Fare ön beyninin organotipik dilim kültürlerinde genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı sensör ATeam1.03YEMK’ın hücre tipi spesifik ekspresyonu için bir protokol tanımladık. Ayrıca, nöronlar ve astrositlerde hücresel ATP düzeylerinin dinamik görüntülemeiçin bu sensörünasıl kullanılacağını gösteriyoruz.
Merkezi sinir sisteminde nöronal aktivite (CNS) adenozin trifosfat (ATP) dökümü tarafından sağlanan hücresel enerji yüksek bir talep çağrıştırıyor. Nöronların elektriksel sinyalizasyonu ile bozulan plazma membranları arasında iyon gradyanları yeniden yüklemek için ATP’nin büyük bir kısmı gereklidir. Astrositlerin – hızlı elektrik sinyalleri üretmeseler de – nöronal aktiviteye yanıt olarak ATP üretiminin arttığını ve onlara enerji metabolitleri sağlayarak aktif nöronları desteklediklerine dair kanıtlar vardır. Farklı metabolitler için genetik olarak kodlanmış sensörlerin son gelişimi artık nöronlar ve astrositler arasındaki bu tür metabolik etkileşimlerin incelenmesini sağlamaktadır. Burada, adeno ile ilişkili viral vektörler (AAV) kullanılarak fare hipokampus ve korteksin organotipik doku dilimi kültürlerinde ATP’ye duyarlı Floresan Rezonans Enerji Transferi(FRET-) sensörü ATeam1.03YEMK’ın hücre tipi spesifik ekspresyonu için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, bu sensörün hücre dışı potasyumdaki artışlar üzerine ve kimyasal iskemiin indüksiyonunu takip ederek nöronlar ve astrositlerdeki hücresel ATP düzeylerindeki değişikliklerin dinamik ölçümü için nasıl istihdam edilebildiğini (yani hücresel enerji metabolizmasının inhibisyonu) nasıl kullanabileceğini gösteriyoruz.
Nöronların uyarıcı elektriksel aktivitesi büyük ölçüde plazma zarları arasında sodyum (Na+) ve potasyum (K+)gibi katyonların akı dayanmaktadır. Bu nedenle sinyalizasyon için bu iki iyonun elektrokimyasal degradelerinin bakımı gereklidir. Bu hücresel Na+/ K+-ATPase (NKA), her yerde ifade elektrojenik transmembran pompa tarafından gerçekleştirilir, hangi ekstrüzyon 3 Na+ hücre dışıuzaydan karşılığında hücre den extrudes , taşımadöngüsü1 başına ATP bir molekülün tüketimini gerektiren 1 . NKA ek olarak, plazma membran Ca2 +-ATPase, hücre içi Ca2 + homeostaz ve aktivite kaynaklıakını2 aşağıdaki ihracat için hayati önem taşımaktadır dahil olmak üzere birkaç diğer ATP tüketen iyon taşıyıcıları vardır. Presinaptik veziküllerde, bir vakuoler tip H+-ATPaz (v-ATPAz) bu bölmeye nörotransmitter alımı için gerekli proton gradyanı oluşturur3.
Nöronların aktivitesi böylece ATP önemli miktarda gerektirir iken4, onlar enerji depolama için önemli bir kapasite sergilemez. Bunun yerine, onlar komşu astrositler ile metabolik etkileşimleri güvenmek gibi görünüyor, beyinde büyük glikojen depoları5. Bu astrositik glikojen gerçekten nöronal enerji ihtiyaçlarının desteklenmesinde önemli bir rol oynadığı ileri sürülmüştür; ve iki hücre türleri arasında bu önerilen nöro-metabolik bağlantı önemli bir fenomen nöronal aktivite ye yanıt olarak ATP üretimini artırmak için astrositkapasitesi6,7,8. Bu hipotez, astrosit-nöron laktat mekiği olarak bilinen (ANLS), diğer çalışmalar da uyarılma yanıt olarak glikolikendi oranını artırabilir kanıt sağlamıştır çünkü9,10, nöro-glia etkileşimi çalışma için daha fazla yöntem ve yaklaşımların gerekliliğini yansıtan.
Nöro-glia metabolik etkileşimleri açıklamak için nöronlar ve astrositlerde hücresel enerji metabolizması ve ATP düzeylerinin araştırılması uzun beyin dokusunda yaşayan hücrelerde metabolit konsantrasyonlarında değişikliklerin tespiti için uygun probların eksikliği tarafından engel olmuştur. Son on yılda, ancak, atp, laktat, pirüuvat ve diğerleri için sensörler de dahil olmak üzere farklı metabolitleri için yeni araçlar ve yeni genetiği kodlanmış floresan probların geliştirilmesinde bir dalgalanma sağlamıştır11,12. Bu araçları kullanarak, hücresel ATP tüketimi ve tek hücre düzeyinde hücresel enerji düzeylerindeki değişiklikler ve bozulmamış beyindokusu13hücre tipi özel bir şekilde ilgili sorulara doğrudan hitap etmek mümkündür.
Bu çalışmada, kültürlü organotipik beyin dilimlerinin nöronlar ve astrositleri üzerinde sitosolik ATP dinamiklerini görselleştirmek için bir prosedür açıklıyoruz. Biz genetik olarak kodlanmış ATP-nanosensor ATeam1.03YEMK (14) nöronlar ve birkaç hafta hücre kültüründe hücre kültüründe tutulabilir fare beyin dilimleri astrositler hücre tipi özel ifade için adeno ilişkili viral vektörler (AAV) nasıl istihdam göstermek15. Kültürlü doku dilimlerini kapsayan glial yaranın nasıl giderilenin bir prosedürü tanımlanmıştır, bu da altındaki organotipik doku katmanlarındaki hücrelerin optik erişilebilirliğini ve görüntülenmesini geliştirir. Son olarak, ATeam1.03YEMK’nin bu hazırlıkta hücresel ATP düzeylerindeki değişikliklerin FRET tabanlı görüntülemesini gerçekleştirmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Bu yöntem cerrahi beyin prosedürleri gerektirmez önemli avantajları barındırır, kültürlü beyin dilimleri sensör ve hücre tipi özgüllük yüksek düzeyde sağlar, diğer viral vektörler ile elektroporasyon veya transdüksiyon ile transfeksiyon gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında hücrelerde invazivlik veya stresi azaltarak10,16,17. Buna ek olarak, bu protokol atp14için daha düşük bağlama afinitesi sağlayan ATeam1.03 türevleri arasında diğer FRET tabanlı nanosensörler uygulanabilir.
Burada, ATeam1.03YEMKhücre tipi özel ifade için bir prosedür göstermek , bir FRET tabanlı, genetik olarak kodlanmış nanosensor14, fare beyninin organotipik doku dilimi kültürlerde astrosit veya nöronlarda ATP düzeylerinde değişikliklerin ölçümü için15. Örnek kayıtlarda, hücre dışı potasyum konsantrasyonundaki artışın nöronlardaki ATP konsantrasyonlarında bir değişikliğe yol açmadığını, astrositik ATP düzeylerinin ise bu manipülasyona yanıt olarak yükseldiğini gösteriyoruz. Ayrıca, sonuçlarımız hücre metabolizmasının inhibisyonu üzerine, ATeam1.03YEMK FRET oranının her iki hücre tipinde de hızla düştüğünü ve hücre içi ATP’de hızlı bir düşüş olduğunu göstermektedir.
Organotipik dilim kültürlerinde ATeam1.03YEMK ifadesi en az 7-10 gün kontrollü koşullarda kültürde doku bakımı gerektirir. Alternatif olarak, ATeam1.03YEMK da akut izole beyin dokusu dilimleri ve farelerin optik sinirlerde ATP ölçümü için istihdam edilebilir13,15. Ancak akut izole dokudaki ölçümler, transgenik hayvanların neslini veya viral vektörlerin beyne stereotaktik bir şekilde uygulanmasını, hayvan deneyleri ve sıkı hayvan bakım protokollerini içerir. Bu bağlamda, organotipik doku dilimi kültürlerde ATeam1.03YEMK ifadesi yararlı ve değerli bir alternatif22,23temsil eder. Uzun yıllardır, organotipik doku dilimi kültürleri nöral özellikleri, bağlantı ve geliştirme24,25,26çalışma için kurulmuş bir model sistemi olarak hizmet vermektedir. Onlar sadece genel doku mimarisi ve laminasyon korumak değil(Şekil 1),aynı zamanda üstün erişilebilirlik ve deneysel koşulların doğrudan kontrolü gibi hücre kültürlerinin tercihli özellikleri ev sahipliği. Organotipik doku dilimi kültürleri de rutin viral vektörler27kullanarak yabancı genleri ifade etmek için istihdam edilmektedir. Viral vektörler çeşitli beyin dokusu içine transgenler teslim bildirilmiştir16,28. Adenoviral vektörler glial hücrelerde yüksek ekspresyon indükler, ama hipokampal nöronlar16değil , ve glial reaktivite üretebilir17. Burada kullanılan Adeno ilişkili viral vektörler iyi bir alternatif olarak ortaya15, ve bunların etkinliği de in vivo29gösterilmiştir .
Esas olarak nöronal özelliklerin incelenmesinde kullanılırken, son çalışmalar da astrositlerin analizi için organotipik doku dilimi kültürleri istihdam edilebilir olduğunu ortaya kurduk. Kültürlü dilimler genellikle reaktif astrositler bir tabaka ile kaplıdır19,30 (Şekil 5),ancak astrositler daha yerli, non-reaktif morfoloji ve sitomimari daha derin katmanlarda sergiler19,30 ( Şekil5). Bu çalışmada, dış glial skar mekanik kaldırma için bir prosedür tarif, hangi uygun organotipik doku katmanları içinde yerli astrositlerin daha iyi deneysel ve optik erişilebilirlik ile sonuçlanır. Ayrıca, kaldırılması organotipik dilimlerin daha derin katmanlarında ifade etkinliğini artırır; glial yara izi çıkarılmazsa, AEV’lerin transdüksiyonu yüzeysel hücre tabakaları ile sınırlı olabilir.
Doku dilimleri üzerinde deneyler yaparken çeşitli dış mekanik faktörlerin göz önünde bulundurulması gerekir. Banyo perfüzyon hızındaki bir değişim tüm hazırlık hareketlerini tetikleyebilir ve/veya odak değişikliklerine neden olabilir ve sensör sinyalinin yapay geçici değişikliklerine neden olabilir. Ayrıca, hem astrositler ve nöronlar gibi yüksek perfüzyon oranları 32 tarafından empoze mekanik deformasyona yanıt bildirilmiştir32,33. Elimizde, güvenilir bir peristaltik pompa kullanarak, doku ve amaç (menisküs) arasında tuzlu küçük ve kararlı hacimleri korumak ile birlikte burada kullanılan perfüzyon hızı (1.5-2.5 mL/dk) temel koşullar altında istikrarlı bir FRET sinyali ile sonuçlanır; Şekil 8).
Bu çalışmada, aTeam1.03YEMK ile FRET tabanlı görüntüleme nöronlar ve astrositlerde ATP düzeylerini izlemek için istihdam edilebilir olduğunu göstermektedir. Hücresel ATP ölçümü için daha önce tanıtılan alternatif bir araç sözde luciferin-luciferase assay34,35,36,37. Bu yaklaşım, ancak, biyolüminesans görüntüleme dayanmaktadır ve sadece kısmen yüksek arka plan gürültü düzeyleri nedeniyle oldukça düşük zamansal ve mekansal çözünürlük sağlar. Son yıllarda rutin olarak kullanılan bir diğer yöntem de iyona duyarlı florofor magnezyumyeşili 38,39,40kullanarak hücre içi magnezyum konsantrasyonundaki değişikliklerin görüntülenmesiydi. Bu yaklaşım, ATP tüketiminin ortak faktörlü magnezyumsalınımına yol açan gözlemle ilgilidir. Magnezyum yeşili ile görüntüleme, atp düzeylerindeki değişikliklerin sadece ikincil bir tahminini sağlar. Ayrıca, magnezyum yeşili de hücre içi kalsiyum değişikliklere duyarlı, bu yöntem ile elde edilen sonuçları yorumlarken başka bir zorluk tanıtAn.
Hücresel metabolitlerin doğrudan görüntüleme için genetik kodlanmış nanosensörlerin son gelişme, bu nedenle, ileriye doğru büyük bir adım temsil11,12. Hücre içi ATP36,41,42,43ölçümü için kullanılabilir birkaç farklı sensörler oluşturuldu. Bunlar arasında oranmetrik floresan ATP göstergesi “QUEEN”41 yanı sıra PercevalHR, hangi ATP algılar:ADP oranı42. İkinci sonda hücrelerin enerji durumunun incelenmesi için değerli bir araç olsa da, pH42’dekideğişikliklerin eşzamanlı olarak ölçülmesini gerektirir.
ATeam çeşitli varyantları var olan bir nanosensor, hangi – diğerleri arasında – ATP14için bağlayıcı yakınlık farklıdır. In vitro, ATeam1.03YEMK 37 °C’de 1.2 mM Kd sergiler, hipotalamus ve serebellum 34 hipokampus37 arasında değişen farklı nöronal hücre tiplerinde belirlenen hücresel ATP düzeylerine yakın, hipotalamus37,44,45. Cuvette ölçümlerinde sıcaklığın 10 °C düşürülmesi, ATeam1.03YEMK’ın ATP’ye olan bağlanma yakınlığında önemli bir azalmaya yol açarak,14numaralı oda sıcaklığında hücresel görüntüleme için ideal olmayabileceğini düşündürmektedir. Daha önceki çalışmamız15,ancak, davranış ve yanıt ATeam1.03YEMK farklı manipülasyonlar nöronlar ve astrositler ifade benzer fizyolojik ve oda sıcaklığında, sensör her iki koşulda hücre içi ATP düzeylerinin güvenilir belirlenmesine olanak sağladığını gösteren gösterdi. Buna ek olarak, daha önceki deneylerimizde ATeam1.03YEMK’ın pH duyarlılığıelealınmıştır. Düşük mM aralığındaKi Kd bir sorun sayılsa, alternatif ATeam varyantları14kullanılabilir , bunların arasında ATeam’in kırmızı vitesli varyantları (“GO-ATeam”)43.
ATeam1.03YEMK kullanarak yapılan deneyler, ekstrasellüler potasyum konsantrasyonunda sadece birkaç mM (3-8 mM) artış, organotipik dilim kültüründeki astrositlerde ATeam1.03YEMK oranında geçici bir artışa yol açtığını göstermektedir. Bu gözlem önceki çalışmalarda doğrular15,46 ve açıkça astrositler aktif nöronlar tarafından atp üretiminde bir artış ile potasyum salınımına yanıt gösterir, çoğunlukla Na bir uyarılma sonucu muhtemel+/ -ATPase ve Na+/ HCO3– cotransporter, sırasıyla47,48. Bunun aksine, nöronlar bir yanıt göstermedi, hangi önceki çalışma ile uyumlu da15. Her iki hücre tipi, ancak, hızlı ve güçlü hücresel glikoliz ve mitokondriyal solunum inhibisyonu için tepki15önce gösterildiği gibi . Kimyasal iskemi koşulları altında, ATeam FRET oranları hücresel ATP nominal tükenmesi gösteren, yeni bir istikrarlı seviyeye düştü. İkinci sonuç hem nöronlar hem de astrositler de sinaptik aktivasyon veya nörotransmitterlerin uygulanması ile ek uyarılma olmadan sabit devlet koşulları altında ATP ilgili bir tüketim sergilemek düşündürmektedir. Birlikte ele alındığında, genetik olarak kodlanmış nanosensörler ile FRET tabanlı görüntüleme, aralarında ATeam1.03YEMK,farklı koşullar altında hücre içi ATP düzeyleri ve hücresel ATP tüketimi değişiklikleri sorumlu hücresel süreçleri açıklamak için değerli bir yaklaşım sağlayacaktır sonucuna varıyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar uzman teknik yardım için Claudia Roderigo ve Simone Durry teşekkür etmek istiyorum. Dr. Niklas J. Gerkau ve M.Sc. Joel Nelson’a organotipik dilim kültürlerin hazırlanmasında yardımcı olan yardımcılarından dolayı teşekkür ederiz. Yazarın laboratuvarındaki araştırmalar Alman Araştırma Birliği (DFG) tarafından finanse edildi; 2795 İçİn: Ro 2327/13-1 ve SPP 1757: Ro 2327/8-2 CRR için; ve SPP 1757: Genç Glia Start-Up rl finansman).
2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
Microscope stage | custom build | ||
Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |