Descriviamo un protocollo per l’espressione specifica del tipo di cellula del sensore basato su FRET codificato geneticamente ATeam1.03YEMK nelle colture di sezioni organotipiche del prosencefalo del topo. Inoltre, mostriamo come utilizzare questo sensore per l’imaging dinamico dei livelli di ATP cellulare in neuroni e astrociti.
L’attività neuronale nel sistema nervoso centrale (CNS) evoca un’elevata domanda di energia cellulare fornita dalla rottura del triposfato di adenosina (ATP). Una grande quota di ATP è necessaria per reinstallare gradienti di ioni attraverso le membrane plasmatiche degradate dalla segnalazione elettrica dei neuroni. Ci sono prove che gli astrociti – pur non generando segnali elettrici veloci stessi – subiscono una maggiore produzione di ATP in risposta all’attività neuronale e supportano i neuroni attivi fornendo metaboliti energetici a loro. Il recente sviluppo di sensori geneticamente codificati per diversi metaboliti ora consente lo studio di tali interazioni metaboliche tra neuroni e astrociti. Qui, descriviamo un protocollo per l’espressione specifica di tipo cellulare del sensore DI fluorescenza sensibile all’ATP (FRET-) ATeam1.03YEMK nelle colture di sezioni di tessuto organotipico dell’ippocampo e della corteccia di topo utilizzando vettori virali associati ad adeno (AAV). Inoltre, dimostriamo come questo sensore può essere impiegato per la misurazione dinamica dei cambiamenti nei livelli di ATP cellulare nei neuroni e negli astrociti in seguito agli aumenti di potassio extracellulare e all’induzione di ischemia chimica (cioè, un’inibizione del metabolismo dell’energia cellulare).
L’attività elettrica eccitatoria dei neuroni si basa in gran parte sul flusso di cazioni come il sodio(Na) e il potassio(K) attraverso le loro membrane plasmatiche. Per la segnalazione è quindi necessaria la manutenzione dei gradienti elettrochimici di questi due ioni. Ciò è possibile da parte della cellula Na,/K–ATPase (NKA), una pompa transmembrana elettrogenica ampiamente espressa, che estrude 3Na , fuori dalla cellula in cambio di 2K , dallo spazio extracellulare, che richiede il consumo di una molecola di ATP per ciclo di trasporto1. Oltre all’NKA, ci sono diversi altri trasportatori di ioni che consumano ATP, tra cui la membrana plasmatica Ca2 ,ATPase, che è vitale per l’omeostasi intracellulare Ca2 e la sua esportazione a seguito dell’afflusso indotto dall’attività2. Nelle vesciche presynaptiche, un vacuolar-tipo H-ATPase(v-ATPase) crea il gradiente protone necessario per l’assorbimento del neurotrasmettitore in questo compartimento3.
Mentre l’attività dei neuroni richiede quindi una notevole quantità di ATP4, essi non presentano una capacità significativa per lo stoccaggio di energia. Invece, sembrano fare affidamento sulle interazioni metaboliche con gli astrociti vicini, i principali depositi di glicogeno nel cervello5. È stato suggerito che il glicogeno astrocitico svolge effettivamente un ruolo importante nel sostenere il fabbisogno di energia neuronale; e un fenomeno chiave in questo accoppiamento neuro-metabolico proposto tra i due tipi di cellule è la capacità degli astrociti di aumentare la loro produzione di ATP in risposta all’attività neuronale6,7,8. Questa ipotesi, conosciuta come astrocito-neurone lattato shuttle (ANLS), è ancora in discussione, perché altri lavori hanno fornito prove che i neuroni possono anche aumentare il proprio tasso di glicolisi in risposta alla stimolazione9,10, riflettendo la necessità di ulteriori metodi e approcci per studiare l’interazione neuro-glia.
Lo studio del metabolismo dell’energia cellulare e dei livelli di ATP nei neuroni e negli astrociti per chiarire le interazioni metaboliche neuro-glia è stato a lungo ostacolato dalla mancanza di sonde adatte per il rilevamento dei cambiamenti nelle concentrazioni di metaboliti nelle cellule viventi nel tessuto cerebrale. L’ultimo decennio, tuttavia, ha fornito un aumento nello sviluppo di nuovi strumenti e nuove sonde fluorescenti geneticamente codificate per diversi metaboliti, tra cui sensori per ATP, lattato, pirattae e altri11,12. Utilizzando questi strumenti, è ora possibile affrontare direttamente le questioni relative al consumo di ATP cellulare e ai cambiamenti nei livelli di energia cellulare a livello di singola cellula e in modo specifico di tipo cellulare nel tessuto cerebrale intatto13.
Nel lavoro attuale, descriviamo una procedura per visualizzare le dinamiche ATP citosoliche su neuroni e astrociti di fette di cervello organotipiche coltivate. Mostriamo come utilizzare vettori virali associati ad eno (AAV) per l’espressione specifica di tipo cellulare del geneticamente codificato ATP-nanosensor ATeam1.03YEMK (14) in neuroni e astrociti di fette di cervello di topo che possono essere mantenuti nella coltura cellulare per diverse settimane15. Viene descritta una procedura su come rimuovere la cicatrice gliali che copre le fette di tessuto coltivato, che migliora l’accessibilità ottica e l’imaging delle cellule negli strati del tessuto organotipipico sottostanti. Infine, viene illustrato come ATeam1.03YEMK può essere utilizzato per eseguire l’imaging basato su FRET dei cambiamenti nei livelli di ATP cellulare in questa preparazione. Questo metodo ospita i principali vantaggi che non richiede procedure chirurgiche del cervello, fornisce alti livelli di espressione del sensore e della specificità del tipo di cellula nelle fette cerebrali coltivate, riducendo l’invasività o lo stress nelle cellule rispetto ad altri metodi, come la trasfezione per elettroporazione o la trasduzione con altri vettori virali10,16,17. Inoltre, questo protocollo può essere applicato ad altri nanosensori basati su FRET, tra cui varianti di ATeam1.03 che forniscono una minore affinità di legame per ATP14.
Qui, dimostriamo una procedura per l’espressione specifica di tipo cellulare di ATeam1.03YEMK, un nanosensore basato su FRET, codificato geneticamente14, per la misurazione dei cambiamenti nei livelli DI ATP negli astrociti o neuroni nelle colture di sezioni di tessuto organotico del cervello del topocervello 15. Nelle registrazioni esemplari, mostriamo che un aumento della concentrazione di potassio extracellulare non si traduce in un cambiamento nelle concentrazioni di ATP nei neuroni, mentre i livelli di ATP astrocitici aumentano in risposta a questa manipolazione. Inoltre, i nostri risultati dimostrano che dopo l’inibizione del metabolismo cellulare, il rapporto ATeam1.03YEMK FRET diminuisce rapidamente in entrambi i tipi di cellule, indicando una rapida diminuzione dell’ATP intracellulare.
L’espressione di ATeam1.03YEMK nelle colture di fette organotipiche richiede il mantenimento del tessuto nella coltura in condizioni controllate per almeno 7-10 giorni. In alternativa, ATeam1.03YEMK può anche essere impiegato per la misurazione dell’ATP in fette di tessuto cerebrale acutamente isolate e nei nervi ottici dei topi13,15. Le misurazioni nel tessuto acutamente isolato, tuttavia, richiedono la generazione di animali transgenici o un’applicazione stereotassica di vettori virali nel cervello, coinvolgendo la sperimentazione animale e rigorosi protocolli di cura degli animali. A questo proposito, l’espressioneYEMK ATeam1.03 nelle colture di fette di tessuto organotipitico rappresenta un’alternativa utile e preziosa22,23. Da molti anni ormai, le colture di fette di tessuto organotipico fungono da sistema modello consolidato per studiare le proprietà neurali, la connettività e lo sviluppo24,25,26. Non solo mantengono l’architettura e la laminazione generale dei tessuti (Figura 1), ma ospitano anche le proprietà preferenziali delle colture cellulari come l’accessibilità superiore e il controllo diretto delle condizioni sperimentali. Le colture di fette di tessuto organitipotico sono anche regolarmente impiegate per esprimere geni estranei utilizzando vettori virali27. Diversi tipi di vettori virali sono stati segnalati per fornire transgeni nel tessuto cerebrale16,28. I vettori adenovirali inducono l’alta espressione nelle cellule gliali, ma non nei neuroni ippocampali16, e potrebbero generare reattività gliale17. Vettori virali associati ad Adeno come qui utilizzati emergono come una buona alternativa15, e la loro efficacia è stata mostrata anche in vivo29.
Mentre utilizzato principalmente per lo studio delle proprietà neuronali, recenti studi hanno stabilito che le colture di fette di tessuto organotipico possono anche essere impiegate per l’analisi degli astrociti. Le sezioni coltivate sono in genere coperte da uno strato di astrociti reattivi19,30 (Figura 5), ma gli astrociti presentano una morfologia e una citoarchitettura più native e non reattive nei livelli più profondi19,30 (Figura 5). Nel presente studio, descriviamo una procedura per la rimozione meccanica della cicatrice gliale esterna, che si traduce in una migliore accessibilità sperimentale e ottica degli astrociti nativi all’interno degli strati di tessuto organotipipico appropriati. Inoltre, la sua rimozione migliora l’efficacia dell’espressione negli strati più profondi delle fette organotipiche; se la cicatrice glialnon viene rimossa, la trasduzione da parte degli AAV potrebbe tendere ad essere limitata agli strati superficiali delle cellule.
Quando si eseguono esperimenti in fette di tessuto, è necessario considerare diversi fattori meccanici esterni. Una variazione nella velocità della perfusione del bagno può indurre movimenti dell’intera preparazione e/o indurre cambiamenti di messa a fuoco, con conseguenti cambiamenti transitori artificiali del segnale del sensore. Inoltre, sia gli astrociti che i neuroni sono stati segnalati per rispondere alla deformazione meccanica come imposta da alti tassi di perfusione32,33. Nelle nostre mani, utilizzando una pompa peristale affidabile, insieme al mantenimento di piccoli e stabili volumi di salina tra il tessuto e l’obiettivo (menisco) si traduce in un segnale FRET stabile in condizioni di base alla velocità di perfusione utilizzata qui (1.5-2.5 mL/min; Figura 8).
Nel presente studio, dimostriamo anche che l’imaging basato su FRET con ATeam1.03YEMK può essere impiegato per monitorare i livelli ATP in neuroni e astrociti. Un mezzo alternativo introdotto in precedenza per la misurazione dell’ATP cellulare è il cosiddetto analisi luciferina-luciferase34,35,36,37. Questo approccio, tuttavia, si basa sull’imaging della bioluminescenza e fornisce solo una risoluzione temporale e spaziale piuttosto bassa in parte a causa dei livelli di rumore di fondo piuttosto elevati. Un altro metodo regolarmente impiegato negli ultimi anni è stato l’imaging di cambiamenti nella concentrazione di magnesio intracellulare utilizzando il fluoroforo sensibile agli ioni38,39,40. Questo approccio si riferisce all’osservazione che un consumo di ATP comporta il rilascio del suo co-fattore di magnesio. L’imaging con colore verde magnesio fornisce quindi solo una stima secondaria dei cambiamenti nei livelli ATP. Inoltre, il colore del magnesio verde è anche sensibile ai cambiamenti nel calcio intracellulare, introducendo un’altra difficoltà nell’interpretare i risultati ottenuti con questo metodo.
Il recente sviluppo di nanosensori geneticamente codificati per l’imaging diretto dei metaboliti cellulari, quindi, ha rappresentato un grande passo avantidi 11,12. Sono stati generati diversi sensori che possono essere impiegati per la misurazione di ATP intracellulare36,41,42,43. Tra questi ci sono l’indicatore ATP fluorescente ratiometrico “QUEEN”41 così come PercevalHR, che rileva il rapporto ATP:ADP42. Mentre quest’ultima sonda è uno strumento prezioso per lo studio dello stato energetico delle cellule, richiede la misurazione simultanea dei cambiamenti nel pH42.
ATeam è un nanosensore di cui esistono diverse varianti, che – tra le altre – differiscono nella loro affinità vincolante per ATP14. In vitro, ATeam1.03YEMK esibisce un Kd di 1,2 mM a 37 , che è vicino ai livelli di ATP cellulare determinati in diversi tipi di cellule neuronali, che vanno da ipotalamo e cervelletto34 a ippocampo37,44,45. Nelle misurazioni della cuvette, l’abbassamento della temperatura di 10 gradi centigradi ha comportato una significativa diminuzione dell’affinità di legame tra ATeam1.03Da YEMK a ATP, suggerendo che potrebbe non essere ideale per l’imaging cellulare a temperaturaambiente 14. Il nostro studio precedente15, tuttavia, ha dimostrato che il comportamento e la risposta di ATeam1.03YEMK espressi in neuroni e astrociti a diverse manipolazioni è simile a temperatura quasi fisiologica e a temperatura ambiente, indicando che il sensore consente la determinazione affidabile dei livelli ATP intracellulare in entrambe le condizioni. Inoltre, i nostri esperimenti precedenti hanno affrontato la sensibilità al pH di ATeam1.03YEMK espressa all’interno delle cellule15,dimostrando che è insensibile ai cambiamenti nel pH intracellulare di circa 0,1-0,2 unità di pH. Se il Kd nella fascia mM bassa è un problema, varianti ATeam alternative potrebbero essere utilizzati14, tra cui varianti in rosso spostato di ATeam (“GO-ATeam”)43.
I nostri esperimenti con ATeam1.03YEMK dimostrano che un aumento della concentrazione extracellulare di potassio di pochi mM solo (da 3 a 8 mM) si traduce in un aumento transitorio del rapporto ATeam1.03YEMK negli astrociti nella coltura delle fette organotipiche. Questa osservazione conferma gli studi precedenti15,46 e indica chiaramente che gli astrociti rispondono al rilascio di potassio da neuroni attivi con un aumento nella loro produzione di ATP, per lo più probabili come conseguenza di una stimolazione del Na–/K-ATPasee il Na–/HCO3– cotrasportoer, rispettivamente47,48. In contrasto con questo, i neuroni non hanno mostrato una risposta, che è in linea con il lavoro precedente pure15. Entrambi i tipi di cellule, tuttavia, hanno reagito rapidamente e fortemente all’inibizione della glicolisi cellulare e della respirazione mitocondriale, come mostrato primadel 15. In condizioni di ischemia chimica, i rapporti ATeam FRET sono scesi a un nuovo livello stabile, indicando un esaurimento nominale dell’ATP cellulare. Quest’ultimo risultato suggerisce che sia i neuroni che gli astrociti presentano un consumo rilevante di ATP anche in condizioni di stato costante senza stimolazione aggiuntiva per attivazione sinaptica o applicazione di neurotrasmettitori. Nel loro insieme, concludiamo che l’imaging basato su FRET con nanosensori geneticamente codificati, tra cui ATeam1.03YEMK,fornirà un approccio prezioso per chiarire i processi cellulari responsabili dei cambiamenti nei livelli di ATP intracellulare e del consumo di ATP cellulare in condizioni diverse.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Claudia Roderigo e Simone Durry per l’assistenza tecnica esperta. Ringraziamo il Dr. Niklas J. Gerkau e M.Sc. Joel Nelson per l’assistenza nella preparazione delle colture di fette organotipiche. La ricerca nel laboratorio dell’autore è stata finanziata dalla German Research Association (DFG; PER 2795: Ro 2327/13-1 e SPP 1757: Ro 2327/8-2 a CRR; e SPP 1757: Finanziamento young Glia Start-Up per RL).
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