit, J. M., Zeebregts, C. J., Acosta, R., Werker, P. M. Advancements in free flap monitoring in the last decade: a critical review. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (1), 177-185 (2010).
- Krag, C., Holck, S. The value of the patency test in microvascular anastomosis: Correlation between observed patency and size of intraluminal thrombus: An experimental study in rats. British Journal of Plastic Surgery. 34, 64-66 (1981).
- Selber, J. C., et al. A prospective study of transit-time flow volume measurement for intraoperative evaluation and optimization of free flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (2), 270-281 (2013).
- Briers, D., et al. Laser speckle contrast imaging: theoretical and practical limitations. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066018 (2013).
- Zotterman, J., Bergkvist, M., Iredahl, F., Tesselaar, E., Farnebo, S. Monitoring of partial and full venous outflow obstruction in a porcine flap model using laser speckle contrast imaging. Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 69 (7), 936-943 (2016).
- Zotterman, J., Tesselaar, E., Farnebo, S. The use of laser speckle contrast imaging to predict flap necrosis: An experimental study in a porcine flap model. Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 72 (5), 771-777 (2019).
