نحن وصف بروتوكول للتعبير عن نوع الخلية محدده من المستشعر القائم علي التاكل المرمزة وراثيا ATeam 1.03يمك في الثقافات شريحة النمط العضوي من الدماغ الامامي الماوس. علاوة علي ذلك ، نعرض كيفيه استخدام هذا المستشعر للتصوير الديناميكي لمستويات ATP الخلوية في الخلايا العصبية و astrocytes.
النشاط العصبي في الجهاز العصبي المركزي (CNS) يستدعي ارتفاع الطلب علي الطاقة الخلوية التي يوفرها انهيار الفوسفات الثلاثي (ATP). هناك حاجه إلى حصة كبيره من ATP لأعاده تثبيت التدرجات أيون عبر اغشيه البلازما المتدهورة بواسطة الإشارات الكهربائية من الخلايا العصبية. هناك أدله علي ان استروسيتيس-في حين لا توليد الإشارات الكهربائية السريعة أنفسهم-الخضوع لزيادة إنتاج ATP استجابه للنشاط العصبي ودعم الخلايا العصبية النشطة من خلال توفير نواتج الأيض الطاقة لهم. التطور الأخير لأجهزه الاستشعار المشفرة وراثيا لنواتج الأيض مختلفه تمكن الآن دراسة مثل هذه التفاعلات الايضيه بين الخلايا العصبية و astrocytes. هنا ، ونحن وصف بروتوكول للتعبير عن نوع الخلية محدده من ATP الحساسة الفلورية الرنين نقل الطاقة-(الحنق-) الاستشعار ATeam 1.03يمك في الانسجه العضوية شريحة الثقافات من الحصين الماوس والقشرة باستخدام النواقل الفيروسية المرتبطة ADENO (aav). وعلاوة علي ذلك ، فاننا نثبت كيف يمكن استخدام هذا المستشعر للقياس الديناميكي للتغيرات في مستويات ATP الخلوية في الخلايا العصبية والأسطرلابات عند الزيادات في البوتاسيوم خارج الخلية والحث التالي لنقص التروية الكيميائية (اي تثبيط استقلاب الطاقة الخلوية).
النشاط الكهربائي المثير من الخلايا العصبية يستند إلى حد كبير علي تدفق الشحنات مثل الصوديوم (Na +) والبوتاسيوم (K +) عبر اغشيه البلازما الخاصة بهم. التالي فان صيانة التدرجات الكهروكيميائية لهذين الأيونين مطلوبه للاشاره. ويتحقق هذا من قبل Na الخلوية +/ك +-atpase (nka) ، وأعرب بشكل مطلق مضخة الغشاء الكهربائي ، التي البثق 3Na + من الخلية في مقابل 2K + من الفضاء خارج الخلية ، والتي تتطلب استهلاك جزيء واحد من ATP لكل دوره النقل1. بالاضافه إلى NKA ، وهناك العديد من الناقلات الأيونات الأخرى المستهلكة ATP بما في ذلك غشاء البلازما Ca2 +-atpase ، وهو أمر حيوي لل ca داخل الخلايا2 + التوازن وتصديرها بعد النشاط الناجم عن تدفق2. في الحويصلات بريسينابتيك ، فاكولار-نوعH +-atpase (v-atpase) يخلق التدرج البروتون اللازمة لامتصاص النواقل العصبية في هذا المقصورة3.
في حين ان نشاط الخلايا العصبية التالي يتطلب كميه كبيره من ATP4, انها لا تظهر قدره كبيره لتخزين الطاقة. بدلا من, يبدو انها تعتمد علي التفاعلات الايضيه مع astrocytes المجاورة, مخازن الجليكوجين الرئيسية في الدماغ5. وقد اقترح ان الجليكوجين والنجميه يلعب في الواقع دورا هاما في دعم احتياجات الطاقة العصبية; وظاهره رئيسيه في هذا الاقتراح اقتران العصبية الايضيه بين نوعي الخلية هو قدره استروسيتيس لزيادة إنتاجها ATP استجابه للنشاط العصبية6,7,8. هذه الفرضية, المعروفة باسم المكوك اللاكتات العصبية astrocyte (anls), لا يزال قيد المناقشة, لان العمل الأخرى قدمت أدله علي ان الخلايا العصبية قد أيضا زيادة معدل الخاصة بهم من تحلل الجلوكوز استجابه لتحفيز9,10, تعكس ضرورة المزيد من الطرق والنهج لدراسة التفاعل العصبية-
التحقيق في التمثيل الغذائي للطاقة الخلوية ومستويات ATP في الخلايا العصبية و استروسيتيس لتوضيح التفاعلات الايضيه العصبية الدبقيه قد أعيقت منذ فتره طويلة بسبب عدم وجود تحقيقات مناسبه للكشف عن التغيرات في تركيزات المستقلب في الخلايا الحية في انسجه المخ. ومع ذلك ، فقد وفر العقد الأخير طفرة في تطوير أدوات جديده وتحقيقات فلورية جديده مرمزه وراثيا لنواتج الأيض المختلفة ، بما في ذلك أجهزه الاستشعار لل ATP ، اللاكتات ، بيروفات وغيرها11،12. باستخدام هذه الاداات ، أصبح من الممكن الآن مباشره معالجه الاسئله المتعلقة باستهلاك ATP الخلوي والتغيرات في مستويات الطاقة الخلوية علي مستوي الخلية الواحدة وبطريقه محدده من نوع الخلية في انسجه المخ السليمة13.
في العمل الحالي ، ونحن وصف اجراء لتصور ديناميات ATP عصاري خلوي علي الخلايا العصبية و استروسيتيس من شرائح الدماغ المجسم المثقف. نعرض كيفيه استخدام النواقل الفيروسية المرتبطة بالموجات العالية (aav) للتعبير المحدد من نوع الخلية عن الترميز الوراثي ATP-نانوسيتور ateam 1.03يمك (14) في الخلايا العصبية و استروسيتيس من شرائح الدماغ الماوس التي يمكن الاحتفاظ بها في ثقافة الخلية لعده أسابيع15. يتم وصف اجراء لكيفيه أزاله الندبة الداليه التي تغطي شرائح الانسجه المستزرعة ، مما يحسن امكانيه الوصول البصري وتصوير الخلايا في طبقات النسيج العضوي تحت. وأخيرا ، ونحن نظهر كيف ATeam 1.03يمك يمكن استخدامها لأداء التصوير القائم علي الحنق من التغييرات في مستويات ATP الخلوية في هذا الاعداد. هذا الأسلوب يستضيف المزايا الرئيسية التي لا تتطلب إجراءات الدماغ الجراحية ، ويوفر مستويات عاليه من التعبير عن الاستشعار ونوعيه الخلية في شرائح الدماغ مثقف ، والحد من غزو أو الإجهاد في الخلايا بالمقارنة مع غيرها من الطرق ، مثل التحويل عن طريق الكهرباء أو نقل مع ناقلات الفيروسيةالأخرى10،16، بالاضافه إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول علي الأخرى التي تستند إلى التاكل النانويه ، من بينها المتغيرات من 1.03 ATeam التي توفر تقارب ربط اقل ل ATP14.
هنا ، ونحن نظهر اجراء للتعبير الخلية من نوع محدد من ateam 1.03يمك، والقائم علي الحنق ، والمشفرة وراثيا النانويه14، لقياس التغيرات في مستويات ATP في استروسيتيس أو الخلايا العصبية في الثقافات شريحة النسيج العضوي من الدماغ الماوس15. في التسجيلات النموذجية ، ونحن نظهر ان زيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية لا يؤدي إلى تغيير في تركيزات atp في الخلايا العصبية ، في حين ترتفع مستويات atp والنجميه استجابه لهذا التلاعب. وعلاوة علي ذلك ، تظهر نتائجنا انه عند تثبيط الأيض الخلوي ، فان نسبه التاكل من ATeam 1.03يمك تنخفض بسرعة في كل من أنواع الخلايا ، مما يشير إلى انخفاض سريع في ATP داخل الخلايا.
التعبير عن ATeam 1.03يمك في الثقافات شريحة الشكل العضوي يتطلب الحفاظ علي الانسجه في الثقافة في ظل ظروف خاضعه للرقابة لمده لا تقل عن 7-10 يوما. وبدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام ateam 1.03يمك لقياس ATP في شرائح انسجه المخ المعزولة بشكل حاد وفي الأعصاب البصرية للفئران13،15. ومع ذلك ، فان القياسات في الانسجه المعزولة بشكل حاد تستلزم توليد الكائنات المحورة وراثيا أو التطبيق المجسم لنواقل فيروسية في المخ ، بما في ذلك التجارب الحيوانية والبروتوكولات الصارمة لرعاية الماشية. وفي هذا الصدد ، تمثلالتعبيرات المتعلقة بشريحة الانسجه العضوية في النسيج العضوي ، البديل المفيد والقيم22،23. لسنوات عديده الآن ، والنسيج العضوي شريحة الثقافات بمثابه نظام نموذجي الثابتة لدراسة الخصائص العصبية ، والاتصال والتنمية24،25،26. انها ليست فقط الحفاظ علي الهندسة المعمارية الانسجه العامة والتصفيح (الشكل 1) ، ولكن أيضا استضافه الخصائص التفضيلية للثقافات الخلية مثل الوصول المتفوق والتحكم المباشر في الظروف التجريبية. كما تستخدم الثقافات شريحة النسيج العضوي بشكل روتيني للتعبير عن الجينات الاجنبيه باستخدام ناقلات الفيروسية27. تم الإبلاغ عن عده أنواع من النواقل الفيروسية لتوصيل الجينات المتحولة إلى انسجه المخ16,28. النواقل الفيروسية للحث علي التعبير العالي في الخلايا الددميه ، ولكن ليس هيبوكامبال العصبية16، ويمكن ان تولد التفاعل الدالي17. النواقل الفيروسية المرتبطة ب adeno كما هي مستخدمه هنا تظهر كبديل جيد15، وقد أظهرت فعاليتها أيضا في الجسم المجري29.
في حين تستخدم أساسا لدراسة خصائص الخلايا العصبية, وقد وضعت الدراسات الاخيره ان الانسجه النسيجية شريحة الثقافات يمكن أيضا ان تستخدم لتحليل astrocytes. وعاده ما تغطي شرائح مثقف من قبل طبقه من استروسيتيس رد الفعل19،30 (الشكل 5) ، ولكن استروسيتيس يحمل أكثر الأصلي ، والمورفولوجية غير التفاعلية والعمارة الخلوية في طبقات أعمق19،30 (الشكل 5). في هذه الدراسة ، ونحن وصف اجراء للازاله الميكانيكية للندبة الداليه الخارجي ، والذي يؤدي إلى الحصول علي أفضل التجريبية والبصرية من استروسيتيس الاصليه داخل طبقات النسيج العضوي السليم. وعلاوة علي ذلك ، فان ازالته يحسن فعاليه التعبير في طبقات أعمق من شرائح الشكل العضوي ؛ إذا لم تتم أزاله الندبة الطائرة ، فقد تميل المحولات بدون طيار إلى الاقتصار علي طبقات الخلايا السطحية.
هناك العديد من العوامل الميكانيكية الخارجية التي يجب مراعاتها عند اجراء التجارب في شرائح الانسجه. ويمكن للتغير في سرعه الاستحمام بالانصهار ان يحفز حركات الاعداد بأكمله و/أو يحفز التغييرات في التركيز ، مما يؤدي إلى تغييرات عابره اصطناعية لاشاره المستشعر. وعلاوة علي ذلك ، تم الإبلاغ عن كل من استروسيتيس والخلايا العصبية للرد علي تشوه الميكانيكية مثل التي فرضتها معدلات ترويه عاليه32،33. في ايدينا ، وذلك باستخدام مضخة التمعجيه موثوق بها ، مع الحفاظ علي كميات صغيره ومستقره من المحلول الملحي بين الانسجه والهدف (الغضروف المفصلي) نتائج في مستقره الحنق اشاره تحت ظروف خط الأساس في سرعه ترويه المستخدمة هنا (1.5-2.5 mL/min; الشكل 8).
في هذه الدراسة ، ونحن أيضا إثبات ان التصوير القائم علي الحنق مع ATeam 1.03يمك يمكن استخدامها لرصد مستويات ATP في الخلايا العصبية والفلكية. وسيله بديله أدخلت في وقت سابق لقياس ATP الخلوية هو ما يسمي luciferin-luciferin مقايسة34،35،36،37. ومع ذلك ، فان هذا النهج يقوم علي تصوير التلالؤ الإحيائي ولا يوفر سوي دقه منخفضه زمنيا ومكانيا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى ارتفاع مستويات الضجيج في الخلفية. طريقه أخرى تستخدم بشكل روتيني في السنوات الاخيره كان التصوير من التغيرات في تركيز المغنيسيوم داخل الخلايا باستخدام الأيونات الحساسة الفلوروكوفيري المغنيسيوم الأخضر38،39،40. ويتصل هذا النهج بالملاحظة التي مفادها ان استهلاك ATP يؤدي إلى الإفراج عن المغنيسيوم في العامل المشترك. التصوير مع المغنيسيوم الأخضر التالي يوفر فقط تقديرا ثانويا للتغيرات في مستويات ATP. وعلاوة علي ذلك ، المغنيسيوم الأخضر هو أيضا حساسة للتغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا ، وإدخال صعوبة أخرى عند تفسير النتائج التي تم الحصول عليها مع هذه الطريقة.
التالي ، فان التطور الأخير لل نانوسينسيرس المرمزة وراثيا للتصويرالمباشر لنواتج الأيض الخلوية ، يمثل خطوه كبيره إلىالامام 11 ،12. تم إنشاء العديد من أجهزه الاستشعار المختلفة التي يمكن استخدامها لقياس ATP داخل الخلايا36،41،42،43. ومن بين تلك المؤشرات الفلورسنت الفلورية “كوين”41 وكذلك بيركيفالهر ، الذي يستشعر ATP: ADP نسبه42. في حين ان المسبار الأخير هو أداه قيمه لدراسة حاله الطاقة من الخلايا ، فانه يتطلب قياس متزامن للتغيرات فيال42الهيدروجيني.
ATeam هو نانوناناو العديد من المتغيرات الموجودة ، والتي-من بين أمور أخرى-تختلف في تقارب ملزمه ل ATP14. في المختبر, ATeam 1.03يمك يسلك كد من 1.2 mM في 37 °c, الذي هو علي مقربه من مستويات ATP الخلوية المحددة في أنواع مختلفه من الخلايا العصبية, تتراوح بين المهاد والمخيخ34 إلى الحصين37,44,45. في قياسات كوفيت ، ادي خفض درجه الحرارة بنسبه 10 درجه مئوية إلى انخفاض كبير في التقارب الملزم من ateam 1.03يمك إلى ATP ، مما يوحي بأنه قد لا يكون مثاليا للتصوير الخلوي في درجه حرارة الغرفة14. لدينا دراسة سابقه15، ومع ذلك ، أظهرت ان السلوك والاستجابة من ateam 1.03يمك المعرب عنها في الخلايا العصبية و استروسيتيس للتلاعب مختلفه مماثله في الفسيولوجية القريبة ودرجه حرارة الغرفة ، مما يدل علي ان الاستشعار يسمح تحديد موثوق بها مستويات ATP داخل الخلايا في كلا الحالتين. الاضافه إلى ذلك ، تناولت تجاربنا السابقة حساسية الأس الهيدروجيني من ATeam 1.03يمك المعرب عنها داخل الخلايا15، والتي تبين انه غير حساس للتغيرات في الأس الهيدروجيني في الخلايا من قبل حوالي 0.1-0.2 وحدات الحموضة. إذا كان كد في نطاق منخفض مم هو مصدر قلق ، يمكن استخدام المتغيرات ateam البديل14، من بينها المتغيرات الحمراء تحولت من ATEAM (“الذهاب ateam”)43.
تجاربنا باستخدام ateam 1.03يمك تثبت ان زيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية من قبل بضعة ملم فقط (من 3 إلى 8 ملم) يؤدي إلى زيادة عابره في نسبهاليمني 1.03 يمك في استروسيتيس في ثقافة شريحة الشكل العضوي. هذه الملاحظة تؤكد الدراسات السابقة15,46 ويشير بوضوح إلى ان استروسيتيس الاستجابة للإفراج عن البوتاسيوم من قبل الخلايا العصبية النشطة مع زيادة في إنتاج ATP, في الغالب علي الأرجح نتيجة لتحفيزna +/K +-atpase وna +/hco3– cotransporter, علي التوالي47,48. وعلي النقيض من ذلك ، لم تظهر الخلايا العصبية استجابه ، وهو ما يتماشى مع العمل السابق وكذلك15. كلا أنواع الخلايا ، ومع ذلك ، بسرعة وبقوة رد فعل لتثبيط تحلل الخلوية والتنفس الميتوكوندريا كما هو مبين قبل15. في ظل ظروف نقص التروية الكيميائية ، انخفضت نسب ATeam الحنق إلى مستوي مستقر جديد ، مما يدل علي استنزاف الاسمية ATP الخلوية. وتشير النتيجة الاخيره إلى ان كلا من الخلايا العصبية وكذلك استروسيتيس يحمل الاستهلاك ذات الصلة من ATP أيضا تحت ظروف ثابته الدولة دون تحفيز إضافي من قبل تنشيط متشابك أو تطبيق الناقلات العصبية. معا ، نستنتج ان التصوير القائم علي التاكل مع النانو المشفرة وراثيا ، من بينها ATeam 1.03يمك، سيوفر نهجا قيما لتوضيح العمليات الخلوية التي هي المسؤولة عن التغييرات في مستويات atp داخل الخلايا واستهلاك atp الخلوية في ظل ظروف مختلفه.
The authors have nothing to disclose.
ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا كلوديا رودرغو وسيمون دورري علي المساعدة التقنية الخبيرة. نشكر الدكتور Niklas j. Gerkau والM.Sc جويل نيلسون للحصول علي المساعدة في اعداد الثقافات شريحة الشكل العضوي. ومولت البحوث التي أجريت في مختبر صاحبه البلاغ رابطه البحوث المانيه (DFG ؛ ل 2795: Ro 2327/13-1 و SPP 1757: Ro 2327/8-2 إلى CRR; و SPP 1757: الشباب الناشئة التمويل البدء إلى RL).
2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
Microscope stage | custom build | ||
Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |