マウス前脳の組織図スライス培養における遺伝的にコードされたFRETベースのセンサATeam1.03YEMKの細胞型特異的発現に関するプロトコルについて説明する。さらに、ニューロンおよびアストロサイトにおける細胞ATPレベルの動的イメージングにこのセンサを使用する方法を示す。
中枢神経系の神経活動(CNS)は、アデノシン三リン酸(ATP)の分解によって提供される細胞エネルギーに対する高い需要を呼び起こす。ニューロンの電気的シグナル伝達によって劣化したプラズマ膜全体にイオン勾配を再設置するには、ATPの大きなシェアが必要です。アストロサイトは、高速電気信号自体を生成しない一方で、神経活動に応答してATPの産生を増加させ、それらにエネルギー代謝産物を提供することによって活性ニューロンをサポートするという証拠があります。異なる代謝産物に対する遺伝子コード化されたセンサーの最近の開発は、ニューロンとアストロサイト間のそのような代謝相互作用の研究を可能にするようになりました。ここでは、アデノ関連ウイルスベクター(AAV)を用いたマウス海馬および皮質の組織海馬および皮質の組織組織スライス培養におけるATP感受性蛍光共鳴エネルギー移転(FRET-)センサATeam1.03YEMKの細胞型特異的発現に関するプロトコルについて説明する。さらに、細胞外カリウムの増加や化学虚血の誘導(すなわち、細胞エネルギー代謝の阻害)に際して、ニューロンやアストロサイトにおける細胞ATPレベルの変化を動的に測定するために、このセンサをどのように用いることができるかを実証する。
ニューロンの興奮的な電気活動は、主にその形質膜を横切るナトリウム(Na+)およびカリウム(K+)などのカチオンのフラックスに基づいています。このようにシグナリングには、これら2つのイオンの電気化学的勾配の維持が必要である。これは、細胞Na+/K+-ATPase(NKA)によって達成され、ユビキタスに発現する電気起源膜貫通ポンプであり、細胞外空間から2K+と引き換えに3Na+を細胞から押し出し、輸送サイクル1当たりのATPの1分子の消費を必要とする。NKAに加えて、血漿膜Ca2+-ATPアーゼを含むいくつかの他のATPを消費するイオントランスポーターがあり、これは細胞内Ca2+恒常性およびその輸出に続く活性誘発流入2に不可欠である。シナプス前小胞では、液疱型H+-ATPアーゼ(v-ATPアーゼ)は、このコンパートメント3への神経伝達物質の取り込みに必要なプロトン勾配を作成する。
ニューロンの活性は、このようにATP4のかなりの量を必要としますが、彼らはエネルギーの貯蔵のための重要な容量を示していません。代わりに、彼らは隣接するアストロサイト、脳5の主要なグリコーゲンストアとの代謝相互作用に依存しているようです。星値状グリコーゲンは確かに神経エネルギーの必要性をサポートする上で重要な役割を果たすることが示唆されている;そして、この提案された2つの細胞型間の神経代謝結合における重要な現象は、神経活動6、7、8に応答してATP産生を増加させるアストロサイトの能力である。アストロサイト-ニューロン乳酸シャトル(ANLS)として知られるこの仮説は、他の研究が刺激9、10に応答して糖上昇の独自の速度を増加させるかもしれないという証拠を提供しているので、まだ議論中であり、神経グリア相互作用を研究するためのさらなる方法とアプローチの必要性を反映している。
神経グリア代謝相互作用を解明するニューロンおよびアストロサイトにおける細胞エネルギー代謝およびATPレベルの研究は、脳組織における生細胞における代謝産物濃度の変化の検出に適したプローブの欠如によって長い間妨げられてきた。しかし、過去10年間、ATP、乳酸、ピルビン酸などのセンサーを含む、異なる代謝産物に対する新しいツールと新しい遺伝子コードされた蛍光プローブの開発が急増しました。これらのツールを用いて、細胞ATP消費および細胞エネルギーレベルの変化に関する質問に、単一細胞レベルおよび無傷の脳組織13における細胞型特異的な方法で直接対処することが可能となった。
本研究では、培養組織目細胞のニューロンおよびアストロサイト上の細胞性ATPダイナミクスを可視化する手順について説明する。我々は、数週間15年間細胞培養で維持することができるマウス脳のスライスのニューロンおよびアストロサイトにおいて、遺伝子コードされたATP-ナノセンサATeam1.03YEMK(14)の細胞型特異的発現にアデノ関連ウイルスベクター(AAV)を用いる方法を示す。培養組織スライスを覆うグリア瘢痕を除去する手順について説明し、これは下の組織組織層における細胞の光学的アクセシビリティおよびイメージングを改善する。最後に、ATeam1.03YEMKを使用して、この調製における細胞ATPレベルの変化のFRETベースのイメージングを実行する方法を示します。この方法は、外科的脳の処置を必要としない主な利点をホストし、培養された脳スライスにおけるセンサおよび細胞型特異性の高レベルの発現を提供し、他の方法と比較して細胞内の侵襲性またはストレスを低減し、エレクトロポレーションまたは他のウイルスベクター10、16、17とのトランスフェクションのような。さらに、このプロトコルは、ATP14に対して低い結合親和性を提供するATeam1.03の変異体の中でも、他のFRETベースのナノセンサに適用することができる。
ここでは、マウス脳15の組織スライス培養におけるアストロサイトまたはニューロンにおけるATPレベルの変化を測定するための、FRETベースの遺伝子コード化ナノセンサ14であるATeam1.03YEMKの細胞型特異的発現に関する手順を示す。例示的な記録では、細胞外カリウム濃度の上昇はニューロンのATP濃度の変化をもたらさない一方で、この操作に応答して星値ATPレベルが上昇することを示す。さらに、我々の結果は、細胞代謝の阻害に際して、ATeam1.03YEMK FRET比が両方の細胞型で急速に低下し、細胞内ATPの急速な減少を示す。
組織分スライス培養におけるATeam1.03YEMKの発現は、少なくとも7〜10日間制御された条件下で培養中の組織の維持を必要とする。あるいは、ATeam1.03YEMKは、急性単離脳組織スライスおよびマウス13、15の視神経におけるATPの測定にも採用することができる。しかし、急性単離組織での測定には、トランスジェニック動物の生成やウイルスベクターの脳への立体的な応用が必要であり、動物実験と厳格な動物ケアプロトコルが含まれる。この点に関して、組織組織スライス培養におけるATeam1.03YEMK発現は、有用かつ貴重な代替22、23を表す。長年にわたり、組織組織スライス培養は、神経特性、接続性および発達を研究するための確立されたモデルシステムとして機能する。それらは、一般的な組織アーキテクチャと積層(図1)を維持するだけでなく、優れたアクセシビリティや実験条件の直接制御などの細胞培養物の優遇特性をホストする。組織組織スライス培養物はまた、ウイルスベクター27を用いて外来遺伝子を発現させるために日常的に用いられ得る。いくつかのタイプのウイルスベクターが脳組織16、28にトランスジーンを送り出することが報告されている。アデノウイルスベクターはグリア細胞において高発現を誘導するが、海馬ニューロン16は誘導せず、グリア反応性17を発生させ得る。ここで使用されるアデノ関連ウイルスベクターは、良好な代替15として出現し、その有効性はvivo29においても示されている。
主に神経特性の研究に使用されている一方で、最近の研究では、組織組織スライス培養物もアストロサイトの分析に用いることができることが確立されています。培養スライスは、通常、反応性アストロサイト19、30(図5)の層で覆われているが、アストロサイトはより深層19、30においてよりネイティブで非反応性の形態および細胞構造を示す(図5)。本研究では、外グリア瘢痕の機械的除去の手順を説明し、適切な組織学的組織層内の天然アストロサイトのより良い実験的および光学的アクセシビリティをもたらす。さらに、その除去は、組織図スライスのより深い層における発現の有効性を改善する。グリア瘢痕が除去されない場合、AAVによる伝達は表面的な細胞層に制限される傾向がある。
組織スライスで実験を行う際には、いくつかの外部機械的要因を考慮する必要があります。浴灌流速度の変動は、調製物全体の動きを誘発し、焦点の変化を誘発し、センサー信号の人工的な過渡変化をもたらす可能性があります。また、アストロサイトとニューロンの両方が、高い灌流率32、33によって課されるような機械的変形に応答することが報告されている。私たちの手では、信頼性の高い蠕動ポンプを使用して、組織と目的(メニスカス)の間の小さく安定した量の生理食合いを維持すると共に、ここで使用される灌流速度(1.5-2.5 mL/min;)図 8)。
本研究では、ATeam1.03YEMKを用いたFRETベースのイメージングを用いて、ニューロンおよびアストロサイトのATPレベルをモニタリングするために採用できることも実証した。細胞ATPの測定のために先に導入された代替手段は、いわゆるルシフェリン-ルシフェラーゼアッセイ34、35、36、37である。しかし、このアプローチは生物発光のイメージングに基づいており、バックグラウンドノイズレベルが高いため、かなり低い時間的および空間的な分解能を提供するだけです。近年日常的に採用されている別の方法は、イオン感受性フルオロフォアマグネシウムグリーン38、39、40を用いた細胞内マグネシウム濃度の変化のイメージングであった。このアプローチは、ATPの消費が同因子マグネシウムの放出をもたらすという観察に関連する。マグネシウムグリーンによるイメージングは、ATPレベルの変化の二次的な推定値を提供するだけです。また、マグネシウムグリーンは細胞内カルシウムの変化にも敏感であり、この方法で得られた結果を解釈する際に別の困難を引き起こしている。
細胞代謝産物の直接イメージングのための遺伝子コードされたナノセンサの最近の開発は、したがって、大きな前進11、12を表した。細胞内ATP 36、41、42、43の測定に用いることができるいくつかの異なるセンサが生成された。その中には、比率測定蛍光ATP指標「QUEEN」41とPercevalHRが含まれており、ATP:ADP比42を感知する。後者のプローブは、細胞のエネルギー状態を研究するための貴重なツールですが、pH42の変化を同時に測定する必要があります。
ATeam は、ATP14に対する結合親和性が異なるいくつかのバリアントが存在するナノセンサーです。インビトロでは、ATeam1.03YEMKは、視床下部および小脳34から海馬37、44、45に至るまで、異なる神経細胞型で決定される細胞ATPレベルに近い37°Cで1.2mMのKdを示す。キュベット測定では、温度を10°C下げると、ATeam1.03YEMKとATPの結合親和性が有意に低下し、室温14での細胞イメージングには理想的ではない可能性が示唆された。しかしながら、我々の以前の研究15は、異なる操作に対するニューロンおよびアストロサイトで発現されるATeam1.03YEMKの挙動および応答が生理学的および室温で類似していることを実証し、センサーが両方の条件下で細胞内ATPレベルの確実な決定を可能にすることを示した。さらに、これまでの実験では、細胞15内で発現するATeam1.03YEMKのpH感受性に対処し、細胞内pHの変化に対して約0.1〜0.2pH単位で感受性が低いことが示された。低mM範囲のKdが懸念される場合、代替ATeamバリアントは14を使用する可能性があり、その中でもATeamの赤シフトバリアント(「GO-ATeam」)43 。
ATeam1.03YEMKを用いた実験では、細胞外カリウム濃度が数mM(3~8mM)だけ増加すると、組織図スライス培養におけるアストロサイトにおけるATeam1.03YEMK比が一時的に増加することが実証されています。この観察は、以前の研究15、46を確認し、アストロサイトがATP産生の増加に伴う活性ニューロンによるカリウムの放出に反応することを明確に示し、主にNa + /K+-ATPaseおよびNa+/HCO3–共輸送体の刺激の結果として、それぞれ47、48。これとは対照的に、ニューロンは応答を示さなかったが、これは以前の作品と同様に15.しかしながら、両方の細胞型は、15日前に示すように細胞糖上昇およびミトコンドリア呼吸の阻害に迅速かつ強く反応した。化学虚血の条件下では、ATeam FRET比は新しい安定したレベルに低下し、細胞ATPの名目枯渇を示す。後者の結果は、両方のニューロンとアストロサイトがシナプス活性化または神経伝達物質の適用によって追加の刺激なしに定常状態条件下でもATPの関連する消費を示すことを示唆している。まとめると、遺伝的にコードされたナノセンサを用いたFRETベースのイメージングは、その中でもATeam1.03YEMKが、異なる条件下で細胞内ATPレベルと細胞ATP消費の変化を引き起こする細胞プロセスを解明するための貴重なアプローチを提供すると結論付ける。
The authors have nothing to disclose.
著者たちは、クラウディア・ロデリゴとシモーネ・デュリーに専門家の技術支援を感謝したいと考える。ニクラス・J・ゲルカウ博士とジョエル・ネルソンM.Scは、オルガオティピック・スライス文化の準備に協力してくださったことに感謝します。著者の研究室での研究は、ドイツ研究協会(DFG;2795 の場合: Ro 2327/13-1 および SPP 1757: Ro 2327/8-2 から CRR;SPP 1757: RL へのヤング グリアスタートアップ資金)
2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
Microscope stage | custom build | ||
Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |