Мы описываем протокол для клеточного типа специфического выражения генетически закодированного датчика ATeam1.03YEMK на органотипических срезах культур передних мозгов мыши. Кроме того, мы показываем, как использовать этот датчик для динамической визуализации клеточных уровней АТФ в нейронах и астроцитах.
Нейронная активность в центральной нервной системе (ЦНС) вызывает высокий спрос на клеточную энергию, обеспечиваемую распадом аденозинтрифосфата (АТФ). Значительная доля АТФ необходима для переустановки ионных градиентов по плазменным мембранам, деградированным электрической сигнализацией нейронов. Существует доказательство того, что астроциты – хотя и не генерации быстрых электрических сигналов сами – проходят увеличение производства АТФ в ответ на активность нейронов и поддержки активных нейронов, обеспечивая метаболиты энергии к ним. Недавнее развитие генетически закодированных датчиков для различных метаболитов теперь позволяет изучать такие метаболические взаимодействия между нейронами и астроцитами. Здесь мы описываем протокол для клеточного типа специфического выражения ATP-чувствительной флуоресценции Резонансная энергия Передачи – (FRET-) датчик ATeam1.03YEMK в орханнотипической ткани ломтик культур мыши гиппокампа и коры головного мозга с использованием адено-связанных вирусных векторов (AAV). Кроме того, мы демонстрируем, как этот датчик может быть использован для динамического измерения изменений в уровнях клеточного АТФ в нейронах и астроцитах при увеличении внеклеточного калия и после индукции химической ишемии (т.е. ингибирования клеточного энергетического метаболизма).
Возбуждая электрическую активность нейронов в значительной степени основана на потоке катионов, таких как натрий (Na)и калий (K)через их плазменные мембраны. Таким образом, для сигнализации требуется поддержание электрохимических градиентов этих двух ионов. Это достигается с помощью клеточного Na/K-ATPase (NKA), повсеместно выраженного электрогенного трансмембранного насоса, который выдавливает 3 Naиз клетки в обмен на 2 Kq из внеклеточного пространства, требующего потребления одной молекулы АТФ на транспортный цикл1. В дополнение к NKA, Есть несколько других АТС-потребителей ионных транспортеров, включая плазменную мембрану Ca 2 “ATPase, которая имеет жизненно важное значение для внутриклеточного Ca2″ гомеостаз и его экспорт после деятельности индуцированного притока2. В пресинаптических пузырьках, вакуолярного типа H-ATPase(v-ATPase) создает градиент протона, необходимый для поглощения нейромедиатора в этом отсеке3.
Хотя активность нейронов, таким образом, требует значительного количества АТФ4, они не обладают значительной емкостью для хранения энергии. Вместо этого, они, кажется, полагаются на метаболические взаимодействия с соседними астроцитами, основными магазинами гликогена в мозге5. Было высказано предположение, что астроцитарный гликоген действительно играет важную роль в поддержке нейрональных потребностей энергии; и ключевым явлением в этой предлагаемой нейро-метаболических связей между двумя типами клеток является способность астроцитов увеличить их производство АТФ в ответ на нейронную активность6,7,8. Эта гипотеза, известная как астроцит-нейрон лактат ный шаттл (ANLS), все еще обсуждается, потому что другие работы предоставили доказательства того, что нейроны могут также увеличить свою собственную скорость гликолиза в ответ на стимуляцию9,10, отражая необходимость дальнейших методов и подходов к изучению взаимодействия нейро-глии.
Исследование клеточного энергетического метаболизма и уровней АТФ в нейронах и астроцитах для выяснения нейро-глиаметационных взаимодействий уже давно препятствует отсутствием подходящих зондов для обнаружения изменений концентрации метаболитов в живых клетках в тканях мозга. Последнее десятилетие, однако, обеспечило всплеск в разработке новых инструментов и новых генетически закодированных флуоресцентных зондов для различных метаболитов, в том числе датчики для АТФ, лактата, пирувата и других11,12. Используя эти инструменты, теперь можно непосредственно решать вопросы, связанные с потреблением клеточного АТФ и изменения в уровнях клеточной энергии на уровне одной клетки и в клеточном типе специфическим образом в нетронутой ткани мозга13.
В настоящей работе мы описываем процедуру визуализации цитозической динамики АТФ на нейронах и астроцитах культивированных органотипических срезов мозга. Мы показываем, как использовать адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV) для клеточного типа специфического выражения генетически закодированного ATP-nanosensor ATeam1.03YEMK (14) в нейронах и астроцитах ломтиков мозга мыши, которые могут поддерживаться в клеточной культуре в течение нескольких недель15. Описана процедура удаления глиального шрама, который покрывает культивированные кусочки ткани, что улучшает оптическую доступность и визуализацию клеток в слоях органотипической ткани под ним. Наконец, мы покажем, как ATeam1.03YEMK может быть использован для выполнения FRET на основе изображений изменений в сотовых уровнях АТФ в этом препарате. Этот метод содержит основные преимущества, которые он не требует хирургических процедур мозга, обеспечивает высокий уровень экспрессии датчика и клеточного типа специфичности в культивированных ломтиках мозга, снижение инвазивности или стресса в клетках по сравнению с другими методами, как трансфекция путем электропорации или трансдукции с другими вирусными векторами10,16,17. Кроме того, этот протокол может быть применен к другим наносенсорам на основе FRET, среди которых варианты ATeam1.03, которые обеспечивают более низкую связывающую близость к ATP14.
Здесь мы демонстрируем процедуру для клеточного типа специфического выражения ATeam1.03YEMK, FRET-основанный, genetically закодированный nanosensor14,для измерения изменений в уровнях ATP в астроцитах или неветрах в organotypic культурах ломтика ткани мозга мыши15. В примерных записях мы показываем, что увеличение концентрации внеклеточного калия не приводит к изменению концентраций АТФ в нейронах, в то время как астроцитарные уровни АТФ повышаются в ответ на эту манипуляцию. Более того, наши результаты показывают, что при ингибировании клеточного метаболизма, соотношение ATeam1.03YEMK FRET быстро падает в обоих типах клеток, что свидетельствует о быстром снижении внутриклеточного АТФ.
Выражение ATeam1.03YEMK в органотипических срезах культур требует поддержания тканей в культуре в контролируемых условиях не менее 7-10 дней. Кроме того, ATeam1.03YEMK также может быть использован для измерения АТФ в остро изолированных ломтиков ткани мозга и в зрительных нервах мышей13,15. Измерения в остро изолированных тканях, однако, требуют генерации трансгенных животных или стереотактического применения вирусных переносчиков в мозг, включая эксперименты с животными и строгие протоколы по уходу за животными. В этой связи выражение ATeam1.03YEMK в органотипических культурах среза тканей представляет собой полезную и ценную альтернативу22,23. На протяжении многих лет, органотипические культуры среза ткани служат установленной модельной системой для изучения нервных свойств, подключения и развития24,25,26. Они не только поддерживают общую архитектуру тканей и ламинирование(рисунок 1),но и размещают преференциальные свойства клеточных культур, таких как превосходная доступность и прямой контроль экспериментальных условий. Органотипические культуры среза тканей также регулярно используются для выражения чужих генов с помощью вирусных векторов27. Несколько типов вирусных векторов, как сообщается, доставить трансгены в ткани мозга16,28. Аденовирусные векторы вызывают высокую экспрессию в глиальных клетках, но не гиппокампа нейронов16, и может генерировать глиальной реактивности17. Адено-ассоциированных вирусных векторов, используемых здесь появляются в качестве хорошей альтернативы15, и их эффективность также была показана в vivo29.
Хотя в основном используется для изучения нейронных свойств, последние исследования установили, что органотипические культуры кусок ткани также могут быть использованы для анализа астроцитов. Культурные ломтики, как правило, покрыты слоем реактивных астроцитов19,30 (Рисунок 5), но астроциты обладают более родной, нереактивной морфологии и цитоархитектуры в более глубоких слоях19,30 (Рисунок 5). В настоящем исследовании мы описываем процедуру механического удаления внешнего глиального шрама, что приводит к лучшей экспериментальной и оптической доступности родных астроцитов в надлежащих органотипических слоях ткани. Кроме того, его удаление повышает эффективность выражения в более глубоких слоях органотипических ломтиков; если глиальный шрам не удаляется, трансдукция AAVs может, как правило, ограничивается поверхностными слоями клеток.
При проведении экспериментов на фрагментах тканей необходимо учитывать несколько внешних механических факторов. Изменение скорости перфузии ванны может вызвать движения всего препарата и/или вызвать изменения в фокусе, что приводит к искусственным переходным изменениям сигнала датчика. Кроме того, как астроциты и нейроны, как сообщается, реагировать на механические деформации, такие как введенные высокой скоростью перфузии32,33. В наших руках, используя надежный перистальтический насос, вместе с поддержанием небольших и стабильных объемов сольника между тканью и объективным (мениска) приводит к стабильному FRET-сигналу в базовых условиях при используемой здесь скорости перфузии (1,5-2,5 мл/мин) Рисунок 8).
В настоящем исследовании мы также демонстрируем, что изображения на основе ФРЕТ с ATeam1.03YEMK могут быть использованы для мониторинга уровней АТФ в нейронах и астроцитах. Альтернативным средством, введенным ранее для измерения клеточного АТФ, является так называемый люциферин-люцифераза, ассссы34,35,36,37. Этот подход, однако, основан на визуализации биолюминесценции и обеспечивает лишь довольно низкое временное и пространственное разрешение отчасти из-за высокого уровня фонового шума. Другой метод обычно используется в последние годы была визуализация изменений в концентрации внутриклеточного магния с использованием ионночувствительного фторофора магния зеленый38,39,40. Такой подход связан с наблюдением, что потребление АТС приводит к высвобождению его кофакторного магния. Изображение с магнием зеленый таким образом только обеспечивает вторичную оценку изменений в уровнях АТС. Кроме того, магний зеленый также чувствителен к изменениям внутриклеточного кальция, вводя еще одну трудность при интерпретации результатов, полученных с помощью этого метода.
Недавнее развитие генетически закодированных наносенсоров для прямого изображения клеточных метаболитов, таким образом, представляет собой большой шаг вперед11,12. Было создано несколько различных датчиков, которые могут быть использованы для измерения внутриклеточного АТБ36,41,42,43. Среди них коэффициентеметрический флуоресцентный индикатор АТФ “КУЭН”41, а также PercevalHR, который чувствует соотношение ATP:ADP42. Хотя последний зонд является ценным инструментом для изучения энергетического статуса клеток, он требует одновременного измерения изменений в рН42.
ATeam является наносенсор, из которых существует несколько вариантов, которые – среди прочего – отличаются по своей связывающей сродство к ATP14. In vitro, ATeam1.03YEMK экспонаты Kd 1,2 мМ при 37 градусах Цельсия, который близок к клеточным уровням АТФ определяется в различных типах нейрональных клеток, начиная от гипоталамуса и мозжечка34 до гиппокампа37,44,45. В измерениях cuvette, снижение температуры на 10 градусов по Цельсию привело к значительному снижению связывающей сродства ATeam1.03YEMK к АТФ, предполагая, что это не может быть идеальным для клеточной визуализации при комнатной температуре14. Наше предыдущее исследование15, однако, показали, что поведение и реакция ATeam1.03YEMK, выраженных в нейронах и астроцитах на различные манипуляции, аналогична при почти физиологической и комнатной температуре, указывая, что датчик позволяет надежно определить внутриклеточные уровни АТФ в обоих условиях. Кроме того, наши предыдущие эксперименты касались рН-чувствительности ATeam1.03YEMK, выраженной внутри клеток15, показывая, что он нечувствительн к изменениям внутриклеточного рН примерно на 0,1-0,2 рН единиц. Если Kd в диапазоне низких мМ вызывает озабоченность, альтернативные варианты ATeam могут быть использованы14, среди них красно-сдвинутые варианты ATeam (“GO-ATeam”)43.
Наши эксперименты с использованием ATeam1.03YEMK показывают, что увеличение концентрации внеклеточного калия только на несколько мМ (от 3 до 8 мм) приводит к переходному увеличению соотношения ATeam1.03YEMK в астроцитах в органотипической культуре среза. Это наблюдение подтверждает более ранние исследования15,46 и ясно указывает на то, что астроциты реагировать на освобождение калия активными нейронами с увеличением их производства АТФ, в основном, вероятно, как следствие стимуляцииNaq /K-ATPaseи Naq/HCO3– cotransporter, соответственно47,48. В отличие от этого, нейроны не показали ответ, который в соответствии с предыдущей работой, а15. Оба типа клеток, однако, быстро и сильно реагировали на ингибирование клеточного гликолиза и митохондриального дыхания, как показано до15. В условиях химической ишемии коэффициенты ATeam FRET упали до нового стабильного уровня, что свидетельствует о номинальном истощении клеточного АТФ. Последний результат свидетельствует о том, что как нейроны, а также астроциты обладают соответствующим потреблением АТФ также при стабильном состоянии условиях без дополнительной стимуляции синаптической активации или применения нейротрансмиттеров. В совокупности мы пришли к выводу, что фрет-изображение с генетически закодированными наносенсорами, среди которых ATeam1.03YEMK, обеспечит ценный подход к разъяснению клеточных процессов, которые отвечают за изменения внутриклеточного уровня АТФ и потребления клеточного АТФ в различных условиях.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Клаудию Родериго и Симону Дюрри за квалифицированную техническую помощь. Мы благодарим д-ра Никласа Дж. Геркау и M.Sc Джоэла Нельсона за помощь в подготовке орханотипических культур. Исследования в авторской лаборатории финансировались Немецкой исследовательской ассоциацией (DFG; ДЛЯ 2795: Ro 2327/13-1 и SPP 1757: Ro 2327/8-2 к CRR; и SPP 1757: Молодая Глия Start-Up финансирования RL).
2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
Microscope stage | custom build | ||
Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |