Nous décrivons un protocole pour l’expression spécifique de type cellulaire du capteur génétiquement codé à base de FRET ATeam1.03YEMK dans les cultures de tranches organotypiques du cerveau avant-cerveau de la souris. En outre, nous montrons comment utiliser ce capteur pour l’imagerie dynamique des niveaux d’ATP cellulaire dans les neurones et les astrocytes.
L’activité neuronale dans le système nerveux central (SNC) évoque une forte demande d’énergie cellulaire fournie par la dégradation de l’adénosine triphosphate (ATP). Une grande partie de l’ATP est nécessaire pour réinstaller les gradients d’ions à travers les membranes plasmatiques dégradées par la signalisation électrique des neurones. Il existe des preuves que les astrocytes – tout en ne générant pas eux-mêmes des signaux électriques rapides – subissent une production accrue d’ATP en réponse à l’activité neuronale et soutiennent les neurones actifs en leur fournissant des métabolites énergétiques. Le développement récent de capteurs génétiquement codés pour différents métabolites permet maintenant l’étude de telles interactions métaboliques entre les neurones et les astrocytes. Ici, nous décrivons un protocole pour l’expression spécifique de type cellulaire du transfert d’énergie de résonance de fluorescence ATP-sensible -(FRET-) capteur ATeam1.03YEMK dans les cultures de tranche de tissu organotypic de l’hippocampe de souris et du cortex utilisant les vecteurs viraux adéno-associés (AAV). En outre, nous démontrons comment ce capteur peut être employé pour la mesure dynamique des changements dans les niveaux cellulaires d’ATP dans les neurones et les astrocytes sur des augmentations de potassium extracellulaire et suivant l’induction de l’ischémie chimique (c.-à-d., une inhibition du métabolisme d’énergie cellulaire).
L’activité électrique excitatrice des neurones est en grande partie basée surle flux de cations telles que le sodium (Na) et le potassium(K)à travers leurs membranes plasmatiques. Le maintien des gradients électrochimiques de ces deux ions est donc nécessaire à la signalisation. Ceci est accompli par le na cellulaire/K-ATPase(NKA), une pompe transmembrane électrogénique omniprésente, qui extrude 3 Na– hors de la cellule en échange de 2 K– de l’espace extracellulaire, nécessitant la consommation d’une molécule d’ATP par cycle de transport1. En plus de la NKA, il y a plusieurs autres transporteurs d’ions consommant de l’ATP, y compris la membrane plasmatique Ca2-ATPase, qui est vitale pour l’homéostasie intracellulaire Ca2 et son exportation suite à l’afflux induit par l’activité2. Dans les vésicules présynaptiques, un vacuolaire de type H-ATPase(v-ATPase) crée le gradient de proton nécessaire à l’utilisation des neurotransmetteurs dans ce compartiment3.
Bien que l’activité des neurones nécessite donc une quantité substantielle d’ATP4, ils ne montrent pas une capacité significative pour le stockage de l’énergie. Au lieu de cela, ils semblent s’appuyer sur des interactions métaboliques avec les astrocytes voisins, les principaux magasins de glycogène dans le cerveau5. Il a été suggéré que le glycogène astrocytique joue en effet un rôle important dans le soutien des besoins énergétiques neuronaux; et un phénomène clé dans ce couplage neuro-métabolique proposé entre les deux types de cellules est la capacité des astrocytes d’augmenter leur production d’ATP en réponse à l’activité neuronale6,7,8. Cette hypothèse, connue sous le nom de navette de lactate d’astrocyte-neurone (ANLS), est toujours en discussion, parce que d’autres travaux ont fourni la preuve que les neurones peuvent également augmenter leur propre taux de glycolyse en réponse à la stimulation9,10, reflétant la nécessité d’autres méthodes et approches pour étudier l’interaction neuro-glia.
L’étude du métabolisme d’énergie cellulaire et des niveaux d’ATP dans les neurones et les astrocytes pour élucider les interactions métaboliques de neuro-glia a longtemps été entravée par l’absence de sondes appropriées pour la détection des changements des concentrations de métabolites dans les cellules vivantes dans le tissu cérébral. La dernière décennie, cependant, a fourni une poussée dans le développement de nouveaux outils et de nouvelles sondes fluorescentes génétiquement codées pour différents métabolites, y compris les capteurs pour l’ATP, lactate, pyruvate et d’autres11,12. À l’aide de ces outils, il est maintenant possible d’aborder directement les questions liées à la consommation d’ATP cellulaire et aux changements des niveaux d’énergie cellulaire au niveau des cellules individuelles et d’une manière spécifique de type cellulaire dans le tissu cérébral intact13.
Dans le présent travail, nous décrivons une procédure pour visualiser la dynamique cytoslique d’ATP sur des neurones et des astrocytes des tranches de cerveau organotypic cultivées. Nous montrons comment employer des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) pour l’expression spécifique de type cellulaire de l’ATP-nanocapteur génétiquement codé ATeam1.03YEMK (14) dans les neurones et les astrocytes des tranches de cerveau de souris qui peuvent être maintenus dans la culture cellulaire pendant plusieurs semaines15. Une procédure de la façon d’enlever la cicatrice gliale qui couvre les tranches de tissu cultivé est décrite, ce qui améliore l’accessibilité optique et l’imagerie des cellules dans les couches de tissu organotypique en dessous. Enfin, nous montrons comment ATeam1.03YEMK peut être utilisé pour effectuer l’imagerie basée sur fret des changements dans les niveaux d’ATP cellulaires dans cette préparation. Cette méthode présente les principaux avantages qu’elle ne nécessite pas de procédures chirurgicales du cerveau, fournit des niveaux élevés d’expression du capteur et la spécificité du type cellulaire dans les tranches de cerveau cultivés, réduisant l’invasivité ou le stress dans les cellules par rapport à d’autres méthodes, comme la transfection par électropoction ou transduction avec d’autres vecteurs viraux10,16,17. En outre, ce protocole peut être appliqué à d’autres nanocapteurs basés sur FRET, parmi eux des variantes d’ATeam1.03 qui fournissent une affinité de liaison plus faible pour L’ATP14.
Ici, nous démontrons une procédure pour l’expression spécifique de type cellulaire d’ATeam1.03YEMK, un nanocapteur génétiquement codé à base de FRET14, pour la mesure des changements dans les niveaux d’ATP dans les astrocytes ou les neurones dans les cultures de tranches de tissu organotypiques du cerveau de souris15. Dans les enregistrements exemplaires, nous montrons qu’une augmentation de la concentration extracellulaire de potassium n’entraîne pas un changement des concentrations d’ATP dans les neurones, tandis que les niveaux d’ATP astrocytiques augmentent en réponse à cette manipulation. En outre, nos résultats démontrent que sur l’inhibition du métabolisme cellulaire, le rapport de FRET deYEMK d’ATeam1.03 diminue rapidement dans les deux types de cellules, indiquant une diminution rapide de l’ATP intracellulaire.
L’expression de ATeam1.03YEMK dans les cultures de tranches organotypiques exige le maintien du tissu dans la culture dans des conditions contrôlées pendant au moins 7-10 jours. Alternativement, ATeam1.03YEMK peut également être employé pour la mesure de l’ATP dans les tranches de tissu cérébral intensément isolées et dans les nerfs optiques des souris13,15. Les mesures dans les tissus très isolés, cependant, nécessitent la génération d’animaux transgéniques ou une application stéréotaxique de vecteurs viraux dans le cerveau, impliquant l’expérimentation animale et des protocoles stricts de soins aux animaux. À cet égard, ATeam1.03YEMK expression dans les cultures de tranches de tissu organotypique représente une alternative utile et précieuse22,23. Depuis de nombreuses années maintenant, les cultures de tranches de tissu organotypiques servent de modèle établi pour étudier les propriétés neuronales, la connectivité et le développement24,25,26. Ils maintiennent non seulement l’architecture et le laminage généraux de tissu (figure 1), mais accueillent également les propriétés préférentielles des cultures cellulaires telles que l’accessibilité supérieure et le contrôle direct des conditions expérimentales. Les cultures de tranches de tissu organotypiques sont également couramment utilisées pour exprimer des gènes étrangers en utilisant des vecteurs viraux27. Plusieurs types de vecteurs viraux ont été rapportés pour livrer des transgènes dans le tissu cérébral16,28. Les vecteurs adénovirins induisent une forte expression dans les cellules gliales, mais pas les neurones hippocampiques16, et pourraient générer une réactivité gliale17. Les vecteurs viraux adéno-associés utilisés ici émergent comme une bonne alternative15, et leur efficacité a également été démontrée in vivo29.
