我们描述了基于基因编码的FRET传感器ATeam1.03YEMK在小鼠前脑的有机切片培养物中细胞型特定表达的协议。此外,我们演示如何使用此传感器对神经元和星形细胞中的细胞ATP水平进行动态成像。
中枢神经系统 (CNS) 中的神经活动唤起了对三磷酸腺苷分解所提供的细胞能量的高需求。在因神经元的电信号而退化的等离子膜上重新安装电梯度需要大量 ATP。有证据表明,星形细胞虽然本身不产生快速的电信号,但会因神经元活动而增加ATP的产生,并通过向它们提供能量代谢物来支持活动神经元。最近针对不同代谢物的遗传编码传感器的发展,使得研究神经元和星形细胞之间的这种代谢相互作用成为可能。在这里,我们描述了ATP敏感荧光共振能量转移-(FRET-)传感器ATeam1.03YEMK在小鼠海马和皮层的器官组织切片培养中使用阿丁相关病毒载体(AAV)的细胞类型特定表达的协议。此外,我们演示了该传感器如何用于动态测量神经元和星形细胞在细胞外钾增加和化学缺血诱导后(即抑制细胞能量代谢)时细胞ATP水平的变化。
神经元的兴奋电活动主要基于阳离子的通量,如钠(Na+)和钾(K+)在其血浆膜上。因此,信号需要维护这两个离子的电化学梯度。这是由细胞Na+/K+–ATPase(NKA),一个无处不在的表达电转基因泵,挤出3 Na+从细胞外空间交换2K+,需要消耗一个ATP分子每个传输周期1。除了NKA,还有其他几个ATP消耗的电传递器,包括血浆膜Ca 2+-ATPase,这对细胞内Ca2+平衡及其出口至关重要,在活动引起的流入2。在先发前囊泡中,真空型H+-ATPase(v-ATPase)产生神经递质进入这个腔室3所需的质子梯度。
虽然神经元的活动因此需要大量的ATP4,但它们并不表现出重要的能量储存能力。相反,他们似乎依赖于代谢相互作用与邻近的星形细胞,主要糖原储存在大脑5。有人建议,星形糖原确实在支持神经元能量需求方面起着重要的作用;在这两种细胞类型之间提出的神经代谢耦合中,一个关键现象是星形细胞在响应神经元活性6、7、8时增加其ATP产量的能力。这个假说,被称为星形细胞-神经元乳酸穿梭(ANLS),仍在争论中,因为其他工作已经提供了证据,神经元也可能提高自己的糖解率,以回应刺激9,10,反映了进一步的方法和方法的必要性,以研究神经-胶质相互作用。
长期以来,由于缺乏合适的探针来检测脑组织中活细胞中代谢物浓度的变化,对神经元和星形细胞中的细胞能量代谢和ATP水平的研究一直阻碍阐明神经-胶质代谢相互作用。然而,在过去的十年里,为不同的代谢物,包括ATP、乳酸盐、丙酮和其他11、12的传感器,提供了开发新工具和新的基因编码荧光探针的激增。使用这些工具,现在可以直接解决与细胞ATP消耗和细胞能量水平变化有关的问题,在单个细胞水平和细胞类型特定的方式在完整的脑组织13。
在本工程中,我们描述了一个过程,以可视化细胞ATP动力学的神经元和星形细胞培养的有机脑切片。我们展示如何使用阿不与病毒载体(AAV)进行基因编码的ATP-纳米传感器ATeam1.03YEMK(14)在神经元和星形细胞细胞中的细胞类型特定表达,这些细胞可以在细胞培养中维持数周。介绍了如何去除覆盖培养组织切片的胶质疤痕的过程,这改善了下面器官组织层中细胞的光学可访问性和成像。最后,我们展示了 ATeam1.03YEMK如何用于在此准备中执行基于 FRET 的细胞 ATP 水平变化成像。该方法具有不需要手术脑手术的主要优点,在培养脑切片中提供传感器和细胞类型特异性的高水平表达,减少细胞中的侵入性或压力,与其他方法相比,如电穿孔或转染与其他病毒载体10、16、17。此外,该协议可应用于其他基于FRET的纳米传感器,其中包括ATeam1.03的变种,为ATP14提供较低的绑定亲和力。
在这里,我们演示了ATeam1.03YEMK细胞型特定表达的过程,这是一种基于FRET的遗传编码纳米传感器14,用于测量小鼠大脑15的细胞组织切片培养物中星形细胞或神经元的ATP水平变化。在示例性录音中,我们表明细胞外钾浓度的增加不会导致神经元ATP浓度的变化,而星形ATP水平会随着这种操作而升高。此外,我们的结果表明,在抑制细胞代谢时,ATeam1.03YEMK FRET比率在两种细胞类型中迅速下降,表明细胞内ATP迅速下降。
ATeam1.03YEMK在有机切片培养物中的表达要求在受控条件下维持培养物中的组织至少7-10天。或者,ATeam1.03YEMK也可用于在急性分离的脑组织切片和小鼠13、15的视神经中测量ATP。然而,在急性分离的组织中进行测量,需要生成转基因动物或将病毒载体的立体定向应用到大脑中,包括动物实验和严格的动物护理协议。在这方面,ATeam1.03YEMK在组织切片培养物中的表达是一种有用和有价值的替代词22,23。多年来,有机组织切片培养作为研究神经特性、连通性和发育的既定模型系统24,25,26。它们不仅保持了一般组织架构和层压(图1),而且承载了细胞培养的优越特性,如优越的可访问性和直接控制实验条件。组织切片培养也经常被用来表达外来基因使用病毒载体27。据报道,几种病毒载体将转基因转化为脑组织16、28。抗病毒载体诱导胶质细胞的高表达,但不是海马神经元16,并可能产生胶质反应17。阿德诺相关的病毒载体在这里使用出现作为一个很好的替代15,其有效性也已显示在体内29。
虽然主要用于研究神经元性质,但最近的研究已经确定,器官组织切片培养也可以用于分析星形细胞。培养的切片通常被一层反应性星形细胞覆盖(图5),但星形细胞在更深的层19、30(图5)中表现出更原生、非反应形态和细胞结构。在本研究中,我们描述了一个机械去除外胶质疤痕的程序,这导致在适当的器官组织层内,本地星形细胞具有更好的实验和光学可及性。此外,其去除提高了器官切片深层的表达功效;如果不去除胶质疤痕,AAV的转导可能倾向于限制在表面细胞层。
在组织切片中执行实验时,需要考虑几个外部机械因素。浴灌注速度的变化可以诱发整个制备的运动和/或引起焦点的变化,导致传感器信号的人工瞬态变化。此外,星形细胞和神经元都报告对机械变形作出反应,如高灌注率32,33。在我们手中,使用可靠的蠕动泵,以及保持组织和客观(半月板)之间的小而稳定的盐水量,在基线条件下,以此处使用的灌注速度(1.5-2.5 mL/min)产生稳定的FRET信号;图 8.
