אנו מתארים פרוטוקול עבור ביטוי מסוים בסוג תא של החיישן מקודד גנטית המבוסס על החיישנים ATeam 1.03ימק בתרבויות הפרוסות של העכבר הקדמי. יתר על כן, אנו מראים כיצד להשתמש בחיישן זה עבור הדמיה דינמית של רמות ATP סלולריים בנוירונים ו astrocytes.
פעילות עצבית במערכת העצבים המרכזית (CN) מעוררת ביקוש גבוה לאנרגיה תאית המסופקת על-ידי פירוק של אדנוזין טריפוספט (ATP). נתח גדול של ATP צריך להתקין מחדש מעברי יונים על פני קרום פלזמה מושפל על ידי איתות חשמלי של נוירונים. יש הוכחות כי אסטרוציטים-בעוד לא לייצר אותות חשמליים מהירה עצמם-לעבור ייצור מוגבר של ATP בתגובה לפעילות עצבית ותמיכה נוירונים פעילים על ידי מתן אנרגיה מטבוליטים להם. ההתפתחות האחרונה של חיישנים מקודד גנטית עבור מטבוליטים שונים כעת מאפשר את המחקר של אינטראקציות מטבולית כגון בין נוירונים ו astrocytes. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור ביטוי ספציפי לסוג תא של העברת האנרגיה הפלואורסצנטית הרגיש של ATP-(סריג-) חיישן ATeam 1.03ימק בתרבויות הפרוסות של רקמת העכבר של ההיפוקמפוס והקליפה באמצעות וקטורים הקשורים adeno ויראלי (aav). יתר על כן, אנו מדגימים כיצד חיישן זה יכול להיות מועסק עבור מדידה דינמית של שינויים ברמות ה-ATP הסלולר בנוירונים ו אסטרוציטים על עליות בתוך מסחטות אשלגן ובעקבות אינדוקציה של איסכמיה כימית (כלומר, עיכוב של מטבוליזם האנרגיה התאית).
פעילות החשמל ההתרגשות של הנוירונים מבוססת בעיקר על שטף של הקטיונים כגון נתרן (Na+) ו אשלגן (K+) על פני קרום הפלזמה שלהם. כך נדרש לצורך איתות בתחזוקת מעברי הצבע האלקטרוכימי של שני יונים אלה. הדבר מבוצע על ידי Na הסלולר+/K+-ATPASE (nka), משאבת באופן אוביגניים הביע האלקטרו-ממברנות, אשר הבלטת משטח של 3 Na+ מתוך התא בתמורה עבור 2 K+ ממרחב החילוץ, המחייב צריכת מולקולה אחת של ATP לכל מחזור הובלה1. בנוסף ל-NKA, ישנם מספר מובילי היונים האחרים של ה-ATP הכוללים את קרום הפלזמה Ca2 +-atpase, שהוא חיוני עבור ca תאיים2 + הומאוסטזיס והיצוא שלה לאחר פעילות המושרה זרם2. ב שלפוחיות סינפטית מראש, מסוג H+-atpase (v-atpase) יוצר מעבר הצבע הפרוטונים הדרוש לספיגת נוירוטרנסמיטור לתוך תא זה3.
בעוד הפעילות של הנוירונים ובכך דורש כמות משמעותית של ATP4, הם אינם מהווים יכולת משמעותית לאחסון של אנרגיה. במקום, נראה שהם סומכים על אינטראקציות מטבולית עם אסטרוציטים השכנה, חנויות הגליקוגן הגדולות במוח5. יש כבר הציע כי הגליקוגן astrocytic אכן ממלא תפקיד חשוב בתמיכה האנרגיה העצבית צרכים; ותופעה מרכזית בתוספת זו מסוג נוירו-מטבולית המוצעת בין שני סוגי התא היא הקיבולת של אסטרוציטים להגדיל את ייצור ה-ATP שלהם בתגובה לפעילות עצבית6,7,8. השערה זו, המכונה astrocyte המעבורת לקטט (anls), הוא עדיין בדיון, כי עבודה אחרת סיפקה ראיות כי הנוירונים עשויים גם להגדיל את שיעור שלהם של גליקוליזיס בתגובה גירוי9,10, המשקף את הצורך של שיטות נוספות גישות ללמוד אינטראקציה נוירו-גליה.
החקירה של מטבוליזם האנרגיה התאית ורמות ATP בנוירונים ו אסטרוציטים כדי להבהיר את האינטראקציות נוירו-glia מטבולית כבר הושפע זמן רב על ידי חוסר בדיקות מתאימות לאיתור שינויים ריכוזי מטבוליזם בתאי החיים ברקמת המוח. העשור האחרון, עם זאת, סיפקה גל בפיתוח של כלים חדשים ובדיקה חדשה גנטית מקודד גנטי עבור מטבוליטים שונים, כולל חיישנים ל-ATP, לקטט, פירובט ואחרים11,12. באמצעות כלים אלה, ניתן כעת לטפל ישירות בשאלות הקשורות לצריכת ה-ATP הסלולרית ולשינויים ברמות האנרגיה התאית ברמת התא היחיד ובאופן ספציפי לסוג תא ברקמת מוח שלמה13.
בעבודה הנוכחית, אנו מתארים הליך להמחיש מסוג ATP הדינמיקה המוחית על נוירונים ו אסטרוציטים של פרוסות המוח אורגאוטימית תרבותית. אנו מראים כיצד להעסיק adeno-הקשורים וקטורים ויראליים (aav) עבור תא סוג ביטוי ספציפי של ATP מקודד גנטית-nanosensor ateam 1.03ימק (14) בנוירונים ו אסטרוציטים של פרוסות של מוח העכבר שניתן לשמור בתרבות התא במשך מספר שבועות15. הליך של איך להסיר את הצלקת גליה המכסה פרוסות רקמה תרבותית מתוארת, אשר משפר את הנגישות האופטית והדמיה של תאים בשכבות רקמה אורגנותמית מתחת. לבסוף, אנו מראים כיצד ATeam 1.03ימק ניתן להשתמש כדי לבצע הדמיה מבוססת-סריג של שינויים ברמות ה-ATP הסלולאריים בהכנה זו. שיטה זו מארחת את היתרונות העיקריים שהוא אינו דורש הליכים מוחית כירורגית, מספק רמות גבוהות של ביטוי של חיישן וסוג התא ספציפיות בפרוסות המוח התרבותי, הפחתת החלטיות או מתח בתאים לעומת שיטות אחרות, כמו העברה על ידי אלקטרופורציה או התמרה עם וקטורים נגיפי אחרים10,16,17. בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להחיל על אחרים מבוסס הננו חיישנים, ביניהם גרסאות של ATeam 1.03 המספקים זיקה מחייבת נמוכה יותר עבור ATP14.
כאן, אנו להדגים הליך עבור הביטוי הספציפי התא של ATeam 1.03ימק, מבוסס על מבוססי מגנטית, ננוחיישן מקודד גנטי14, עבור מדידה של שינויים ברמות ATP ב אסטרוציטים או נוירונים בתרבויות הפרוסה של רקמת העכבר של המוח העכברים15. בהקלטות למופת, אנו מראים כי עלייה בריכוז אשלגן מתוך החילוץ אינו גורם לשינוי ריכוזי ATP בנוירונים, בעוד רמות ATP astrocytic לעלות בתגובה למניפולציה זו. יתר על כן, התוצאות שלנו להפגין כי על עיכוב של מטבוליזם הסלולר, ATeam 1.03ימק היחס הנכון טיפות במהירות בשני סוגי התא, המציין ירידה מהירה ב-ATP תאיים.
ביטוי של ATeam 1.03ימק בתרבויות הפרוסה האורגאולית מחייב תחזוקה של הרקמה בתרבות תחת תנאים מבוקרים לפחות 7-10 ימים. לחילופין, ateam 1.03ימק יכול גם להיות מועסק עבור מדידה של ATP ב מבודד ביותר פרוסות רקמת המוח בעצבים אופטיים של עכברים13,15. עם זאת, מדידות ברקמה מבודדת בחריפות, מצריכות את הדור של בעלי חיים טרנסגניים או יישום סטריאוטקטיקה של וקטורים ויראליים למוח, הכוללים ניסויים בבעלי חיים ופרוטוקולי טיפול קפדניים בבעלי חיים. בהקשר זה, הביטוי ateam 1.03ימק בתרבויות הפרוסות של רקמות הרקמה האורגאולית מייצג חלופה שימושית ובעלת ערך22,23. במשך שנים רבות, תרבויות אורגאוטימית של רקמה משמשות כמערכת מודל מבוססת לחקר תכונות עצביות, קישוריות ופיתוח24,25,26. הם לא רק לשמור על ארכיטקטורת רקמות כלליות למינציה (איור 1), אלא גם לארח את התכונות העליונות של תרביות תאים כגון נגישות מעולה ושליטה ישירה של התנאים הניסיוניים. הרקמות הפרוסות של הרקמה האורגנותית גם הן מועסקים באופן שגרתי כדי לבטא גנים זרים באמצעות וקטורים ויראליות27. מספר סוגים של וקטורים ויראליות דווחו לספק טרנסגנים לרקמת מוח16,28. וקטורים אדנונגיליים לגרום ביטוי גבוה בתאי גליה, אבל לא היפוקמאל נוירונים16, ועשוי ליצור תגובתיות פעילות מחודשת17. Adeno-וקטורים ויראליות הקשורים כפי שנעשה בשימוש כאן להגיח כחלופה טובה15, ואת האפקטיביות שלהם הוצגה גם ב vivo29.
בעוד בעיקר בשימוש למחקר של תכונות עצבי, מחקרים שנעשו לאחרונה הקימו כי הרקמות האורגאואליות הרקמה פרוסה יכול גם להיות מועסק לניתוח של אסטרוציטים. פרוסות מתרבות מכוסים בדרך כלל על ידי שכבה של אסטרוציטים התגובתית19,30 (איור 5), אבל אסטרוציטים מוצג יליד יותר, מורפולוגיה לא תגובתי ו ציטואדריכלות בשכבות עמוקות יותר19,30 (איור 5). במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליך ההסרה המכנית של הצלקת גליה החיצוני, אשר מביא לנגישות ניסיוני ואופטי טוב יותר של האסטרוציטים יליד בתוך שכבות רקמות אורגאוטימית נכונה. כמו-כן, הסרתו משפרת את יעילות הביטוי ברבדים עמוקים יותר של הפרוסות האורגאואיות; אם הצלקת גליה לא יוסר, התמרה על ידי aavs עשוי להיות מוגבל לשכבות התא השטחית.
מספר גורמים מכניים חיצוניים צריכים להיחשב בעת ביצוע ניסויים בפרוסות רקמה. וריאציה על מהירות זלוף אמבטיה יכול לגרום לתנועות של ההכנה כולה ו/או לגרום לשינויים בפוקוס, וכתוצאה מכך שינויים ארעי מלאכותי של אות החיישן. יתר על כן, הן אסטרוציטים ונוירונים דווחו להגיב לדפורמציה מכני כגון מוטלות על ידי שיעורי זלוף גבוה32,33. בידינו, באמצעות המשאבה הפריסטלטית אמין, יחד עם שמירה על כמויות קטנות ויציבות של תמיסת מלח בין הרקמה לבין המטרה (meniscus) התוצאות לשמור יציבה האות תחת תנאים בסיסיים במהירות זלוף בשימוש כאן (1.5-2.5 mL/min; איור 8).
במחקר הנוכחי, אנו גם להדגים כי מבוסס על הדמיה עם ATeam 1.03ימק יכול להיות מועסק כדי לפקח על רמות ATP בנוירונים ו astrocytes. אמצעי חלופי הציג מוקדם יותר עבור מדידה של ATP הסלולר הוא כביכול לluciferin-לוציפראז שיטת34,35,36,37. גישה זו, עם זאת, מבוססת על הדמיה של biלומינסנציה, רק מספק הזמן נמוך למדי רזולוציה מרחבית חלקית בשל רמות רעש ברקע גבוה. שיטה נוספת המועסקים באופן שגרתי בשנים האחרונות היה הדמיה של שינויים בריכוז מגנזיום תאיים באמצעות מגנזיום fluorophoreה38הרגיש של היונים ירוק,39,40. גישה זו מתייחסת להתבוננות שצריכה של ATP גורמת לשחרורו של מגנזיום שיתוף הגורמים. הדמיה עם ירוק מגנזיום ובכך רק מספק הערכה משנית של שינויים ברמות ATP. יתר על כן, ירוק מגנזיום רגיש גם לשינויים בסידן תאיים, החדרת קושי אחר בעת פענוח תוצאות שהתקבלו עם שיטה זו.
הפיתוח האחרון של ננו חיישנים מקודד גנטית עבור הדמיה ישירה של מטבוליטים סלולריים, ולכן, ייצג צעד גדול קדימה11,12. חיישנים שונים מספר נוצרו כי יכול להיות מועסק עבור מדידה של ATP תאיים36,41,42,43. בין היתר, מחוון ה-ATP האומטרי (“QUEEN”)41 , כמו גם הפרסיבל, החושי ה-atp: יחס ADP42. בעוד בדיקה האחרון הוא כלי רב ערך לחקר מעמד האנרגיה של תאים, זה דורש מדידה בו של שינויים ב-pH42.
ATeam הוא ננו חיישן שבו קיימים מספר משתנים, אשר-בין היתר-שונים בזיקה המחייב שלהם ל-ATP14. בתוך מבחנה, ATeam 1.03ימק מציג Kd של 1.2 מ”מ ב 37 ° c, אשר קרוב לרמות ATP סלולריים שנקבעו סוגים שונים של תאים עצביים, החל ההיפותלמוס ואת המוח המאלף34 להיפוקמפוס37,44,45. במדידות קובט, הפחתת הטמפרטורה ב-10 ° c הביאה לירידה משמעותית בזיקה המחייב של ATeam 1.03ימק ל-ATP, ומרמזת כי ייתכן שהיא אינה אידיאלית לדימות סלולרי בטמפרטורת החדר14. המחקר הקודם שלנו15, עם זאת, הפגינו כי ההתנהגות והתגובה של ateam 1.03ימק הביע בנוירונים ו אסטרוציטים למניפולציות שונות דומה באופן פיזיולוגי בטמפרטורת החדר, המציין כי החיישן מאפשר קביעה אמינה של רמות ה-ATP תאיים בשני התנאים. בנוסף, הניסויים הקודמים שלנו התייחס ל-pH רגישות של ATeam 1.03ימק בתוך תאים15, מראה כי זה לא רגיש לשינויים ב-ph תאיים על ידי כ 0.1-0.2 יחידות pH. אם ה-K d בטווח הנמוך מ”מ הוא דאגה, משתני ateam חלופיים עשויים לשמש14, ביניהם אדום העביר גרסאות של ATEAM (” GO-ateam “)43.
הניסויים שלנו באמצעות ateam 1.03ימק להדגים כי עלייה בריכוז היכולת המומנת של אשלגן על ידי כמה מ”מ בלבד (מ 3 עד 8 מ”מ) תוצאות עלייה ארעית ביחס ateam 1.03ימק ב אסטרוציטים בתרבות פרוסה של אורגנוסטימית. התבוננות זו מאשרת מחקרים מוקדמים יותר15,46 וברור מציין כי אסטרוציטים להגיב לשחרור של אשלגן על ידי הנוירונים פעילים עם עלייה בייצור ה-ATP שלהם, סביר להניח כתוצאה של גירוי של na+/k+-atpase ו Na+/hco3– coטרנספורטר, בהתאמה47,48. בניגוד לזה, נוירונים לא הראו תגובה, אשר בקנה אחד עם עבודה קודמת כמו גם15. שני התאים, עם זאת, במהירות ובחוזקה הגיבו לעיכוב של גליקוליזה הסלולר ונשימה מיטוכונדריאלי כפי שמוצג לפני15. בתנאים של איסכמיה כימית, יחסי ATeam היחס נפל לרמה יציבה חדשה, המציינת דלדול נומינלי של ATP הסלולר. התוצאה האחרונה עולה כי הן הנוירונים כמו גם אסטרוציטים התערוכה צריכה רלוונטית של ATP גם בתנאים יציבים ללא גירוי נוסף על ידי הפעלה סינפטית או יישום של נוירוטרנסמיטורים. יחד, אנו מסיקים כי הדמיה מבוססת על-ידי מבוסס-על-ידי שיטה מקודדת מבחינה גנטית, ביניהם ATeam 1.03ימק, תספק גישה בעלת ערך רב להסבר התהליכים הסלולריים האחראים לשינויים ברמות ה-atp התאיים ובצריכת ה-atp הסלולרית בתנאים שונים.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות לקלאודיה רודריגו וסימון דוררי לסיוע טכני מומחה. אנו מודים לד ר ניקלאס ג’ גרקאו ולM.Sc יואל נלסון לסיוע בהכנת תרביות הפרוסה האורגאולית. מחקר במעבדה של המחבר מומן על ידי האגודה הגרמנית למחקר (DFG; עבור 2795: Ro 2327/13-1 ו SPP 1757: Ro 2327/8-2 ל-CRR; ו-SPP 1757: מימון הסטארט-Up הצעיר של גליה ל RL).
2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
Microscope stage | custom build | ||
Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |