Summary
Vi presenterar tre enkla in vitro analyser-långväga migration analys, co-kultur migration analys, och chemo-attraktion analys-som kollektivt utvärdera funktionerna i mänskliga stamceller härrör periventricular endotel celler och deras interaktion med GABAergic interneurons.
Abstract
Roll hjärnan vaskulatur i nervsystemet utveckling och etiologi av hjärnsjukdomar blir alltmer få uppmärksamhet. Våra nyligen genomförda studier har identifierat en speciell population av vaskulära celler, periventricular endotel celler, som spelar en avgörande roll i migration och distribution av forebrain GABAergic interneurons under embryonal utveckling. Detta, tillsammans med deras cell-autonoma funktioner, anspelar på nya roller periventricular endotel celler i patologi neuropsykiatriska störningar som schizofreni, epilepsi och autism. Här har vi beskrivit tre olika in vitro-analyser som tillsammans utvärderar funktionerna i periventricular endotelceller och deras interaktion med GABAergic interneurons. Användning av dessa analyser, särskilt i ett mänskligt sammanhang, kommer att tillåta oss att identifiera sambandet mellan periventricular endotel celler och hjärnsjukdomar. Dessa analyser är enkla, billiga och reproducerbara, och kan enkelt anpassas till någon vidhäftande celltyp.
Introduction
Endotelceller bildar slemhinnan i blodkärlen och förmedlar viktiga funktioner som inkluderar underhåll av kärlväggpermeabilitet, reglering av blodflödet, trombocytaggregation en och bildandet av nya blodkärl. I hjärnan, endotelceller utgör en del av en kritisk blod -hjärnbarriär som tätt kontrollerar utbyte av material mellan hjärnan och blodomloppet1. Våra studier under det senaste decenniet har identifierat nya neurogena roller hjärnan endotelceller som har betydande konsekvenser för hjärnans utveckling och beteende2,3,4,5. Vi har visat att musenembryonala framhjärnan är vascularized av två olika subtyper av fartyg, pial fartyg och periventricular fartyg, som skiljer sig åt i anatomi, ursprung och utvecklingsmässiga profil2. Endotelceller som kantar dessa två undertyper av kärl visar tydliga skillnader i deras genuttrycksprofiler. Medan pial endotelceller uttrycker mestadels gener relaterade till inflammation och immunsvar, periventricular endotel celler är unikt berikade i uttryck för gener som vanligen förknippas med neurogenes, neuronal migration, chemotaxis och axon vägledning3. Periventricular endotel celler också hus en ny GABA signalering väg som skiljer sig från den traditionella neuronala GABA signalering väg5. Samtidig t.ex. med dess genuttryck, periventricular endotel celler konstaterades reglera migration och distribution av GABAergic interneurons i utvecklings-neocortex. Under embryonal utveckling genomgår periventricular endotelceller långväga migration längs en ventral-rygglutning för att fastställa det periventricular vaskulära nätverket2,3. Denna migrationsväg speglas en dag senare av interneurons. Migrera interneurons interagerar fysiskt med det förbildade periventricular vaskulära nätverket och använda det som en guiderail för att nå sin slutdestination i neocortex. Förutom att fungera som ett fysiskt substrat, periventricular endotel celler fungera som källan till navigationssignaler för migrerande nervceller. Periventricular endotel cell-utsöndras GABA guider interneuron migration och reglerar deras slutliga distributionsmönster4. Defekter i interneuron migration och distribution är förknippade med neuropsykiatriska störningar såsom autism, epilepsi, schizofreni och depression6,7,8,9,10. Därför blir studier av periventricular endotel cell funktioner och deras inverkan på interneuron migration i mänskligt sammanhang kritisk för att ta itu med patogenesen vid dessa sjukdomar.
Vi har genererat mänskliga periventricular-liknande endotelceller från mänskliga embryonala stamceller i vårt laboratorium11,med inducerad pluripotent stamceller (iPSC) teknik12,13. För att validera om mänskliga periventricular endotel celler troget efterlikna mus periventricular endotel celler, och att kvantitativt bedöma deras inflytande på interneuron migration, utvecklade vi tre in vitro analyser: en långväga migration analys, en co-kultur migration analys, och en chemo-attraktion analys. Här beskriver vi protokoll för dessa analyser i detalj. Alla tre analyser är baserade på användningen av silikon kultur skär för att skapa en liten rektangulär fläck av celler (av fasta dimensioner) omgiven av cellfritt utrymme. Migreringsavstånd utvärderas genom att mäta avståndet mellan cellernas slutliga positioner från gränsen till den rektangulära patchsom har beskrivits dag 0. I långväga migration analys, mänskliga periventricular endotel celler är sådd som en patch i mitten av en 35 mm skålen, och de avstånd som färdas av cellerna över en lång tid beräknas. I co-kultur migration analys, mänskliga periventricular endotel celler är samseedade med mänskliga interneurons som en lapp i en 35 mm skålen. Denna inställning möjliggör undersökning av effekten av direkta fysiska interaktioner av dessa två celltyper på graden av migration av interneurons. Chemo-attraktion analysen mäter migration av interneurons som svar på kemo-attraktiva signaler utsöndras av mänskliga periventricular endotel celler. Interneurons är sådd som en rektangulär patch, med mänskliga periventricular endotel celler och kontroll icke-periventricular endotel celler sådd som liknande storlek fläckar på vardera sidan. Var och en av cellplåstren separeras av en cellfri lucka på 500 μm. Svar av interneurons bedöms genom att kvantifiera antalet celler som har migrerat till periventricular endotelceller jämfört med kontroll icke-periventricular endotelceller.
Dessa analyser ger robust bedömning av mänskliga periventricular endotel cell funktioner och deras inflytande på interneuron migration. Den nya installationen av långväga analys och co-kultur migration analys ger cellfritt utrymme i intervallet centimeter (~ 1-1,5 cm) för att möjliggöra upptäckt av långväga migration. En sammanfattning av funktionerna i våra analyser jämfört med andra populära analyser presenteras i tabell 1. Kollektivt, de analyser som beskrivs här kommer att fungera som en plattform för att bedöma "sjuka" periventricular endotel celler och interneurons genereras från iPSCs av hjärnsjukdomar som schizofreni, autism eller epilepsi. Dessa analyser kan också användas för att avgöra hur olika tillstånd (t.ex. hämmare, ligander, RNAi) påverkar cellmigrationen. Slutligen kan dessa analyser optimeras för andra celltyper för att mäta långväga migration, kemo-attraktion eller cell-cell medierad migration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur och lagring av mänskliga periventricular endotelceller
- Håll humana periventricular endotelceller på matrisbelagda källaren membran (se Materialförteckning)6-brunnsplattor i periventricular endotelcellmedium (E6 medium som innehåller 50 ng/ml VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 och 5 μM GABA) vid 37 °C och 5% CO2. Byt medium varje annan dag.
- Tina källaren membran matris i 4 °C, och gör en 1:100 lösning genom att späda ut den i kallt DMEM/F12 medium. Coat varje brunn av en 6-brunn sen med 1 ml matrislösning. Inkubera plattor vid 37 °C i minst 1 timme före användning.
- Låt mänskliga periventricular endotelceller nå en sammanflödet på 80%-90%. Aspirera medium från brunnen. Tvätta brunnarna en gång med 1 ml steril 1x PBS per brunn.
- Lossa celler genom att lägga till 1 ml celldissociationlösning (se Materialförteckning)per brunn. Kuv vid 37 °C i 5 min. Efter 5 min, tillsätt 1 ml periventricular endotel cell medium. Överför celllösningen till ett koniskt 15 ml-rör.
OBS: Vi använder Accutase för celldissociation här, i motsats till tryple i avsnitten 3 och 4. - Centrifugceller vid 500 x g i 5 min vid rumstemperatur, aspirera supernatanten och omfördela cellpelleten i 1 ml periventricular endotelcellmedium.
- Räkna levande celler med hjälp av trypanblå uteslutningsmetoden. Fröceller i färska matrisbelagda plattor med en densitet av 1,2 x 105 celler/cm2. Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2.
- Förvara mänskliga periventricular endotelceller genom kryobevarande i frysmedium (90% periventricular endotel cell medium och 10% DMSO).
- Dissociate och samla celler efter steg 1.3 och 1.4 ovan. Räkna celler i lösningen med trypanblå uteslutningsmetoden.
- Centrifugceller vid 500 x g i 5 min vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och omblandas cellpelleten vid 5 x 106 celler/ ml frysmedium.
- Dispensera 1 ml frysmedium plus celler per kryovial. Placera injektionsflaskorna i isopropanolfylld kammare och kyl över natten i -80 °C vid 1 °C/min. Överför injektionsflaskorna till en flytande kvävetank nästa dag för långtidsförvaring.
2. Beredning av humanperiventricular endotelceller för analys
- Låt mänskliga periventricular endotelceller nå 70%-80% sammanflödet.
- Dissociate celler efter steg 1,3 till 1,5 enligt beskrivningen ovan. Räkna celler med hjälp av trypanblå uteslutningsmetod.
3. Beredning av humana GABAergic Interneurons för analys
OBS: Humaninducerad pluripotent stamcellscell (iPSC)-härledda GABAergic interneurons och neuronalmedium köptes kommersiellt (se Materialtabell). Nervcellerna genereras genom att skilja en mänsklig fibroblast-härledda iPSC linje efter ett protokoll som utvecklats av tillverkaren. Cellerna tinades och odlades enligt tillverkarens protokoll.
- Tina mänskliga GABAergic interneurons och kultur dem i 12-brunnplattan i två veckor till en sammanflödet av 70%-80%.
- På analysens dag, varm cell dissociation lösning (se Tabell över material)och en alikvot av neuronal medium vid 37 °C i 10 min före användning.
- Aspirera medium från varje brunn som innehåller cellerna. Tvätta celler med 1 ml sterila 1x PBS per brunn.
- Lossa celler genom att lägga till 0,5 ml förvärmd dissociationlösning per brunn och inkubera vid 37 °C i 5 min. Tillsätt 1 ml neuronal medium per brunn. Överför celllösning till ett koniskt 15 ml-rör. Triturate för att separera cell klumpar.
- Centrifugceller vid 380 x g i 5 min vid rumstemperatur, aspirera supernatanten och omfördela cellpelleten i 1 ml neuronalmedium. Räkna levande celler med hjälp av trypanblå uteslutningsmetoden.
4. Beredning av kontroll mänskliga endotelceller för analys
OBS: Kontroll av mänskliga iPSC-härledda endotelceller och endotelcellmedium köptes kommersiellt (Materialförteckning). Dessa endotelceller genereras genom att skilja en mänsklig fibroblast-härledda iPSC linje till endotel öde efter ett protokoll som utvecklats av tillverkaren. Cellerna tinades och odlades på Fibronectin substrat enligt tillverkarens protokoll. Fibronectin-belagda plattor förbereddes efter tillverkarens protokoll.
- Tina kontroll mänskliga endotelceller och kultur dem i 6-brunnsplatta till en sammanflödet på 80%-90%.
- På analysens dag, varm celldissociationlösning (se Materialförteckning)och en alikvot av endotelmedium vid 37 °C i 10 min före användning.
- Aspirera mediet från varje brunn som innehåller cellerna. Tvätta celler med 1 ml sterila 1x PBS per brunn.
- Lossa celler genom att lägga till 0,5 ml förvärmd dissociationlösning per brunn. Inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Tillsätt 1 ml endotelcellmedium per brunn för att neutralisera dissociationslösningen. Överför celllösning till ett koniskt 15 ml-rör.
- Centrifugceller vid 200 x g i 5 min vid rumstemperatur. Aspirera supernatant och omförd cellpelleten i 1 ml endotelcellmedium. Räkna levande celler med hjälp av trypanblå uteslutningsmetoden.
5. Förberedelse av enbrunnskultur skär
- Tina 1 mg/ml lamininlösning vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
- Coat ett lämpligt antal 35 mm rätter med 0,01% poly-L-ornitin lösning (1 ml per maträtt). Inkubera disken i rumstemperatur i minst 1 h.
- Späd 1 mg/ml lamininlösning 1:300 i sterilt vatten till en slutlig koncentration av 3,3 μg/ml omedelbart före användning.
- Helt aspirera poly-L-ornitin från varje maträtt. Skölj varje maträtt noggrant 3x med sterilt vatten och aspirera helt för att undvika poly-L-ornitin-inducerad celltoxicitet.
- Tillsätt 1 ml 3,3 μg/ml lamininlösning till varje disk och inkubera vid 37 °C över natten eller minst 1 h. Ta bort lamininlösningen från skålen omedelbart före användning.
OBS: Alternativt förvara laminin-innehållande rätter i 4 °C. Equilibrate disken i en 37 °C cell kultur inkubator före användning. - Skär tre sidor av en brunn av en tvåbrunnssilikonodling (figur 1A) med hjälp av ett sterilt blad för att generera en enbrunnsinsats (figur 1B).
OBS: Håll den tvåbrunnsinsatsen ordentligt fastsatt på originalförpackningens yta under skärning för att säkerställa ett slät snitt och skydda skärets självhäftande. - Aspirera lamininlösning från disken.
OBS: Diska inte med steril pbs eller vatten efter lamininininkubation. Våta ytor kommer att förhindra tät vidhäftning av kulturinsatsen. - Ta bort en brunn satt med sterila pincett och placera den i mitten av poly-L-ornitin/lamininberad maträtt. Tryck längs kanterna på insatsen för att fixa den på skålens yta.
- Vänd försiktigt skålen upp och ner för att kontrollera att insatsen är ordentligt fastsatt.
- Förvara skålen upp och ner och markera gränsen för skärfacket med hjälp av en permanent svart markör med en ultrafin spets (figur 1C).
6. Långväga Migration Analys
- Avbryt mänskliga GABAergic interneurons vid en koncentration av 3 x 104 celler/70 μL neuronal medium. Frö 70 μL celllösning inuti varje enbrunnskulturinsats.
OBS: Sådddensiteten hos interneuroner är enligt tillverkarens rekommendation. - Häng upp mänskliga periventricular endotelceller vid en koncentration av 3 x 104 celler/70 μL periventricular endotel cell medium. Frö 70 μL celllösning inuti varje enbrunnskulturinsats.
OBS: Antalet mänskliga periventricular endotel celler sådd på en 1:1 förhållande med antalet seedade nervceller. - Tillsätt 1 ml neuronal medium i neuron skålen för att fylla området runt insatsen och förhindra beläggningen från torkning. På samma sätt, tillsätt 1 ml periventricular endotel cell medium i periventricular endotel cell skålen.
OBS: Tillsätt medium långsamt längs kanten av skålen så att insatsen inte störs. - Kontrollera under ett mikroskop för att kontrollera att cellerna inte läcker från skärfacket.
- Inkubera celler i 24 timmar vid 37 °C och 5 % CO2. Efter inkubation på 24 timmar kontrollerar du under mikroskopet för att kontrollera att cellerna har fästs ordentligt och att det inte finns någon nattläcka.
- Efter 48 h sådd, ta försiktigt bort insatsen med en steril tweezer. Kontrollera under mikroskopet för att kontrollera att celllagret förblir ostört (dag 0).
- Ta bort medium från neuron skålen och tillsätt 1 ml färsk neuronal medium. På samma sätt, ta bort medium från periventricular endotel cell skålen och tillsätt 1 ml färsk periventricular endotel cell medium.
OBS: Avsätta ett obligatoriskt antal rätter och fixa med 4% PFA för dag 0 bilder. - Inkubera celler i 5 dagar vid 37 °C och 5% CO2. Efter 5 dagar, ta bort medium, fixa celler med 4% PFA i 10 min, och tvätta 3x med 1x PBS.
- Stain nervceller med anti-mänskliga β-Tubulin eller anti-mänskliga MAP2 antikroppar, och endotelceller med anti-mänskliga CD31 antikroppar. I slutet av immunfärgning, tillsätt 1 ml antifade monteringsmedium till varje maträtt.
7. Analys av migration för medkultur
- Co-suspend 3 x 104 GABAergic interneurons och 3 x 104 human periventricular endotel celler i 70 μL co-kultur medium (50% periventricular underhållsmedium utan GABA och 50% neuronal medium). Så denna celllösning inuti det enbrunnsskärfacket. Förbered ett lämpligt antal sådana analysrätter.
OBS: GABA lades inte i co-kultur medium för att utesluta effekten av exogena GABA på migration. - Kontrollera under ett mikroskop för att kontrollera att cellerna inte läcker från skärfacket.
- Tillsätt långsamt 1 ml co-kulturmedium längs sidan av skålen för att förhindra att beläggningen torkar.
OBS: Tillsätt medium långsamt längs kanten av skålen så att insatsen inte störs. - Som en första kontroll, utsäde 3 x 104 mänskliga GABAergic interneurons endast i 70 μL co-kultur medium per en brunn infoga. Förbered ett lämpligt antal sådana rätter.
- Som en andra kontroll, co-seed 3 x 104 GABAergic mänskliga interneurons med 3 x 104 kontrollera mänskliga endotelceller i 70 μL co-kultur medium per en-brunn infoga. Förbered ett lämpligt antal rätter.
- Inkubera disken i 24 timmar vid 37 °C och 5% CO2. Efter inkubation på 24 timmar kontrollerar du under ett mikroskop för att kontrollera att cellerna har fästs ordentligt och att det inte finns någon läcka.
- Efter 48 h sådd, ta försiktigt bort insatsen med en steril tweezer. Kontrollera under mikroskopet för att kontrollera att celllagret inte störs (dag 0).
- Ta bort medium och tillsätt 1 ml färskt co-kulturmedium.
OBS: Avsätta ett lämpligt antal rätter för att förvärva dag 0 bilder. - Inkubera celler i 5 dagar vid 37 °C och 5% CO2.
- Efter 5 dagar, ta bort medium, fixa celler med 4% PFA i 10 min, och tvätta 3x med 1x PBS.
- Fläck med anti-mänskliga β-Tubulin eller anti-mänskliga MAP2 antikroppar för att märka nervceller. I slutet av immunfärgning, tillsätt 1 ml antifade monteringsmedium till varje maträtt.
8. Chemo-attraktion Analys
- Placera en tre-brunns kultur insats i mitten av en poly-L-ornitin/laminin belagd 35 mm skålen med sterila pincett.
- Vänd skålen upp och ner. Markera gränsen runt insatsens mittfack med hjälp av en permanent svart markör med ultrafin spets.
- Utsäde 3 x 104 mänskliga GABAergic interneurons i mitten facket i 70 μL neuronal medium(figur 3A).
- Utsäde 104 humana periventricular endotelceller i 70 μL periventricular endotelcellmedium och 104 kontroll endotelceller i 70 μl kontrollendotelcellmedium i de två yttre facken (figur 3A).
- Tillsätt 1 ml co-kultur medium (50% periventricular underhållsmedium utan GABA och 50% neuronal medium) längs sidan av skålen för att förhindra beläggningen på skålen från torkning.
- Kontrollera under mikroskop et för att kontrollera att cellerna inte läcker från skärfacket.
- Inkubera celler i 24 timmar vid 37 °C och 5 % CO2. Efter inkubation på 24 timmar kontrollerar du under ett mikroskop för att kontrollera att cellerna har fästs ordentligt och att det inte finns någon läcka.
- Efter 48 h sådd, ta försiktigt bort insatsen med en steril tweezer. Kontrollera under mikroskopet för att kontrollera att celllagret inte störs (dag 0).
- Ta bort medium och tillsätt 1 ml färskt co-kulturmedium.
Obs: Ställ åt sidan krävs antal rätter för dag 0 bilder. - Inkubera celler i 36 timmar vid 37 °C och 5 % CO2. Efter 36 timmar, aspirera medium, fixa celler med 4% PFA i 10 min, och tvätta 3x med 1x PBS.
- Stain mänskliga GABAergic interneurons med anti-mänskliga β-Tubulin eller anti-mänskliga MAP2 antikroppar. I slutet av färgningsproceduren, tillsätt 1 ml antifade monteringsmedium i varje disk.
9. Bild- och dataanalys
- Placera immuno-färgade assay skålen under ett mikroskop vid 4X förstoring.
- Håll en långkant av den rektangulära gränsen (tillverkad i steg 5.10 ovan) i synfältet. Ta bilder av celler i cellfritt utrymme intill den gränsen. Hämta bilder längs höger långsida och den vänstra långkanten på den rektangulära gränsen (figur 2B).
OBS: Celler placerade diagonalt med avseende på rektangeln beaktas inte på grund av tvetydighet när de väljer kort- eller långkant som startmarkering. Dessutom är antalet celler som migrerar över kortsidan ofta betydligt färre (möjligen på grund av mindre antal startceller längs kortsidan) och beaktas inte. - Öppna bilderna i ImageJ. Beräkna avståndet mellan varje cell och gränsmarkeringen (figur 2D) med ImageJ.
- Om du vill bedöma migreringen i termer av cellnummer anger du ett specifikt avstånd från gränsen i den förvärvade bilden i ImageJ. Räkna antalet celler som finns inom detta avstånd. Beräkna genomsnittligt antal, standardavvikelse och statistisk signifikans med hjälp av lämplig programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stegen för att sätta upp en enbrunnskulturinsats inuti en 35 mm-maträtt visas i figur 1. Långväga migration analys och co-kultur migration analys används en enbrunnsinsats för att så utsäde önskat antal celler i mitten av en poly-L-ornitin / laminin belagd 35 mm skålen. Dag 0 var cellerna närvarande som en rektangulär patch (figur 2A,C). I dag 0-bilder kan dag 0-linjen lätt identifieras av cellskiktets vassa kant (vit prickad linje i figur 2C). Med 48 h hade cellerna migrerat ut i det cellfria utrymmet (figur 2B,D). I efter dag 0 bilder, den svarta gränsen dras runt insatsen (på baksidan av skålen) kan tydligt observeras som en svart lucka. Kanten av gapet tilldelades som dag 0 linje (vit prickad linje i figur 2D). Som nämns i steg 9.2 beaktades endast de celler som föll i området intill cellskiktets höger- och vänsterkanter (gult område i figur 2B) för dataanalys. Det avstånd som färdades i en cell mättes genom beräkning av avståndet mellan cellen (vitpil i figur 2D) och dag 0-linjen. Immunocytochemical färgning med antiaktiva Caspase 3 antikroppar, en markör för apoptos, visade ingen apoptotisk signal i de seedade cellerna (Figur 2E). I co-kultur migration analysen, när interneurons var co-seedade med mänskliga periventricular endotel celler, nervceller reste längre avstånd jämfört med när interneurons var sådd ensam eller när co-seedade med kontroll endotelceller(Figur 2F). Också, för samma avståndsintervall, ett högre antal interneurons migrerade ut när co-seedade med periventricular endotel celler i jämförelse med interneurons i de andra två grupperna. Detta visar att, liksom musen periventricular endotel celler, mänskliga periventricular endotel celler främja mänskliga interneuron migration.
I chemo-attraktion assay, med hjälp av tre-brunns kultur insatser, var mänskliga interneurons sådd som en liten rektangulär lapp i en 35 mm poly-L-ornitin / laminin belagda kultur skålen. Periventricular endotelceller och kontroll icke-periventricular endotel celler var sådd som fläckar på vardera sidan av neuronala plåstret, med gapet mellan varje plåster är 500 μm(figur 3A). Antalet interneuroner som migrerade mot periventricular endotelceller kontra kontroll endotelceller kvantifierades efter 36 h. Ett betydligt högre antal interneuroner migrerade mot periventricular endotel celler jämfört med kontroll endotel celler (Figur 3B, C), bekräftar att GABAergic interneurons svarar selektivt på kemo-attraktiva signaler utsöndras av mänskliga periventricular endotel celler.
Figur 1: Beredning av kulturinsatsen. (A) En två-brunns kultur infoga. (B) En enbrunnsinsats som är fast i mitten av en 35 mm-skål. (C) Konturen på den rektangulära plåstret som observerats efter att insatsen tagits bort. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schema och representativt resultat av migreringsanalys. (A)Schema för cellskiktet (röd rektangel) dag 0. (B) Schema av celler som migrerar ut i cellfritt utrymme. Röda prickar indikerar migrerande celler. Det gula området markerar det område som avbildas för datainsamling. Den prickade lådan i A och B motsvarar det område som visas i panel C och D. (C,D) Representativa fluorescerande bilder av anti-β-Tubulin antikroppar märkta interneurons dag 0 (C) och dag 2 (D) av migration analysen. Den vita prickade linjen markerar dag 0. Den gula linjen i D indikerar avståndet som färdas av en cell (markerad med vit pil) i 48 h. (E) Nervceller (dag 0) är sammärkta med anti-β-Tubulin antikroppar (röd) och antiaktiva Caspase 3 antikroppar (grön), som markerar apoptotiska celler. Nuclei färgas med DAPI (blå). Apoptotiska celler upptäcktes inte i sådd celler. (F) Diagram från dag 5 av co-kultur analysen, där antalet interneurons som har migrerat satts mot avryggade avstånd. I jämförelse med interneurons som var seedade ensam eller co-seedade med kontroll endotel celler, interneurons co-seedade med periventricular endotel celler migrerade ut i högre antal, och även reste längre avstånd. Data representerar medelvärde ± S.D (n = 5; **p<0.01, ***p< 0.001, Studentens t-test). Skalstänger = 100 μm. IN = interneurons; PV EC = periventricular endotelceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Chemo-attraktion satt. (A)Schema av chemo-attraktion analysen. Med hjälp av en tre-brunnkultur infoga, interneurons (IN) var sådd i mitten (grön prickad rektangel), medan periventricular endotel celler (PV ECs, orange prickade rektangel) och kontroll endotel celler (ECs, gul prickad rektangel) var sådd på vardera sidan. (B)Bilder av β-Tubulin märkta interneurons som visar robust migration mot periventricular endotelceller men inte mot kontroll endotelceller. (C)Kvantifiering av interneuronernas chemo-attraktiva svar. Ett betydligt högre antal nervceller migrerade mot periventricular endotel celler än mot kontroll endotel celler. Data representerar medelvärde ± S.D (n = 5; *p < 0,05, Studentens t-test). Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| A | Fördelar | Begränsningar |
| Boyden kammare analys16,17 | · Tekniskt icke-krävande · Lämplig för vidhäftande och icke-vidhäftande celler · Kan ändras för att studera effekten av paracrine signalering eller kemo-attractants på cellmigration |
· Endpoint analys. Inte lämplig för realtid stomografi. · Inte lämplig för studie av effekten av direkt cell-cell interaktion på migration |
| Skrapsatspåt 18 | · Slutpunkt eller kinetisk · Tekniskt icke-krävande |
· Analyser migration längd på några hundra mikrometer. Inte lämplig för studier av långväga migration i intervallet 1-2 cm. · Ej lämplig för suspensionsceller · Variationer i repaområdet |
| Fjärranalys av migration | · Slutpunkt eller kinetisk · Tillåter studier av långväga migration mellan 1,5 till 2 cm · Tekniskt icke-krävande |
· Ej lämplig för suspensionsceller |
| Analys av migration av samkultur | · Slutpunkt eller kinetisk · Tillåter studier av effekten av direkt cellkontakt vid migrering · Tillåter migreringslängd på upp till 1,5 till 2 cm · Tekniskt icke-krävande |
· Ej lämplig för suspensionsceller |
| B | Fördelar | Begränsningar |
| Boyden kammare analys | · Tekniskt icke-krävande · Lämplig för vidhäftande och icke-vidhäftande celler |
· Endpoint analys. Inte lämplig för levande avbildning. · Brant koncentrationsgradient |
| Under-agarose analys19 | · Tekniskt icke-krävande · Två eller flera kemoattraktiva signaler kan analyseras i en uppsättning |
· Inte lämplig för vidhäftande celler. Begränsas främst till blodkroppar. · Svår visualisering av celler i agarose |
| Capillary kammare migration analys20,21 | · Slutpunkt eller kinetisk · Lämplig för vidhäftnings- eller fjädringsceller |
· Behöver speciella kammare |
| Mikrofluidisk enhet22 | · Genererar kontrollerbar och stabil koncentrationsgradient · Tillåter upplösning på en cellnivå |
· Behöver sofistikerade enheter och verktyg · Tekniskt krävande och brant inlärningskurva · Komplex bildbehandling och dataanalys |
| Chemo-attraktion assay | · Slutpunkt eller kinetisk · Gradvis koncentrationsgradient · Lämplig för avbildning i realtid eller fluorescerande · Tekniskt icke-krävande |
· Ej lämplig för suspensionsceller |
Tabell 1: Jämförelse av analysmetoder. (A) Jämförelse av gemensamma in vitro migration analyser med långväga migration analys och co-kultur analys. (B) Jämförelse av vanliga chemotaxis analyser med chemo-attraktion analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrev vi tre in vitro-analyser som tillsammans ger kvantitativ bedömning av mänskliga periventricular endotel cell-specifika egenskaper. Dessa analyser kommer att vara värdefulla för att få mekanistiska insikter i samspelet mellan mänskliga periventricular endotel celler med mänskliga interneurons. Experiment med ligand, inhibitorer eller celler med genspecifik knockdown eller överuttryck kommer att identifiera eller validera molekylära aktörer som medla endotel cell-guidad interneuron migration eller långväga flyttande egenskaper periventricular endotel celler. Dessa analyser kan också ändras för att utföra live-cell time-lapse migration studier. Dessutom finns det bevis för interaktion av endotelceller med andra celler än interneuroner. Studier från vår grupp och andra har anspelat på påverkan av periventricular endotel celler på mönster av projektion nervceller och spridning av neurala prekursorceller5,14,15. Det skulle vara av intresse att testa dessa möjliga interaktioner med hjälp av våra analysinställningar. Slutligen kommer dessa analyser fungera som en plattform för bedömning av sjuka periventricular endotel celler. Vårt arbete har etablerat nya autonoma kopplingar mellan periventricular vaskulära nätverk och ursprunget till neuropsykiatriska störningar som schizofreni, epilepsi, autism och depression3,5. Dessa analyser kommer att vara ovärderliga för att identifiera potentiella defekter i långväga migration, kemo-attraktion, eller juxtracrine signalering av sjuka-periventricular endotel celler i dessa neuropsykiatriska störning villkor.
Dessa analyser är enkla, reproducerbara och billiga, och de kan ändras för att mäta cellmigration och effekter av co-kultur eller kemo-attraktiva signaler om migration i olika celltyper, med undantag för icke-vidhäftande celler. Det finns några kritiska steg som måste följas för att få korrekta och reproducerbara resultat. Först är det viktigt att optimera såddcellnummer för varje analys. Antalet celler som ska sås i ett enda fack bör bero på celltyp, önskad nivå av sammanflödet och analysspecifika faktorer som co-kultur-förhållande. För det andra är det nödvändigt att optimera cellkulturmedium för varje analys. I co-kultur migration analys och chemo-attraktion analys, där mer än en cell typ är sådd i en enda maträtt, bör analysmediet bidra till alla celltyper. I pilotexperiment undersökte vi effekten av co-kultur medium på lönsamhet (med trypan blå uteslutningsmetod) och morfologi (med immunocytokemi) av varje celltyp. Vi odlade mänskliga GABAergic nervceller med co-kultur medium för en vecka och observerade ingen signifikant skillnad i livskraft och morfologi av nervceller i co-kultur medium jämfört med nervceller odlade i neuronal medium. På ett liknande sätt visade periventricular endotelceller och kontroll endotelceller, odlade i co-kulturmedium för två passager, visade inte någon signifikant variation i cellöverlevnad och morfologi. För det tredje är det viktigt att bestämma tidsramen för varje analys för den eller de celltyper som studeras, eftersom migreringshastigheten varierar mellan olika celltyper. För det fjärde är det viktigt att hantera kulturskären noggrant. Skär bör fästas ordentligt på skålen genom att försiktigt trycka med en fingertopp. Skålen ska vändas upp och ner för att kontrollera att insatsen inte rör sig. Var försiktig när du tar bort insatsen för att inte störa cellskiktet. Slutligen rekommenderas att öka urvalsstorleken för att minska experimentell variation.
Sammanfattningsvis kommer dessa analyser avsevärt utöka vår förståelse av mänskliga periventricular endotelcellbiologi och dess roll på hjärnans utveckling under normala och sjuka förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av utmärkelser från National Institute of Mental Health (R01MH110438) och National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) till AV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
References
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
- Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149 (2013).
- Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
- Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
- Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
- Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
- Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
- Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).
- Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , Nara, Japan. (2018).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
- Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
- JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).
- Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
- Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).