Bien qu’il soit principalement utilisé pour l’étude des propriétés neuronales, des études récentes ont établi que les cultures de tranches de tissu organotypiques peuvent également être utilisées pour l’analyse des astrocytes. Les tranches cultivées sont généralement recouvertes d’une couche d’astrocytes réactifs19,30 (figure 5), mais les astrocytes présentent une morphologie et une cytoarchitecture plus indigènes et non réactives dans des couches plus profondes19,30 (figure 5). Dans la présente étude, nous décrivons une procédure pour l’enlèvement mécanique de la cicatrice gliale externe, qui a comme conséquence une meilleure accessibilité expérimentale et optique des astrocytes indigènes dans les couches oranotypic appropriées de tissu. En outre, son retrait améliore l’efficacité de l’expression dans les couches plus profondes des tranches organotypiques; si la cicatrice gliale n’est pas enlevée, la transduction par les AAV peut avoir tendance à être limitée aux couches cellulaires superficielles.
Plusieurs facteurs mécaniques externes doivent être pris en considération lors de l’exécution d’expériences dans des tranches de tissu. Une variation de la vitesse de perfusion du bain peut induire des mouvements de toute la préparation et/ou induire des changements de mise au point, ce qui entraîne des changements transitoires artificiels du signal du capteur. En outre, les astrocytes et les neurones ont été rapportés pour répondre à la déformation mécanique telle que imposée par des taux élevés de perfusion32,33. Dans nos mains, l’utilisation d’une pompe péristtaltique fiable, ainsi que le maintien de volumes faibles et stables de saline entre le tissu et l’objectif (ménisque) se traduit par un signal FRET stable dans des conditions de base à la vitesse de perfusion utilisée ici (1,5-2,5 mL/min; Figure 8).
Dans la présente étude, nous démontrons également que la formation image basée sur fret avec ATeam1.03YEMK peut être employée pour surveiller des niveaux d’ATP dans les neurones et les astrocytes. Un autre moyen introduit plus tôt pour la mesure de l’ATP cellulaire est le soi-disant test luciferin-luciferase34,35,36,37. Cette approche, cependant, est basée sur l’imagerie de la bioluminescence et ne fournit qu’une résolution temporelle et spatiale plutôt faible en partie en raison de niveaux élevés de bruit de fond. Une autre méthode couramment employée ces dernières années était l’imagerie des changements dans la concentration intracellulaire de magnésium utilisant le fluorophore vert ion-sensible38,39,40. Cette approche se rapporte à l’observation qu’une consommation d’ATP a comme conséquence la libération de son magnésium de co-facteur. L’imagerie avec le vert de magnésium fournit ainsi seulement une estimation secondaire des changements dans des niveaux d’ATP. En outre, le vert magnésium est également sensible aux changements dans le calcium intracellulaire, introduisant une autre difficulté lors de l’interprétation des résultats obtenus avec cette méthode.
Le développement récent de nanocapteurs génétiquement codés pour l’imagerie directe des métabolites cellulaires, par conséquent, a représenté un grand pas en avant11,12. Plusieurs capteurs différents ont été générés qui peuvent être utilisés pour la mesure de l’ATP intracellulaire36,41,42,43. Parmi ceux-ci sont l’indicateur atp fluorescent ratiométrique “QUEEN”41 ainsi que PercevalHR, qui détecte le ratio ATP:ADP42. Bien que cette dernière sonde soit un outil précieux pour l’étude de l’état énergétique des cellules, elle nécessite une mesure simultanée des changements du pH42.
ATeam est un nanocapteur dont plusieurs variantes existent, qui- entre autres – diffèrent dans leur affinité de liaison pour ATP14. In vitro, ATeam1.03YEMK présente un Kd de 1,2 mM à 37 oC, ce qui est proche des niveaux d’ATP cellulaires déterminés dans différents types de cellules neuronales, allant de l’hypothalamus et le cervelet34 à l’hippocampe37,44,45. Dans les mesures de cuvette, l’abaissement de la température de 10 oC a entraîné une diminution significative de l’affinité de liaison de ATeam1.03YEMK à l’ATP, ce qui suggère qu’il pourrait ne pas être idéal pour l’imagerie cellulaire à température ambiante14. Notre étude antérieure15, cependant, a démontré que le comportement et la réponse de ATeam1.03YEMK exprimé dans les neurones et les astrocytes à différentes manipulations est similaire à la température physiologique proche et à la température ambiante, indiquant que le capteur permet une détermination fiable des niveaux d’ATP intracellulaires dans les deux conditions. En outre, nos expériences précédentes ont abordé la sensibilité au pH de ATeam1.03YEMK exprimée à l’intérieur des cellules15, montrant qu’il est insensible aux changements de pH intracellulaire par environ 0.1-0.2 unités de pH. Si le Kd dans la gamme mM basse est une préoccupation, d’autres variantes ATeam pourraient être utilisées14, parmi eux les variantes rouges décalées d’ATeam (“GO-ATeam”)43.
Nos expériences utilisant ATeam1.03YEMK démontrent qu’une augmentation de la concentration extracellulaire de potassium de quelques mM seulement (de 3 à 8 mM) entraîne une augmentation transitoire du rapport ATeam1.03YEMK dans les astrocytes dans la culture de tranches organotypiques. Cette observation confirme les études antérieures15,46 et indique clairement que les astrocytes répondent à la libération de potassium par les neurones actifs avec une augmentation de leur production d’ATP, la plupart du temps probablement à la suite d’une stimulation de la Na–/K-ATPaseet le Na /HCO3– cotransporter, respectivement47,48. En revanche, les neurones n’ont pas montré une réponse, qui est en ligne avec les travaux précédents ainsi15. Les deux types de cellules, cependant, rapidement et fortement réagi à l’inhibition de la glycolyse cellulaire et la respiration mitochondriale comme indiqué avant15. Dans des conditions d’ischémie chimique, les rapports De FRET d’ATeam sont tombés à un nouveau niveau stable, indiquant un épuisement nominal de l’ATP cellulaire. Ce dernier résultat suggère que les deux neurones aussi bien que les astrocytes montrent une consommation pertinente d’ATP également dans des conditions stables-sans stimulation supplémentaire par l’activation synaptique ou l’application des neurotransmetteurs. Pris ensemble, nous concluons que l’imagerie basée sur fret avec des nanocapteurs génétiquement codés, parmi eux ATeam1.03YEMK, fournira une approche précieuse pour élucider les processus cellulaires qui sont responsables des changements dans les niveaux d’ATP intracellulaires et la consommation d’ATP cellulaire dans différentes conditions.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Claudia Roderigo et Simone Durry pour leur assistance technique experte. Nous remercions le Dr Niklas J. Gerkau et M.Sc. Joel Nelson pour leur aide dans la préparation des cultures de tranches organotypiques. La recherche dans le laboratoire de l’auteur a été financée par l’Association allemande de recherche (DFG; POUR 2795: Ro 2327/13-1 et SPP 1757: Ro 2327/8-2 à CRR; et SPP 1757: Young Glia Start-Up funding to RL).
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