在本研究中,我们还演示了使用 ATeam1.03YEMK进行基于 FRET 的成像可用于监测神经元和星形细胞中的 ATP 水平。较早前为测量细胞ATP而引入的另一种方法是所谓的荧光素-荧光酶测定34、35、36、37。然而,这种方法基于生物发光成像,仅提供相当低的时间和空间分辨率,部分原因是由于背景噪声水平高。近年来使用的另一种常规方法是使用对光敏感的荧光镁绿色38、39、40来成像细胞内镁浓度的变化。这种方法与一种观察结果有关,即ATP的消耗会导致其同因镁的释放。因此,用镁绿色成像只能提供ATP水平变化的二次估计。此外,镁绿色对细胞内钙的变化也十分敏感,在解释使用这种方法获得的结果时,又会引入另一个困难。
因此,最近用于细胞代谢物直接成像的基因编码纳米传感器的发展,标志着11、12向前迈出了一大步。产生了几个不同的传感器,可用于测量细胞内ATP 36,41,42,43。其中包括比例荧光ATP指标“QUEEN”41以及感知ATP:ADP比率42的PercevalHR。虽然后一种探针是研究细胞能量状况的宝贵工具,但它需要同时测量pH42的变化。
ATeam是一种纳米传感器,其中存在多种变体,其中(除其他外)在ATP14的绑定亲和力上有所不同。在体外,ATeam1.03YEMK在37°C时表现出1.2 mM的Kd,接近不同神经元细胞类型确定的细胞ATP水平,从下丘脑和小脑34到海马37,44,45。在比色皿测量中,将温度降低10°C可显著降低ATeam1.03YEMK与ATP的结合亲和力,表明在室温14下,它可能不是细胞成像的理想选择。然而,我们早先的研究15表明,ATeam1.03YEMK在神经元和星形细胞中对不同操作的行为和反应在接近生理和室温下相似,这表明传感器能够可靠地确定在这两种情况下的细胞内ATP水平。此外,我们以前的实验还解决了ATeam1.03YEMK在细胞15内表达的pH敏感性,表明它对细胞内pH的改变不敏感,大约0.1-0.2 pH单位。如果低 mM 范围内的 Kd是一个问题,则可能使用替代 ATeam 变体14,其中包括 ATeam(”GO-ATeam”)43的红移变型。
我们使用 ATeam1.03YEMK的实验表明,仅将细胞外钾浓度增加几 mM(从 3 mM 到 8 mM)会导致有机体切片培养中的星形细胞中的 ATeam1.03YEMK比暂时增加。这一观察证实了早期的研究15,46,并清楚地表明,星形细胞对钾释放的反应,活性神经元增加其ATP产量,很可能是由于刺激Na+/K+–ATPase和Na +/HCO3–共运,分别47,48。与此相反,神经元没有显示响应,这与以前的工作以及15一致。然而,这两种细胞类型对细胞糖解和线粒体呼吸抑制反应迅速和强烈,如15日之前所示。在化学缺血条件下,ATeam FRET 比率降至一个新的稳定水平,表明细胞 ATP 的名义消耗。后一个结果表明,神经元和星形细胞都表现出ATP的相关消耗也显示在稳定状态条件下,没有额外的刺激,通过突触激活或神经递质的应用。综合起来,我们得出结论,基于FRET的成像与基因编码的纳米传感器,其中包括ATeam1.03YEMK,将提供一个有价值的方法,阐明细胞过程,负责在不同条件下细胞内ATP水平和细胞ATP消费的变化。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢克劳迪娅·罗德里戈和西蒙娜·杜里提供专家技术援助。我们感谢尼克拉斯·格考博士和乔尔·纳尔逊M.Sc协助筹备器官切片培养物。作者实验室的研究由德国研究协会(DFG;对于 2795: Ro 2327/13-1 和 SPP 1757: Ro 2327/8-2 到 CRR;和SPP 1757:年轻的胶质启动资金RL)。
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