Summary
우리는 3개의 간단한 시험관내 분석-장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석, 및 화학-유도 분석-인간 줄기 세포 유래 의 기능을 집합적으로 평가하는 시험관 내 외 내피 세포 및 그들의 GABAergic 인터 뉴런과 상호 작용.
Abstract
신경계 발달과 뇌 질환의 병인학에서 뇌 혈관의 역할은 점점 더 주목받고 있습니다. 우리의 최근 연구는 혈관 세포의 특별한 인구를 확인했다, 심실 내피 세포, 그 배아 발달 동안 전뇌 GABAergic 인터뉴런의 마이그레이션 및 분포에 중요한 역할을. 이것은, 그들의 세포 자율 기능과 더불어, 정신 분열증, 간질 및 자폐증 같이 신경 정신병학 무질서의 병리에 있는 심실 내피 세포의 새로운 역할을 암시합니다. 여기에서, 우리는 집합적으로 상피실 내피 세포의 기능 및 GABAergic interneurons와의 그들의 상호 작용을 평가하는 3개의 다른 시험관내 검문학을 기술했습니다. 이러한 검소의 사용, 특히 인간의 맥락에서, 우리는 심실 내피 세포와 뇌 질환 사이의 링크를 식별 할 수 있습니다. 이 어설션은 간단하고, 저렴하며, 재현 가능하며, 모든 부착 세포 유형에 쉽게 적응할 수 있습니다.
Introduction
내피 세포는 혈관의 안대기를 형성하고 혈관 벽 투과성의 유지 보수, 혈류 조절, 혈소판 응집 및 새로운 혈관형성을 포함하는 중요한 기능을 중재합니다. 뇌에서, 내피 세포는 단단히 뇌와 혈류 량 사이의 물질의 교환을 제어하는 중요한 혈액 - 뇌 장벽의 일부를 형성1. 지난 10 년간 우리의 연구는 두뇌 발달및행동2,3,4,5를위한 중요한 연루가 있는 두뇌 내피 세포의 새로운 신경성 역할을 확인했습니다 . 우리는 마우스 배아 전뇌가 해부학, 기원 및 발달 프로필2에서다른 혈관, pial 혈관 및 심실 혈관의 두 가지 별개의 특수형에 의해 혈관화되는 것으로 나타났습니다. 이 2개의 혈관 특수형을 일렬로 세우는 내피 세포는 그들의 유전자 발현 단면도에 있는 명백한 다름을 보여줍니다. 피알 내피 세포는 주로 염증 및 면역 반응과 관련된 유전자를 발현하는 반면, 내피 세포는 신경 발생, 신경 이동, 화학변증 및 축세포유도와일반적으로 연관된 유전자의 발현에서 유일하게 풍부하다. 심실 내피 세포는 또한 전통적인 신경 GABA 신호 통로에서 구별되는 새로운 GABA 신호 통로를 수용5. 그것의 유전자 발현과 수반, 상외 내피 세포는 개발 신피질에서 GABAergic 인터뉴런의 이동 및 분포를 조절하는 것으로 나타났다. 배아 발달 동안, 심실 내피 세포는 심실 혈관 네트워크2,3을확립하기 위해 복부 등쪽 구배를 따라 장거리 이동을 겪는다. 이 철새 경로는 하루 후 인터뉴런에 의해 미러됩니다. 인터뉴런을 이동하는 것은 미리 형성된 심실 혈관 네트워크와 물리적으로 상호 작용하고 신피질에서 최종 목적지에 도달하기 위한 가이드레일로 사용합니다. 물리적 기질로 작용하는 것 이외에, 상피내피 세포는 뉴런을 이동하기위한 탐색 단서의 소스 역할을합니다. 상피 내피 세포 분비 GABA는 인터 뉴런 마이그레이션을 안내하고 최종 분포 패턴을 조절4. 인터뉴런 이동 및 분포의 결함은 자폐증, 간질, 정신 분열증 및 우울증6,7,8,9,10과같은 신경 정신 장애와 관련이 있습니다. 따라서, 상복부 내피 세포 기능의 연구와 인간의 맥락에서 인터 뉴런 이동에 미치는 영향은 이러한 장애의 발병 기전을 해결하기위한 중요하게된다.
우리 실험실11에서인간 배아 줄기세포로부터 인간 심상외형 내피세포를 생성하였을 때, 유도된 만능 줄기세포(iPSC) 기술12,13을이용하여 생성하였다. 인간 심상외 외 피실 내피 세포가 마우스 심구 내피 세포를 충실하게 모방하는지 확인하고, 간 신경 세포 이동에 미치는 영향을 정량적으로 평가하기 위해, 우리는 세 가지 시험관 내 분석분석( 장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석 및 화학 적 매력 분석)을 개발했습니다. 여기에서 우리는 이 분석에 대한 프로토콜을 자세히 기술합니다. 세 가지 모든 측정법은 실리콘 배양 인서트의 사용을 기반으로 세포가 없는 공간으로 둘러싸인 작은 직사각형 세포 패치(고정 치수)를 생성합니다. 마이그레이션 거리는 0일째에 설명된 직사각형 패치의 테두리로부터 셀의 최종 위치 사이의 거리를 측정하여 평가됩니다. 장거리 이동 분석에서, 인간 심실 내피 세포는 35 mm 접시의 중심에 패치로 시드되고, 오랜 시간 동안 세포에 의해 이동된 거리가 계산된다. 공동 배양 이동 분석에서, 인간 심실 내피 세포는 35 mm 접시에 하나의 패치로 인간 인터뉴런과 공동 시드된다. 이 설치는 interneurons의 이동의 비율에 이 두 세포 모형의 직접적인 물리적 상호 작용의 효력의 시험을 허용합니다. 화학 적 매력 분석 인간 심구 내피 세포에 의해 분비 된 화학 매력적인 단서에 대한 응답으로 인터 뉴런의 이동을 측정합니다. 인터뉴런은 직사각형 패치로 시드되고, 인간 심상 외 내피 세포와 함께 양쪽에 비슷한 크기의 패치로 시드된 비-심실 내피 세포를 제어합니다. 각 세포 패치는 500 μm의 세포 없는 간격에 의해 분리됩니다. interneurons의 반응은 비-periventricular 내피 세포를 대조하기 위하여 비교된 심실 내피 세포로 이동한 세포의 수를 정량화해서 평가됩니다.
이 해약은 인간 periiicular 내피 세포 기능및 interneuron 이동에 대한 그들의 영향의 강력한 평가를 제공합니다. 새로운 장거리 분석 및 공동 배양 이동 분석법은 센티미터(~1-1.5cm) 범위의 무세포 공간을 제공하여 장거리 이동을 감지할 수 있도록 합니다. 다른 인기 있는 어세이에 비해 당사의 검사의 특징에 대한 요약은 표 1에제시되어 있다. 집합적으로, 여기에서 기술된 계산은 정신 분열증, 자폐증 또는 간질 같이 두뇌 무질서의 iPSCs에서 생성된 "병든" 내피 내피 세포 및 interneurons를 평가하기 위한 발판으로 봉사할 것입니다. 이 계산은 또한 어떻게 다른 조건 (예를 들면 억제제, 리간드, RNAi)가 세포 이동에 영향을 미치는지 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 마지막으로, 이 측정은 장거리 이동, 화학 적 인매력 또는 세포 매개 이동을 측정하기 위하여 그밖 세포 모형을 위해 최적화될 수 있습니다.
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Protocol
1. 인간 심구 내피 내피 세포의 배양 및 저장
- 지하 막 매트릭스 코팅에 인간 상피 내피 세포를 유지 (재료의 표참조) 아구실 내피 세포 배지에서 6 웰 플레이트 (E6 배지 를 포함하는 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 및 5 μM GABA) 37 °C 및 5%CO2. 매일 번갈아 매체를 변경합니다.
- 4°C에서 지하 멤브레인 매트릭스를 해동하고, 차가운 DMEM/F12 배지에서 희석하여 1:100 용액을 만든다. 매트릭스 용액 1 mL로 6 웰 플레이트의 각 우물을 코팅하십시오. 사용 전에 적어도 1 시간 동안 37 °C에서 플레이트를 배양하십시오.
- 인간의 피실 내피 세포가 80%-90%의 합류에 도달할 수 있도록 하십시오. 우물에서 배지를 흡인합니다. 우물 당 멸균 1x PBS 1 mL로 우물을 한 번 씻으소서.
- 잘 당 1 mL의 세포 해리 액을 추가하여 세포를 분리합니다 (재료 표참조). 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 5 분 후, 상피 내피 세포 배지 1 mL를 추가하십시오. 셀 용액을 15 mL 원엽 튜브로 옮김.
참고 : 우리는 섹션 3과 4에서 TrypLE반대로, 여기에 세포 해리에 대한 Accutase를 사용합니다. - 원심분리기 세포는 실온에서 5분 동안 5분 동안, 상월체를 흡인하고 상피내심 세포 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 재중단한다.
- trypan 파란색 제외 방법을 사용하여 라이브 셀을 계산합니다. 1.2 x 105 세포 /cm2의밀도로 신선한 매트릭스 코팅 플레이트의 종자 세포. 37 °C 및 5 %CO2에서배양하십시오.
- 동결 배지에서 냉동 보존하여 인간 심상 외 피내피 세포를 저장합니다 (90 % 내피 내피 세포 배지 및 10 % DMSO).
- 위의 1.3 단계 및 1.4 단계에 따라 세포를 해리하고 수집합니다. 트라이판 블루 배제 방법으로 용액의 셀을 카운트합니다.
- 실온에서 5 분 동안 500 x g의 원심 분리전 세포. 상급체를 흡인하고 동결 배지의 5 x 106 세포 / mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
- 냉동 배지 와 극저온 당 세포 1 mL을 분배하십시오. 바이알을 이소프로판올 충전 챔버에 놓고 1°C/min에서 -80°C에서 하룻밤 동안 식힙니다.
2. 분석에 대한 인간의 심실 내피 세포의 준비
- 인간의 피실 내피 세포가 70%-80% 동률에 도달할 수 있도록 하십시오.
- 전술한 바와 같이 1.3~ 1.5단계에 따른 세포를 해리한다. 트라이판 블루 제외 방법을 사용하여 셀을 계산합니다.
3. 분석에 대 한 인간의 GABAergic 인터뉴런의 준비
참고: 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)-유래 GABAergic 인터뉴런 및 뉴런 배지를 상업적으로 구입하였다(물질표참조). 뉴런은 제조사에 의해 개발된 프로토콜에 따라 인간 섬유아세포 유래 iPSC 라인을 분화시킴으로써 생성된다. 세포를 해동하고 제조자의 프로토콜에 따라 배양하였다.
- 인간 GABAergic interneurons를 해동 하 고 70%-80%의 합류에 2 주 동안 12 잘 플레이트에서 그들을 배양.
- 분석의 날에, 따뜻한 세포 해리 액 (재료 표참조) 및 사용 하기 전에 10 분 동안 37°C에서 신경 배지의 aliquot.
- 세포를 함유하는 각각의 웰로부터 배지를 흡인한다. 잘 당 멸균 1x PBS의 1 mL로 세포를 씻어.
- 웰당 0.5 mL의 미리 온화된 해리액을 첨가하여 세포를 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양하였다. 15 mL 원엽 튜브로 셀 솔루션을 전송합니다. 세포 덩어리를 해리하기 위해 부드럽게 삼중화.
- 원심분리기 세포는 실온에서 5분 동안 380 x g에서, 상월체를 흡인하고 1 mL의 뉴런 배지에서 세포 펠릿을 재중단한다. trypan 파란색 제외 방법을 사용하여 라이브 셀을 계산합니다.
4. 분석에 대한 제어 인간의 내피 세포의 준비
참고: 제어 인간 iPSC 유래 내피 세포 및 내피 세포 배지를 상업적으로 구입하였다(표의 물질). 이러한 내피 세포는 제조자에 의해 개발된 프로토콜에 따라 인간 섬유아세포 유래 iPSC 라인을 내피 운명으로 분화시킴으로써 생성된다. 세포를 해동하고 제조자의 프로토콜에 따라 Fibronectin 기판상에서 배양하였다. Fibronectin 코팅 플레이트는 제조업체의 프로토콜에 따라 제조되었다.
- 해동 제어 인간 내피 세포및 배양 6-웰 플레이트80%-90%의 컨플루엔성.
- 분석의 날에, 따뜻한 세포 해리 액 (재료 표참조) 및 사용 하기 전에 10 분 동안 37°C에서 내피 배지의 aliquot.
- 세포를 함유하는 각각의 웰로부터 배지를 흡인한다. 잘 당 멸균 1x PBS의 1 mL로 세포를 씻어.
- 웰 당 미리 온난화 된 해리 액0.5 mL를 추가하여 세포를 분리합니다. 실온에서 5 분 동안 배양. 해리 용액을 중화시키기 위해 잘 당 내피 세포 배지 1 mL를 추가하십시오. 15 mL 원엽 튜브로 셀 솔루션을 전송합니다.
- 실온에서 5 분 동안 200 x g의 원심 분리전 세포. 흡위하 및 내피 세포 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 재중단한다. trypan 파란색 제외 방법을 사용하여 라이브 셀을 계산합니다.
5. 원웰 컬쳐 인서츠 준비
- 실온에서 또는 4°C에서 하룻밤 동안 1 mg/mL 라미닌 용액을 해동합니다.
- 0.01 % 폴리 L-오르니틴 용액 (접시 당 1 mL)으로 적절한 수의 35mm 접시를 코팅하십시오. 적어도 1 시간 동안 실온에서 접시를 배양하십시오.
- 1 mg/mL 라미닌 용액 1:300을 멸균수에서 사용 직전에 3.3 μg/mL의 최종 농도로 희석하십시오.
- 각 요리에서 폴리-L-오르니틴을 완전히 흡인합니다. 각 접시를 멸균수로 3배 철저히 헹구고 폴리-L-오르니틴 유발 세포 독성을 피하기 위해 완전히 흡인합니다.
- 각 접시에 3.3 μg/mL 라미닌 용액 1mL를 넣고 밤새 37°C 또는 적어도 1시간 동안 배양하십시오.
참고: 또는 라미닌 함유 접시를 4°C에 보관하십시오. 사용하기 전에 37°C 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 평형화하였다. - 2웰 실리콘 배양 삽입물의 1면의 3면을절단(도 1A)을이용하여 멸균 블레이드를 사용하여 원웰 인서트를 생성한다(도1B).
참고: 2웰 인서트를 원래 포장의 표면에 단단히 부착하고 절단하여 매끄러운 절단을 보장하고 인서트를 접착성을 보호합니다. - 접시에서 흡인 라미닌 용액.
참고 : 라미닌 배양 후 멸균 PBS 또는 물로 설거지 마십시오. 젖은 표면은 배양 삽입물의 단단한 접착을 방지합니다. - 멸균 핀셋으로 원웰 인서트를 제거하고 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 접시의 중앙에 놓습니다. 인서트 가장자리를 따라 눌러 접시 표면에 고정합니다.
- 접시를 거꾸로 뒤집어 서 인서트가 단단히 부착되었는지 확인하십시오.
- 접시를 거꾸로 유지하고 초미세 팁이 있는 영구 블랙 마커를 사용하여 인서트 구획의 경계를 표시합니다(그림1C).
6. 장거리 이주 분석
- 의 농도에서 인간의 GABAergic 인터 뉴런을 일시 중단 3 x 104 세포/70 신경 매체의 μL. 종자 70 μL의 세포 용액은 각 원웰 배양 삽입물 내부에 있다.
참고: 인터뉴런의 파종 밀도는 제조업체의 권장 사항에 따라 다수 입니다. - 인간 심상 외 외 외 피 세포의 농도에서 중단 3 x 104 세포/70 초심실 내 피 세포 매체의 70 μL. 종자 70 μL의 세포 용액은 각 원웰 배양 삽입물 내부에 있다.
참고 : 인간 심실 내피 세포의 수는 시드 뉴런의 수와 1 :1 비율로 시드. - 뉴런 접시에 1 mL의 뉴런 배지를 추가하여 삽입 주위 의 영역을 채우고 코팅이 건조되는 것을 방지합니다. 유사하게, 상피내피 세포 접시에 상피내피 세포 배지 1 mL를 추가합니다.
참고: 인서트가 방해받지 않도록 접시 가장자리를 따라 중간 을 천천히 추가합니다. - 현미경으로 확인하여 세포가 삽입 구획에서 새지 않는지 확인합니다.
- 37°C 및 5%CO2에서24시간 동안 세포를 배양한다. 24 시간 배양 후 현미경으로 확인하여 세포가 제대로 부착되었는지 확인하고 밤새 누출이 없는지 확인하십시오.
- 48시간 의 시딩 후 멸균 트위저를 사용하여 인서트를 부드럽게 제거합니다. 현미경으로 확인하여 세포층이 방해받지 않고 남아 있는지 확인합니다(0일째).
- 뉴런 접시에서 배지를 제거하고 신선한 뉴런 배지 1 mL을 추가합니다. 유사하게, 피실 내피 세포 접시에서 배지를 제거하고 신선한 심실 내피 세포 배지 1 mL을 추가합니다.
참고: 필요한 수의 요리를 따로 떼어 놓고 0일 이미지에 대해 4% PFA로 수정하십시오. - 37°C 및 5%CO2에서5일 동안 세포를 배양한다. 5 일 후, 배지를 제거하고 10 분 동안 4 % PFA로 세포를 고정하고 1 x PBS로 3 x를 씻으하십시오.
- 항인간 β-투불린 또는 항인간 MAP2 항체를 가진 스테인드 뉴런, 및 항인간 CD31 항체를 가진 내피 세포. 면역 염색이 끝나면 각 접시에 안티 페이드 장착 매체 1 mL을 추가하십시오.
7. 공동 문화 이주 분석
- 공동 중단 3 x 104 GABAergic 인터뉴런 과 3 x 104 인간 심실 내피 세포 70 공동 배양 배지의 μL (GABA없이 50% 심낭 유지 매체 및 50% 신경 배지). 원웰 인서트를 내부로 이 셀 용액을 시드합니다. 적절한 수의 분석 요리를 준비합니다.
참고: GABA는 이동에 외인성 GABA의 효과 제외 하기 위해 공동 배양 매체에 추가 되지 않았습니다. - 현미경으로 확인하여 세포가 삽입 구획에서 새지 않는지 확인합니다.
- 코팅이 건조되는 것을 방지하기 위해 접시 의 측면을 따라 1 mL의 공동 배양 매체를 천천히 추가하십시오.
참고: 인서트가 방해받지 않도록 접시 가장자리를 따라 중간 을 천천히 추가합니다. - 제1 대조군으로서, 종자 3 x 104 인간 GABAergic 인터뉴런은 1웰 삽입당 70 μL의 공동 배양 배지에서만. 그러한 요리의 적절한 수를 준비합니다.
- 제2 대조군으로서, 공동 시드 3 x 104 GABAergic 인간 인터뉴런과 3 x 104 대조군 인간 내피 세포를 1-웰 삽입당 70 μL의 공동 배양 배지로 대조한다. 적절한 수의 요리를 준비합니다.
- 37 °C 및 5 %CO2에서24 시간 동안 요리를 배양하십시오. 24 시간 배양 후 현미경으로 확인하여 세포가 제대로 부착되어 누출이 없는지 확인하십시오.
- 48시간 의 시딩 후 멸균 트위저를 사용하여 인서트를 부드럽게 제거합니다. 현미경으로 확인하여 세포층이 방해받지 않았는지 확인합니다(0일째).
- 중간 을 제거하고 신선한 공동 배양 매체 1 mL을 추가합니다.
참고: 0일차 이미지를 획득하기 위해 적절한 수의 요리를 따로 두십시오. - 37°C 및 5%CO2에서5일 동안 세포를 배양한다.
- 5 일 후, 배지를 제거하고 10 분 동안 4 % PFA로 세포를 고정하고 1 x PBS로 3 x를 씻으하십시오.
- 항-인간 β-투불린 또는 항인간 MAP2 항체로 염색하여 뉴런에 라벨을 붙인다. 면역 염색이 끝나면 각 접시에 안티 페이드 장착 매체 1 mL을 추가하십시오.
8. 화학 매력 분석
- 멸균 핀셋을 사용하여 폴리 L-오르니틴/라미닌 코팅 된 35mm 접시의 중앙에 3 웰 배양 인서트를 놓습니다.
- 접시를 거꾸로 뒤집습니다. 매우 미세한 팁이 있는 영구 검정 마커를 사용하여 인서트 의 중간 구획 주위의 경계를 표시합니다.
- 종자 3 x 104 뉴런 배지의 중간 구획에서 인간 GABAergic 인터뉴런(그림 3A).
- 종자104 인간 심낭 내피 세포는 각각 2개의 외부 구획에서 70 μL의 내피 세포 배지에서 내피 내피 세포 배지의 70 μL및 104 대조군 내피 세포의 70 μL에서 의 내피 세포의 70 μL에서 의 내피 내피 세포이다(도3A).
- 접시 측면에 1 mL의 공동 배양 배지 (GABA없이 50 % periventricular 유지 보수 매체 및 50 % 신경 배지)를 추가하여 접시에 코팅이 건조되는 것을 방지합니다.
- 현미경으로 확인하여 세포가 삽입 구획에서 새지 않는지 확인합니다.
- 37°C 및 5%CO2에서24시간 동안 세포를 배양한다. 24 시간 배양 후 현미경으로 확인하여 세포가 제대로 부착되어 누출이 없는지 확인하십시오.
- 48시간 의 시딩 후 멸균 트위저를 사용하여 인서트를 부드럽게 제거합니다. 현미경으로 확인하여 세포층이 방해받지 않았는지 확인합니다(0일째).
- 중간 을 제거하고 신선한 공동 배양 매체 1 mL을 추가합니다.
참고: 0일차 이미지에 필요한 수의 요리를 따로 두십시오. - 37°C및 5%CO2에서36시간 동안 세포를 배양한다. 36 시간 후, 흡인 매체, 10 분 동안 4 % PFA로 세포를 고정하고 1x PBS로 3 x를 씻으하십시오.
- 항인간 β-투불린 또는 항인간 MAP2 항체로 인간 GABAergic 인터뉴런을 염색한다. 염색 절차가 끝나면 각 접시에 안티 페이드 장착 매체 1 mL를 추가하십시오.
9. 이미징 및 데이터 분석
- 면역 염색 분석 접시를 현미경으로 4배 배율로 놓습니다.
- 직사각형 경계의 긴 모서리(위의 5.10단계에서 만든)를 뷰 필드에 유지합니다. 해당 경계에 인접한 셀 없는 공간에서 셀의 이미지를 가져다. 직사각형 경계의 오른쪽 긴 가장자리와 왼쪽 긴 가장자리를 따라 이미지를수집합니다(그림 2B).
참고: 사각형과 관련하여 대각선으로 배치된 셀은 시작 표시로 짧은 또는 긴 가장자리를 선택할 때 모호성으로 간주되지 않습니다. 또한 짧은 가장자리를 가로질러 이동하는 셀 의 수는 종종 현저히 적으며(짧은 가장자리를 따라 시작되는 셀수가 적기 때문일 수 있음) 고려되지 않습니다. - ImageJ에서 이미지를 엽니다. ImageJ를 사용하여 각 셀과 경계 표시 사이의 거리를계산합니다(그림 2D).
- 셀 번호 측면에서 마이그레이션을 평가하려면 ImageJ에서 획득한 이미지의 경계에서 특정 거리를 설정합니다. 이 거리 내에 있는 셀 수를 계산합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 평균 수, 표준 편차 및 통계 적 유의를 계산합니다.
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Representative Results
35mm 접시 내부에 원웰 배양 인서트를 설정하는 단계는 도 1에나와 있다. 장거리 이동 분석 및 공동 배양 이동 분석은 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 된 35 mm 접시의 중심에 원하는 수의 세포를 시드하기 위해 원웰 인서트를 사용했다. 0일째에, 세포는 직사각형 패치로서존재하였다(도 2A,C). 0일 차 이미지에서는 셀 레이어의 날카로운 가장자리(그림2C의흰색 점선)로 일0 줄을 쉽게 식별할 수 있습니다. 48시간까지, 세포는 세포가 없는 공간으로 이동하였다(그림2B,D). 포스트 데이 0 이미지에서 인서트 주위에 그려진 검은 색 테두리 (접시 뒷면)는 검은 색 간격으로 명확하게 관찰 할 수 있습니다. 간격의 모서리가 일 0 선으로 할당되었습니다(그림 2D의흰색 점선). 9.2단계에서 언급했듯이, 세포층의 좌우 긴 가장자리에 인접한 영역에 떨어진 셀들(도 2B의노란색 영역)만 데이터 분석을 위해 고려되었다. 셀에 의해 이동된 거리는 셀(도 2D의흰색 화살표)과 일 0 라인 사이의 거리를 계산하여 측정하였다. 항활성 카스파제 3 항체를 가진 면역세포화학적 염색, 세포사멸의 마커는, 종자세포에서 세포사멸 신호를 나타내지않았다(도 2E). 공동 배양 이동 분석에서, 인터뉴런이 인간 심구 내피 세포와 공동 시드되었을 때, 뉴런은 인터뉴런이 단독으로 시드되었을 때 또는 대조군 내피 세포와 공동 시드되었을 때와 비교하여 더 먼 거리를 여행하였다(그림2F). 또한, 동일한 거리 범위에 대 한, 다른 두 그룹에서 interneurons에 비해 상심 내 피 세포와 공동 시드 때 인터 뉴런의 높은 수 마이그레이션. 이것은, 마우스 periventicular 내피 세포 같이, 인간 periventicular 내피 세포가 인간 적인 신경절 이동을 승진시키는 것을 보여줍니다.
화학-어트랙션 분석에서, 3-웰 배양 삽입을 사용하여, 인간 인터뉴런은 35 mm 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 배양 접시에 작은 직사각형 패치로서 시드되었다. 심실 내피 세포 및 제어 비-내피 내피 세포는 뉴런 패치의 양쪽에 패치로서 시드되었고, 각 패치 사이의 간격은 500 μm(도3A)이다. 제어 내피 세포 대 내피 세포로 이동한 인터뉴런의 수는 36시간 후에 정량화되었다. 제어 내피 세포에 비해 심실 내피 세포로 마이그레이션 된 인터 뉴런의 상당히 높은 수(그림 3B,C),GABAergic interneurons는 인간의 심실 내피 세포에 의해 분비 된 화학 매력적인 큐에 선택적으로 반응한다는 것을 확인.
도 1: 배양 삽입의 제조. (A)2웰 컬쳐 인서트를 삽입합니다. (B)35mm 접시중앙에 고정된 원웰 인서트가 있습니다. (C)인서트를 제거한 후 관찰된 직사각형 패치의 윤곽선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 스키마 및 마이그레이션 분석의 대표적인 결과. (A)0일째에 세포층(빨간색 사각형)의 스키마. (B)셀 이없는 공간으로 마이그레이션하는 세포의 스키마. 빨간색 점은 이동 셀을 나타냅니다. 노란색 영역은 데이터 수집을 위해 이미지된 영역을 표시합니다. A와 B의 점선 상자는 패널 C 및 D에표시된 영역에 해당합니다. (C,D) 대표적인 항β-투불린 항체의 대표적인 형광 이미지는 이동 분석법의0일째(C)및 2일째(D)에 인터뉴런을 표지하였다. 흰색 점선은 0을 표시합니다. D의 노란색 선은 48 h.(E) 뉴런(0일째)에서 세포(흰색 화살표로 표시됨)에 의해 이동된 거리를 나타내며, 세포사멸 세포를 표시하는 항β-Tubulin 항체(적색) 및 항활성 카스파제 3 항체(녹색)와 공동 표지된다. 핵은 DAPI(파란색)로 염색됩니다. 세포사멸 세포는 종자 세포에서 검출되지 않았다. (F)동문화 분석 의 5일째부터 그래프, 이동한 거리에 대해 이동된 인터뉴런의 수가 플롯된다. 단독으로 시드 또는 대조군 내피 세포와 공동 시드 된 인터 뉴런과 비교하여, 심실 내피 세포와 공동 시드 된 인터 뉴런은 더 높은 숫자로 마이그레이션되었으며, 또한 더 먼 거리를 여행했습니다. 데이터는 평균 ± S.D (n = 5; **p<0.01, ***p< 0.001, 학생의 t 시험)를 나타냅니다. 배율 막대 = 100 μm. IN = 인터뉴런; PV EC = 심실 내피 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 화학-매력 분석. (A)화학 적 매력 분석의 스키마. 3웰 배양 삽입을 사용하여, 인터뉴런(IN)을 중간(녹색 점선 직사각형)에 시드하고, 심실 내피 세포(PV ECs; 주황색 점선 직사각형)와 제어 내피 세포(EC; 노란색 점선 직사각형)를 양쪽에 시드하였다. (B)β-Tubulin의 이미지는 심상 외 내피 세포를 향한 강력한 이동을 보여주는 인터뉴런을 표시하지만 제어 내피 세포를 향하지 않습니다. (C)인터뉴런의 화학적 매력적인 반응의 정량화. 신경세포의 상당히 높은 수는 제어 내피 세포를 향해보다 심실 내피 세포로 마이그레이션. 데이터는 평균 ± S.D(n = 5;* p< 0.05, 학생의 t 시험)를 나타낸다. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| A. | 장점 | 제한 |
| 보이든 챔버 분석16,17 | · 기술적으로 까다롭지 않은 · 부착 및 비부착 셀에 적합 · 세포 이동에 파라크린 신호 또는 화학 적 매력의 효과를 연구하기 위해 수정 할 수 있습니다 |
· 끝점 분석. 실시간 이미징에 적합하지 않습니다. · 이동에 대한 직접 세포 세포 상호 작용의 효과 연구에 적합하지 않음 |
| 스크래치 분석18 | · 끝점 또는 운동학 · 기술적으로 까다롭지 않은 |
· 몇 백 마이크로미터의 이동 길이를 측정합니다. 1-2cm 범위의 장거리 이동 연구에 적합하지 않습니다. · 현탁액 세포에 적합하지 않음 · 스크래치 영역의 변형 |
| 장거리 마이그레이션 분석 | · 끝점 또는 운동 · 1.5~2cm 사이의 장거리 이동 연구 가능 · 기술적으로 까다롭지 않은 |
· 현탁액 세포에 적합하지 않음 |
| 공동 문화 마이그레이션 분석 | · 끝점 또는 운동 · 직접 세포 세포 접촉이 마이그레이션에 미치는 영향에 대한 연구를 허용합니다. · 최대 1.5~ 2cm의 마이그레이션 길이 허용 · 기술적으로 까다롭지 않은 |
· 현탁액 세포에 적합하지 않음 |
| B | 장점 | 제한 |
| 보이든 챔버 분석 | · 기술적으로 까다롭지 않은 · 부착 및 비부착 셀에 적합 |
· 끝점 분석. 라이브 이미징에 적합하지 않습니다. · 가파른 농도 그라데이션 |
| 언더 아가로즈 분석19 | · 기술적으로 까다롭지 않은 · 두 개 이상의 화학 매력적인 신호는 하나의 설정에서 분석 될 수있다 |
· 부착 셀에 적합하지 않습니다. 주로 혈액 세포에 제한. · 아가로즈세포의 어려운 시각화 |
| 모세관 챔버 이동분석20,21 | · 끝점 또는 운동학 · 부착 또는 현탁액 셀에 적합 |
· 특별한 챔버가 필요합니다. |
| 미세 유체 장치22 | · 제어 가능하고 안정적인 농도 그라데이션 생성 · 단일 셀 레벨 분해능 허용 |
· 정교한 장치 및 도구 필요 · 기술적으로 까다롭고 가파른 학습 곡선 · 복잡한 이미징 및 데이터 분석 |
| 화학 매력 분석 | · 끝점 또는 운동 · 점진적 농도 그라데이션 · 실시간 또는 형광 이미징에 적합 · 기술적으로 까다롭지 않은 |
· 현탁액 세포에 적합하지 않음 |
표 1: 분석 방법의 비교. (a)일반적인 시험관내 이동 분석과 장거리 이동 분석 및 공동 배양 분석의 비교. (B)일반적인 화학동선염 분석과 화학적 매력 분석의 비교.
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Discussion
여기서, 우리는 함께 인간 심실 내피 세포 특이적 특성의 정량적 평가를 제공하는 3개의 시험관내 분석시험을 기술했다. 이 해약은 인간 interneurons와 인간 적인 심실 내피 세포의 상호 작용에 기계론적인 통찰력을 얻기에 귀중할 것입니다. 리간드, 억제제 또는 유전자 특이적 녹다운 또는 과발현을 가진 세포를 이용한 실험은 내피 세포 유도 된 세포 유도 인터뉴런 이동 또는 심실 내피 세포의 장거리 철새 특성을 중재하는 분자 플레이어를 식별하거나 검증합니다. 이 세포 시간 경과 마이그레이션 연구를 수행하기 위하여 이 고아학은 또한 수정될 수 있습니다. 또한, 인터뉴런 이외의 세포와 내피 세포의 상호 작용에 대한 증거가있다. 우리 그룹 및 다른 사람으로부터의 연구는 돌기 뉴런의 패터닝및 신경 전구체세포의증식에 대한 심실 내피 세포의 영향을5,14,15. 분석 설정을 사용하여 이러한 가능한 상호 작용을 테스트하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 이 세포는 병에 걸린 심상 외 외 피내피 세포의 평가를 위한 발판으로 봉사할 것입니다. 우리의 일은 심실 혈관 네트워크와 정신 분열증, 간질, 자폐증 및 주요 불경기 와 같은 신경 정신 장애의 기원 사이 새로운 자율적인 링크를 설치했습니다3,5. 이 측정은 이 신경 정신 장애 조건에 있는 병든 심외 내피 세포의 장거리 이동, 화학 점원, 또는 병든 심실 내피 세포의 juxtracrine 신호에 있는 잠재적인 결점을 확인하는 에서 귀중할 것입니다.
이 측정은 간단하고, 재현 가능하고, 저비용이며, 비부착 세포를 제외한 다양한 세포 유형에서의 이동에 대한 공동 배양 또는 화학 적 매력적인 단서의 세포 이동 및 효과를 측정하기 위해 수정할 수 있습니다. 정확하고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 따라야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 각 분석에 대한 시드 셀 번호를 최적화하는 것이 중요합니다. 단일 구획에서 시드되는 세포의 수는 세포 유형, 원하는 수준의 동률 및 공동 배양 비율과 같은 분석 특이적 요인에 따라 달라져야 합니다. 둘째, 각 분석에 대한 세포 배양 배지를 최적화할 필요가 있다. 공동 배양 이동 분석 및 화학 적 매력 분석에서, 하나 이상의 세포 유형이 단일 접시에 시드되는 경우, 분석 매체는 모든 세포 유형에 도움이되어야한다. 파일럿 실험에서, 우리는 각 세포 유형의 생존 (trypan 파란색 배제 방법을 사용하여) 및 형태 (면역 세포 화학을 사용하여)에 공동 배양 매체의 효과를 조사했다. 우리는 1 주일 동안 공동 배양 매체와 인간 GABAergic 뉴런을 배양 하 고 생존력과 뉴런 배지에서 뉴런의 형태에 유의 한 차이 관찰 공동 배양 매체에 비해 뉴런 배지에 배양. 유사한 방식으로, 상피내피 세포 및 제어 내피 세포는, 두 대패에 대한 공동 배양 배지에서 배양, 세포 생존 및 형태학에서 유의한 변화를 나타내지 않았다. 셋째, 이동 속도는 상이한 세포 유형에 따라 다르기 때문에, 연구중인 세포 유형에 대한 각 분석에 대한 기간을 결정하는 것이 중요하다. 넷째, 배스쳐 삽입을 신중하게 처리하는 것이 중요합니다. 인서트를 손가락끝으로 부드럽게 눌러 접시에 단단히 고정시켜야 합니다. 인서트가 움직이지 않는지 확인하기 위해 접시를 거꾸로 뒤집어야 합니다. 세포 층을 방해하지 않도록 삽입을 제거하는 동안주의해야합니다. 마지막으로, 실험 가변성을 줄이기 위해 샘플 크기를 늘리는 것이 좋습니다.
결론적으로, 이 시험은 인간 periventicular 내피 세포 생물학의 우리의 이해및 정상과 병든 조건에서 두뇌 발달에 그것의 역할을 확장할 것입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 정신 건강 연구소 (R01MH110438)와 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (R01NS100808)에서 AV에 대한 상을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
References
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