Summary
Здесь мы описываем доклиническую модель животного для изучения патофизиологии ишемии-реперфузионной травмы в реконструктивной микрохирургии. Эта бесплатная модель лоскут кожи на основе поверхностных каудальных эпигастральных сосудов в крысы может также позволить для оценки различных методов лечения и соединений противодействовать ишемии реперфузии травмы, связанные с повреждением.
Abstract
Ишемия-реперфузионная травма является основной причиной отказа лоскута в реконструктивной микрохирургии. Крыса является предпочтительной доклинической моделью животных во многих областях биомедицинских исследований из-за своей экономической эффективности и ее перевода на человека. Этот протокол описывает метод создания доклинической свободной модели лоскуткожи кожи у крыс с ишемией-реперфузии травмы. Описанная модель крысиного лоскута 3 см х 6 см легко получить после размещения нескольких сосудистых лигатур и секции сосудистой педикулы. Затем, 8 ч после ишемического оскорбления и завершения микрохирургического анастомоза, свободный лоскут кожи развивает повреждение тканей. Эти ишемии реперфузии травм, связанных с ущербом могут быть изучены в этой модели, что делает его подходящей моделью для оценки терапевтических агентов для решения этого патофизиологического процесса. Кроме того, в протоколе оценки этой модели животных описаны два основных метода мониторинга: ультразвуковая технология транзитного времени и анализ контрастности лазерного пятнышка.
Introduction
Микрохирургия стала распространенной хирургической методикой реконструкции, которая позволяет проводить вмешательства (например, бесплатные передачи тканей) для восстановления сложных тканевых дефектов, реплантации ампутированных конечностей и даже композитных аллотрансплантаций тканей.
Микрохирургические реконструкции идеально подходят для широкого спектра дефектов, вызванных травматическими травмами, ожогами или онкологическими резекциями. Тем не менее, существует низкий процент свободного отказа лоскут, среди которых ишемия-реперфузии (I / R) травмы является одним из основных ответственных факторов. Все микрохирургически передаваемые ткани переносят обязательный период ишемии с последующим реперфузией. Этот период первичной ишемии, как правило, хорошо переносится; таким образом, успешность микрохирургических процедур превышает 90%1,2. Тем не менее, только 63,7% закрылков, требующих хирургического пересмотра могут быть полностью сохранены3. Кроме того, в случаях пересадки травмы судороги пальцев, показатель успеха составляет 66%4; а в случаях композитной аллотрансплантации ткани, страдающей травмой I/R, процент отторжения увеличивается, так как травма I/R активирует врожденный иммунитет5,6.
Поэтому интерес представляет изучение этого патофизиологического явления. Модели животных имеют важное значение для исследования физиологических механизмов и оценки новых методов лечения, прежде чем он может быть применен к людям7. Анатомия судов и физиологическое сходство между крысами и людьми делают крыс идеальной моделью для исследования биологических процессов, таких как травма I/R.
Здесь мы представляем подробный протокол для создания модели свободной от крыс кожи лоскут с I / R травмы, а также различные возможности для внутри- и послеоперационных оценок. Общая цель этого метода заключается в описании полезной доклинической модели для изучения травмы I/R и возможных методов лечения, чтобы уменьшить связанные с этим повреждения.
Protocol
Все процедуры проводились в соответствии с этическим комитетом Центра минимальной инвазивной хирургии Хесуса Усона и руководящими принципами регионального правительства, основанными на европейском законодательстве.
1. Предоперационная и хирургическая подготовка
- Дом Wistar крыс весом 290-350 г в клетках при 22-25 градусах Цельсия с бесплатным доступом к пище и воде. Акклимат и сделать за 1 неделю до операции, чтобы предотвратить стрессовые проблемы.
- Поместите крысу в наркотическую индукционную камеру, доставьте 5 мин кислорода (0,5-1 л/мин) и используйте испаритель, чтобы доставить 5% севфлуран для индукции.
- Возьмите крысу из камеры, как только анестезия индуцируется. Поместите ингаляционную маску на крысу и обеспечить скорость потока 2% севфлуран для поддержания анестезии. Проверьте отсутствие реакции на щепотку нос.
- Используйте мазь для защиты глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы и повреждения.
- Мониторинг животного под общим наркозом следующим образом: Поместите ректальный термометр (35.9-37.5 c), проверьте цвет слизистой оболочки, и положение оксиметра пульса грызуна, чтобы проверить на насыщенность O2 (Яgt;95%) и частота сердечных приступов (250-450 bpm).
- Используйте тепловую поддержку (электрические колодки для нагрева или циркулирующие водные одеяла), чтобы избежать переохлаждения и улучшить постпроцедурное восстановление анестезии.
- Вводят 5 мл теплого подкожного физиологического соблюстического раствора для поддержания правильной гидратации.
- Предоставлять обезболивающие и противовоспалительные препараты (мелоксикам 1 мг/кг/день) и профилактические антибиотики (энрофлоксацин 7,5 мг/кг/день) подкожно перед процедурой и в течение 5 дней после операции.
- Бритье брюшной полости животного и области глоток.
- Нанесите актуальный повидон-йод, за которым следует 70% этанола. Обложка животного стерильной драпировкой.
2. Бесплатная кожа Flap Модель хирургии
- Используя хирургический маркер, нарисуйте лоскут 3 см х 6 см, соответствующий одной из сторон 6 см с средней линией живота. Далее сделайте разрез кожи на 6 см в средней линии живота и два перпендикулярных 3 см разреза в верхней и нижней части разреза средней линии 6 см.
- Для начала вскрытия разработан 3 см х 6 см кожи лоскут, используйте ножницы и щипцы Adson поднять лоскут (а не скальпель) из-за подвижности кожи.
- Аккуратно вытяните лоскут из черепной области к каудальной области, чтобы помочь с вскрытием и определить эпигастральный pedicle окружен обильным свободной соединительной ткани.
- Вскрыть лоскут pedicle, не касаясь его или схватив adventitia как можно меньше, чтобы избежать повреждения стенки судна.
- Используйте 8/0 нейлоновых швов, чтобы охладить лигатурами проксимальные каудальные бедренные сосуды, боковые циркулярные бедренные сосуды и сафеновые сосуды. Таким образом, перфузия клапана обеспечивается бедренной артерии и продолжается непосредственно через поверхностные каудальной эпигастральной артерии, в то время как венозный дренаж осуществляется поверхностной каудальной эпигастральной вены к бедренной вены.
- Зажим сосудистой педикули, а затем вырезать его, чтобы начать 8 ч ишемии период. Во время процедуры используйте электрические одеяла для поддержания температуры. Две инъекции 5 мл теплого (25 градусов по Цельсию) 0,9% сольного раствора вводят подкожно. Первая администрация выполняется 2 ч после начала процедуры; и второй в конце процедуры для получения надлежащего восстановления животного.
- Используйте гепаринизированный соленом (100 U/mL), чтобы оперировать лоскут и удалить застойную кровь из микроциркуляции.
- Используйте 10/0 нейлоновых швов для выполнения микрохирургических анастомозов.
- После 8 ч ишемии, reperfuse лоскут, удалив микрососудистые зажимы и проверить сосудистой патологии, как описано ниже.
3. Интраоперационная оценка
- Выполните ручной тест по простоиции (пустой и пополненный тест) для вены и артерии. Для этого используйте два микрохирургических щипцы, расположите их дистальными к анастомозу и выполняйте доение. Отпустите ближайшие щипцы к месту анастомоза в первую очередь. Если кровоток продолжается после того, как сосудистое сечение опустеет, то анастомоз патент.
- Оцените кровоток с помощью ультразвукового потока и микрохирургических зондов.
- Измерьте диаметр педикл сосудов, чтобы выбрать правильный размер для зондов потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд потока 0,7 мм может измерять сосуды от 0,4 мм до 0,7 мм; зонд потока 1,0 мм может измерять сосуды от 0,7 мм до 1,0 мм; 1,5-мм зонд может измерять суда от 1,0 мм до 1,5 мм. - Поместите судно-мишень в ультразвуковое окно зондирования (между отражателем и преобразователями) зонда потока для количественной оценки объема потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите зонд нейтральным к плоскости судна, чтобы избежать какого-либо напряжения или потянув. - Проверьте качество акустической связи, заметив, что все бары зеленые на дисплее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если трудно получить хорошую акустическую связь, использовать ультразвуковой гель или физиологический солевой раствор местно. - Когда хорошее соединение достигается и судно помещается в акустическое окно без напряжения, нажмите на кнопку Запись на дисплее для хранения данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить надежное и правильное измерение, убедитесь, что волновая форма шаблона постоянно повторяется.
- Измерьте диаметр педикл сосудов, чтобы выбрать правильный размер для зондов потока.
- После этого используйте полигликолевую кислоту (PGA) 4-0 усваиваемые плетеные швы (16 мм 3/8 треугольной иглы), чтобы закрыть кожу. Используйте простой прерванный шаблон для поддержания прочности и положения ткани, если часть шва откусил крыса после операции.
- Оцените микроциркуляцию лоскута с помощью лазерного анализа контрастного пятнышка (LASCA).
- Сделать новую запись для каждого животного и для каждого последующего исследования. Для этого нажмите Файл / Новая запись. Открывается новое окно и отображается панель настройки. Затем отодевать информацию о названии проекта, объекте, операторе и названии записи.
- Для максимальной воспроизводимости стандартизируют следующие параметры: рабочее расстояние, область измерения, плотность точек, частота кадров и условия освещенности окружающего состояния.
- Отрегулируйте рабочее расстояние, перемещая лазер по отношению к ткани. Увеличьте или вынизвейте лазерную головку к ткани интереса. Чтобы проверить измеренное значение, нажмите настройка изображения. Здесь, набор на 12,0 см.
- Стандартизуируем область измерения, введя нужную ширину и высоту в настройке изображения. Разработанный лоскут измеряет 3 см х 6 см. Для этого измерения выберите ширину 4,0 см и высоту 7,0 см, чтобы иметь некоторое дополнительное пространство.
- Установите плотность точек как высоко в настройке изображения. Высокие, средние и низкие три варианта.
- При настройке захвата изображений выберите частоту кадров (10 изображений/с) для записи и продолжительности (1 мин) записи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иметь такое же состояние окружающего света в хирургическом кабинете во время работы или выполнения оценок. - Нажмите кнопку Запись, чтобы начать запись. Группа по настройке заменяется группой звукозаписи. Данные сохраняются автоматически. Сделать снимки во время процедуры, чтобы обеспечить дальнейшее сравнение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шкала перфузии может быть изменена, чтобы улучшить визуализацию (Нажмите Инструменты Фильтры и цветовые весы Шкала перфузии Руководство 0 - 150), но измеренные значения перфузии не будут затронуты. До и после записи могут быть созданы различные области, представляющие интерес (ROIs), для измерения перфузии внутри них. Здесь мы оценили только область практикуемого лоскута (3 см х 6 см).
- Используйте программное обеспечение ImageJ для измерения выживаемости и некроза.
- Найдите линейку на стороне лоскута, а затем возьмите контрольные снимки для макроскопических измерений области выживания лоскута.
- Чтобы оценить изображения, откройте пользовательский интерфейс ImageJ. Нажмите файл и откройте изображение для измерения.
- Выберите прямую линию в арсенале и нарисуйте прямую линию на 1 см линейки. Нажмите на Анализ (ru) Установите шкалу и введите в текстовое поле для известного расстояния значение 1 см.
- Нажмите на инструмент выбора полигона и нарисуйте линии полигона над клапаном, чтобы вычислить жизнеспособную область. В конечном счете, нажмите на Анализ (ru) Мера для получения значения области.
- Поместите послеоперационную повязку на животное перед корпусом, чтобы предотвратить членовредить хирургическую область. После процедур животных размещают в клетках по отдельности, в помещении с контролем температуры (от 22 до 25 градусов по Цельсию).
4. Послеоперационная оценка и выборка тканей
- Анестезия крысы в 7 послеоперационных дней для оценки клапана и выборки тканей, следуя тем же шагам, ранее описанным в этом протоколе (шаги 1.2 и 1.3). Проверьте глубину анестезии на отсутствие реакции на щепотку ног.
- Фотография хирургической области, чтобы макроскопические измерения выживаемости лоскута и некроза областях. Сделайте послеоперационные макроскопические измерения после тех же шагов внутриоперационной оценки, которые были объяснены ранее в протоколе (шаг 3.5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание при использовании инструмента выбора полигона, нарисовав линии на лоскуте, разгранижая жизнеспособную область (измеряется в см2). Процент жизнеспособной области может быть рассчитан как (см2 жизнеспособной площади / см2 от общей площади лоскута) 100. - Оцените микроциркуляцию лоскута с использованием метода LASCA (шаг 3.4) для визуализации и количественной оценки различий перфузии
- После макроскопического анализа, удалить 4 / 0 швов и поднять лоскут для переоценки сосудистой педикевой крови с помощью транзитного времени ультразвука.
-
Выполняйте пробы тканей, удобываясь деления лоскута на две части размером 1,5 см х 6 см.
- Погрузите одну часть в контейнер для биопсии с 4% параформальдегидом при комнатной температуре для дальнейшего гистологического анализа.
- Введите другую часть ткани в криоконсервационную трубку, погрузите ее в жидкий азот, а затем криоконсервируйте трубку, храня ее при -80 градусов по Цельсию для будущих молекулярных анализов.
- Эвтаназия крысы под общим ингаляционным наркозом с помощью быстрой внутрисердечной инъекции 2 M KCl/kg в соответствии с рекомендациями комитета по этике.
Representative Results
Сразу же после создания микрохирургических анастомоза мы получили более высокие объемы кровотока, чем минимальные потоки, рекомендованные в литературе8; таким образом, все микрохирургические анастомозы были патент1осхиветолько через неделю после операции(рисунок 1).
Рисунок 1: Оценка ультразвукового кровотока в транзитном времени. (A) Положение микрохирургического зонда потока для того чтобы определить поток крови. (B) Образец кровотока и количественной оценки, полученные из анастомозных сосудов лоскута pedicle. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Наблюдение микроциркуляторного лишения кровотока во время ишемического оскорбления стало возможным с помощью метода LASCA, включая немедленную гиперфузию во время реперфузии лоскута, и, периоперационно, различные области с меньшей перфузией и более высоким риском послеоперационного некроза лоскута, которые действительно были некротизированы через 7 дней после окончания исследования(рисунок 2).
Рисунок 2: Технология лазерного анализа контрастных пятен. ()Визуализация микроциркуляции ткани крови перфузии в физиологическом состоянии. (B) Визуализация микроциркуляционной ткани крови перфузии во время ишемии. (C) Визуализация микроциркуляции ткани перфузии крови сразу после реперфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Зона выживания лоскута после 8 ч ишемии и ее последующего реперфузии составляла около 40%. Ранее опубликованные результаты9 показали статистически значимые различия, когда эта модель была по сравнению с закрылками, где не было нанесено ишемического оскорбления.
Discussion
Микрохирургические бесплатные передачи тканей стали методом выбора для восстановления крупных дефектов. Период ишемии происходит во время таких свободных тканей. Когда этот период превышает толерантность ткани, I / R травмы могут привести к отказу практикуется свободный лоскут9. Описание методологии разработки экономически эффективной и трансляционной доклинической модели для изучения травмы I/R в реконструктивной микрохирургии может помочь привести к изучению различных соединений для противодействия этому патофизиологическому процессу.
В описанной модели животных, после сосудистых лигатур были помещены и свободный лоскут был поднят, не задние компромиссы кровотока были отмечены, ни боль или вялый. Как описано В Кочи и др.10, наша модель также оставила три сопутствующих маршрута через внутримышечные сети.
Мониторинг свободных закрылков имеет большое значение11, как спасти обратно связано с продолжительностью между ишемией начала и его клинического признания. Для этого следует изучать свободные закрылки внутри и послеоперационно.
Intraoperatively, широко используемый пустой и пополнение тест или акустический Доплера позволяют идентификации, но не количественноприсутствия присутствия потока или отсутствия через анастомоз12. По этой причине мы использовали технологию ультразвука транзитного времени, новый метод, который позволяет хирургам количественно анализировать кровоток микрохирургических анастомозов13. В нашем исследовании, все микрохирургические анастомы были патентпослены после 8 ч ишемического оскорбления, а также в конце исследования. Сразу же после создания микрохирургических анастомозов мы отметили более высокие объемы кровотока, чем минимумы, рекомендованные в литературе8. Это предсказало хорошую перфузию pedicle в конце изучения, демонстрируя что результаты не были повлияно на микрохирургическим методом а довольно каскадом ушиба I/R случаев. Однако этот метод не свободен от ограничений. Для получения надежных результатов микрохирургические зонды должны быть нейтральными по отношению к плоскости сосуда, не потянув его или создавая какое-либо напряжение. Для получения правильного сигнала, который может быть получен с помощью ультразвукового геля или солевого раствора, необходима хорошая акустическая связь. Качественный сигнал соединения, предоставляемый оборудованием, является важным параметром для рассмотрения во время измерений.
Мы использовали LASCA, также известный как лазерное пятнистого контрастного изображения или лазерное изображение пятнышко, послеоперационно14. Эта технология представляет собой ценный метод для полуколичественного картирования потока в реальном времени в пределах свободных закрылков, как это проверено здесь. Одно из ограничений заключается в том, что результаты предоставляются в произвольных единицах и не имеют прямого отношения к фактическим значениям потока. В этом смысле необходимы дальнейшие исследования для подтверждения этой корреляции. Лазерная доплеровская течетеми более часто используется, но ограничивается тем, что она измеряет только перфузию в одной точке в лоскуте, в то время как LASCA позволяет обнаруживать региональные изменения в перфузии кожи в лоскут15. Кроме того, недавнее исследование16 показало, что LASCA может перители предсказывать регионы с высоким риском послеоперационного некроза лоскута. Наши результаты показывают, что LASCA является перспективным методом для пери- и послеоперационного мониторинга свободных закрылков.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Научно-исследовательский проект был выполнен в Центре минимальноинвазивной хирургии Хесуса Усона (CCMIJU), врамкахном с ИКТС Нанбиоза. Исследование проводилось при содействии следующих блоков Нанбиоза: U21, экспериментальной операционной; U22, жилье для животных; и U14, клеточная терапия. Эта работа была поддержана проектом ISCIII PI16/02164. Фонд не принимал никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописей. Особая благодарность предоставляется Марии Перес за подготовку фигур и Фернанда Карризоса за постоянное поощрение и поддержку научной библиографии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AureFlo Unit | Transonic (Ithaca, USA) | N/A | Transit-time ultrasound flowmeter equipment |
| Commbined Basic Hand- and Reconstructive Surgery Set (round handle) | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | RHR-SET. Art.No.00795 | Set of microsurgical instruments |
| FLOW-i | Maquet Critical Care AB (Solna, Sweeden) | N/A | Anesthesia Delivery System |
| Micro clamps ABB-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00408V | Double microvascular clamp with frame |
| Micro clamps ABB-11 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00414V | Double microvascular clamp without frame |
| Micro clamps B-1 | S&T AG (Neuhausen, Switzerland) | 00396V | Sigle microvascular clamp |
| Nylon suture 10/0 | Laboratorio Aragó (Barcelona, Spain) | 19921 | Microsurgical suture |
| OPMI Pentero 800 | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | N/A | Surgical microscope |
| PeriCam PSI System | Perimed AB (Järfälla, Sweden) | N/A | Laser speckle contrast analysis equipment |
| Philips Intellivue MX450 | Philips Medizin Systeme (Böblingen, Germany) | N/A | Monitoring system |
| Protector posoperatorio para roedores | Fundación Centro de Cirugía de Mínima Invasión Jesús Usón (Cáceres, Spain) | P201400272 | Postoperative protector for rodents |
References
- Siemionow, M., Arslan, E. Ischemia/reperfusion injury: a review in relation to free tissue transfers. Microsurgery. 24 (6), 468-475 (2004).
- Wang, W. Z., Baynosa, R. C., Zamboni, W. A. Update on ischemia-reperfusion injury for the plastic surgeon: 2011. Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (6), 685-692 (2011).
- Chen, K. T., et al. Timing of presentation of the first signs of vascular compromise dictates the salvage outcome of free flap transfers. Plastic and Reconstructive Surgery. 120 (1), 187-195 (2007).
- Sears, E. D., Chung, K. C. Replantation of finger avulsion injuries: a systematic review of survival and functional outcomes. The Journal of Hand Surgery. 36 (4), 686-694 (2011).
- Caterson, E. J., Lopez, J., Medina, M., Pomahac, B., Tullius, S. G. Ischemia-reperfusion injury in vascularized composite allotransplantation. The Journal of Craniofacial Surgery. 24 (1), 51-56 (2013).
- Amin, K. R., Wong, J. K. F., Fildes, J. E. Strategies to Reduce Ischemia Reperfusion Injury in Vascularized Composite Allotransplantation of the Limb. The Journal of Hand Surgery. 42 (12), 1019-1024 (2017).
- Barre-Sinoussi, F., Montagutelli, X. Animal models are essential to biological research: issues and perspectives. Future Science OA. 1 (4), (2015).
- Shaughness, G., Blackburn, C., Ballestin, A., Akelina, Y., Ascherman, J. A. Predicting Thrombosis Formation in 1-mm-Diameter Arterial Anastomoses with Transit-Time Ultrasound Technology. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (6), 1400-1405 (2017).
- Ballestin, A., et al. Ischemia-reperfusion injury in a rat microvascular skin free flap model: A histological, genetic, and blood flow study. PloS One. 13 (12), 0209624 (2018).
- Kochi, T., et al. Characterization of the Arterial Anatomy of the Murine Hindlimb: Functional Role in the Design and Understanding of Ischemia Models. PloS One. 8 (12), (2013).
- Smit, J. M., Zeebregts, C. J., Acosta, R., Werker, P. M. Advancements in free flap monitoring in the last decade: a critical review. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (1), 177-185 (2010).
- Krag, C., Holck, S. The value of the patency test in microvascular anastomosis: Correlation between observed patency and size of intraluminal thrombus: An experimental study in rats. British Journal of Plastic Surgery. 34, 64-66 (1981).
- Selber, J. C., et al. A prospective study of transit-time flow volume measurement for intraoperative evaluation and optimization of free flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (2), 270-281 (2013).
- Briers, D., et al. Laser speckle contrast imaging: theoretical and practical limitations. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066018 (2013).
- Zotterman, J., Bergkvist, M., Iredahl, F., Tesselaar, E., Farnebo, S. Monitoring of partial and full venous outflow obstruction in a porcine flap model using laser speckle contrast imaging. Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 69 (7), 936-943 (2016).
- Zotterman, J., Tesselaar, E., Farnebo, S. The use of laser speckle contrast imaging to predict flap necrosis: An experimental study in a porcine flap model. Journal of Plastic, Recontructive and Aesthetic Surgery. 72 (5), 771-777 (2019).
